Produção Heteróloga de α-Amilase de Bacillus subtilis em Escherichia coli

Mestrado em Biotecnologia
Laboratórios de Engenharia de Bioprocessos

Relatório Prático

Produção Heteróloga de α-Amilase de Bacillus

subtilis em Escherichia coli

Docentes: Dra. Joana Rodrigues

Relatório realizado por:

Ana Coelho PG38286;

Angélica Córdoba PG39011;

Yolanda Leopoldo PG38569

Data de entrega

11 de junho de 2019
 Produção Heteróloga de α-Amilase de Bacillus subtilis em Escherichia coli

Sumário

Através do uso de tecnologia de DNA recombinante é possível a produção de proteínas

recombinantes, que têm atualmente várias aplicações nas indústrias farmacêutica, alimentar,
ambiental, têxtil, de produção de papel e detergentes e biocombustíveis. Exemplos destas
proteínas são as amilases, que possuem diversas aplicações, sendo uma das principais enzimas
utilizadas nas últimas décadas, principalmente em processos que envolvem a degradação do
amido.

Este trabalho experimental consistiu na inoculação e monitorização do crescimento de

bactérias E. coli transformadas com um gene codificante para a α-amilase de B. subtilis em meio
LB com 1 % de amido e meio LB sem amido. Seguidamente foi feita a rutura celular,
quantificação da proteina libertada, determinação da atividade enzimática, do pH ótimo e da
temperatura ótima de atividade. O crescimento celular foi monitorizado através da colheita de
amostras da cultura, de uma em uma hora, durante e quantificação das absorvâncias destas
amostras, que foram posteriormente convertidas em concentração celular, através de uma curva
de calibração peso seco vs absorvância. Através destas amostras foi construída uma curva de
crescimento celular em que foi possível observar o que se considerou uma fase de latência, uma
fase exponencial e o início de uma fase estacionária. Calculou-se ainda a taxa específica de
crescimento (µmáx) que foi igual a 0,49 ± 0,56 h-1 e o tempo de duplicação (td) desta cultura que
foi igual a 1,41 ±1,24 h. Após se atingir a fase estacionária foi feito a rutura das células por
sonicação, através de 35 impulsos no total e foi quantificada a proteína libertada pelo método de
Bradford que foi igual a 0,37 g/L para o meio LB+1% de amido, que foi usado nos testes
subsequentes.

Por fim foi testada a atividade enzimática da enzima produzida, testando diferentes
concentrações de substrato e verificou-se um KM igual a 48,94 e um Vmáx igual a 0,127. Foi ainda
feito um ensaio de caracterização enzimática, com o objetivo de determinar o pH e a temperatura
ótimos de atividade desta enzima e verificou-se que o pH a que esta demostrava maior atividade
era igual a 6 e a temperatura igual a 70 °C.

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Índice

Contenido
Sumário .......................................................................................................................................... i
Introdução ..................................................................................................................................... 1
Metodologia .................................................................................................................................. 6
Meio de Cultura e Inóculo ......................................................................................................... 6
Inoculação e crescimento ......................................................................................................... 7
Curva de crescimento................................................................................................................ 7
Consumo de amido ................................................................................................................... 9
Rutura celular mecânica por sonicação .................................................................................... 9
Doseamento de proteína através do método de Bradford .................................................... 10
Resultados e Discussão ............................................................................................................... 12
Cinética de crescimento de E. coli BL21 (DE3) crescida em LB e LB com amido..................... 12
................................................................................................................................................. 12
Avaliação do consumo de substrato através de um método qualitativo – Soluto de Lugol... 13
Avaliação do consumo de substrato através de um método quantiitativo – Método de iodo
................................................................................................................................................. 14
Rutura Celular por Sonicação .................................................................................................. 15
Doseamento da actividade enzimática ................................................................................... 15
................................................................................................................................................. 16
Caracterização da enzima ....................................................................................................... 16
Conclusão .................................................................................................................................... 18
Referências .................................................................................................................................. 19
Anexos ......................................................................................................................................... 21
Anexo 1.................................................................................................................................... 21
Anexo 2.................................................................................................................................... 21
Anexo 3.................................................................................................................................... 22
Anexo 4.................................................................................................................................... 22

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Introdução

Uma das principais ferramentas da Biotecnologia Molecular é a tecnologia de DNA

recombinante. Através desta ferramenta é possível a produção de proteínas recombinantes, que
têm atualmente várias aplicações nas indústrias farmacêutica, alimentar, ambiental, têxtil, de
produção de papel, detergentes e biocombustíveis (Gupta et al., 2003; Pandey et al., 2000).
Exemplos destas proteínas são as amilases, que possuem diversas aplicações, sendo uma das
principais enzimas utilizadas nas últimas décadas, principalmente em processos que envolvem a
degradação do amido. O amido é um polissacarídeo composto por dois tipos de polímeros –
amilose (20 - 25 %) e amilopectina (75 – 80 %) (de Souza e Magalhães, 2010). É um importante
constituinte da dieta humana e está presente na farinha, arroz, milho, tapioca e batatas. As enzimas
capazes de degradar o amido são utilizadas na produção de maltodextrina, amido modificado e
xaropes de glucose.

As amilases são enzimas capazes de degradar moléculas de amido em açúcares e podem

ser obtidas de plantas, animais e microrganismos. Em 1833, a amilase foi a primeira enzima a ser
precipitada e isolada por Peyo e Persoz, a qual designaram por “diastase” (Lewison, 1941). Esta
enzima foi detetada no sangue por Magendie em 1846 e quantificada pela primeira vez em animais
por Foster em 1867 (Magendie, 1846; Foster, 1866). Está presente na saliva humana e de outros
animais, participando na digestão dos alimentos. Esta é a razão pela qual os alimentos com pouco
teor de açúcar, mas com muito amido, ganham um sabor doce após mastigados (Fisher e Stein,
1961). As glândulas salivares, assim como o pâncreas, produzem amilase para degradar o amido
em polímeros de glucose para que outras enzimas os possam converter em glucose, garantindo
assim a produção de energia para o organismo (Ganong, 1995). As diferentes amílases específicas
são denominadas por letras do alfabeto grego.

As α-amilases (E.C.3.2.1.1), mais especificamente, são hidrolases que clivam ligações

glicosídicas do tipo α-1,4 presente no amido originando produtos de baixo peso molecular como
glicose, maltose e maltotriose (MacGregor, Janeček and Svensson, 2001). Existem inúmeras
aplicações industriais para as α-amilases, destacando-se a produção de xaropes de glucose e
frutose bem como a sua utilização na indústria de fermentação. Estas enzimas substituíram quase
completamente a hidrólise química do amido na indústria de processamento do amido, sendo as
enzimas provenientes de fungos e bactérias as mais utilizadas nos vários setores industriais, visto
que o crescimento destes microrganismos é mais rápido resultando numa aceleração na produção
desta enzima (Konsoula and Liakopoulou-Kyriakides, 2007). Para além disso, quando
comparados com animais e plantas, é visível que os microrganismos são fontes mais fáceis de
manusear e mais económicas, exigem menor espaço e podem ser facilmente manipulados usando

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engenharia genética, o que permite otimizar a produção de α-amilases, obtendo enzimas com
características específicas (Coronado et al., 2000). Sabe-se também, que estas enzimas requerem
a presença de iões cálcio (Ca2+) de modo a assegurarem a sua atividade, integridade estrutural e
estabilidade (Sundarram and Murthy, 2014). As α-amilases podem ser produzidas por diferentes
espécies de microrganismos, mas para aplicações com fim comercial as α-amilases são
maioritariamente derivadas do género Bacillus. A bactéria gram-positiva Bacillus subtilis é muito
utilizada para a produção em larga escala de enzimas industriais, como a α-amilase. Este
microrganismo para além de ser um dos mais bem caracterizados até hoje, apresenta ainda
vantagens como o facto de não ser patogénico, apresentar uma boa acessibilidade genética, ótimas
características de fermentação e ainda a capacidade de libertar as enzimas para o meio
extracelular, facilitando assim a sua purificação e baixando assim os custos (Harwood and
Cranenburgh, 2008).
As α-amilases estão entre as enzimas mais importantes e são de grande interesse para a
biotecnologia, constituindo uma classe de enzimas industriais correspondendo aproximadamente
a 25% do mercado mundial de enzimas (Rajagopalan and Krishnan, 2008); (Reddy, Nimmagadda
and Sambasiva Rao, 2003).
As espécies Bacillus subtilis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus licheniformis e
Bacillus amyloliquefaciens são conhecidos por serem bons produtores de α-amilase termostável.
A termoestabilidade é uma característica importante, uma vez que a liquefação enzimática e a
sacarificação do amido são realizadas a altas temperaturas (100 - 110 ° C). As enzimas
amilolíticas termostáticas estão a ser investigadas para melhorar os processos industriais de
degradação de amido e são úteis para a produção de produtos valiosos como glicose, dextrose
cristalina, xarope de dextrose, maltose e maltodextrinas (Sundarram and Murthy, 2014).
Relativamente à produção de α-amilases, os principais métodos usados são: a
fermentação submersa e a fermentação em estado sólido. O último método referido é bastante
recente, enquanto o primeiro é um método tradicional de produção de enzimas a partir de
microrganismos que já foi muito utilizado para a produção destas enzimas. A fermentação
submersa utiliza substratos como melaço e caldos. Os produtos resultantes desta fermentação são
segregados no caldo de fermentação enquanto os substratos são utilizados rapidamente, pelo que
necessitam de ser constantemente reabastecidos. Esta técnica de fermentação é adequada para
microrganismos, como bactérias, que requerem alto teor de humidade para o seu crescimento
(Sundarram and Murthy, 2014). Este método possui ainda várias vantagens face à fermentação
em estado sólido uma vez que permite uma melhor utilização de organismos geneticamente
modificados, a esterilização do meio e o processo de purificação dos produtos finais podem ser
feitas com facilidade e o controlo de parâmetros do processo como a temperatura, o pH, o
arejamento, a transferência de oxigénio e a humidade podem ser feitas convenientemente
(Kunamneni, Permaul and Singh, 2005).
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A fim de melhorar e otimizar a produção desta enzima podem ainda ser utilizados
organismos geneticamente modificados, existindo para isso vários métodos de manipulação
genética (Sundarram and Murthy, 2014). A bactéria mais utilizada para a expressão heteróloga de
genes é a Escherichia coli, visto que esta espécie possui um crescimento muito rápido (tendo um
tempo de duplicação curto) e consequente alto rendimento de produção de proteína, facilidade de
crescimento e manipulação em laboratório e disponibilidade de uma ampla gama de vetores de
clonagem e expressão, desenvolvidos para obter a máxima expressão(Frommer and Ninnemann,
2003). Para além disso o seu genoma e a sua fisiologia são bem conhecidos, estão disponíveis
múltiplas ferramentas moleculares e estabelecidos mutantes bem definidos, o que permite que se
manipule facilmente plasmídeos e que se criem transformantes de forma simples e rápida. Todos
estes fatores fazem com que esta bactéria se torne atrativa economicamente (Evans et al., 1995;
Rosano and Ceccarelli, 2014).
No entanto, esta bactéria pode não ser a mais indicada para a clonagem do gene ou
expressão da proteína desejada, visto que não possui organelos responsáveis pelos mecanismos
de modificação que originam o RNA e a consequente proteína encontrada nos organismos
eucariotas (). Adicionalmente, a proteína produzida pode estar na forma insolúvel, devido a
missfolding, agregação ou acumulação em corpos de inclusão, podendo a sobrexpressão de
algumas proteínas ser tóxica para a própria bactéria (Fakruddin et al., 2012; Frommer and
Ninnemann, 2003;). Para além disso, a sequência de codões para um aminoácido específico pode
variar de de organismo para organismo, um fenómeno denominado de “codon bias”, o que afeta
a expressão em E. coli (Fakruddin et al., 2012).
A tecnologia de DNA recombinante envolve a construção de um grande número de
moléculas semelhantes. Nesta técnica, o fragmento de DNA de interesse, ligado a uma molécula
de DNA que funciona como um vetor, pode ser replicado dentro de uma célula hospedeira
(Grafico 1). Quando a introdução desta molécula ocorre, esta é reproduzida, resultando numa
grande quantidade de moléculas que incluem o plasmídeo e o fragmento de interesse.
Normalmente, são utilizados dois tipos de vetores: plasmídeos de E. coli e bacteriófagos λ (Lodish
et al., 2013).

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Figura 1: Esquema da produção heteróloga de α-amilase de B. subtilis em E.coli

Os plasmídeos são moléculas circulares de DNA de cadeia dupla que estão separadas do
cromossoma celular, estando presentes em bactérias e leveduras. Estes podem ter desde poucos
milhares até mais de cem mil pares de bases e são responsáveis por fornecer à célula genes que
codificam para mecanismos de resistência a antibióticos, como enzimas capazes de degradar e,
portanto, inativar essas moléculas (Lodish et al., 2013).
Na tecnologia de DNA recombinante os plasmídeos mais utilizados são de E. coli e foram
desenhados com o intuito da otimização no uso na clonagem de DNA, em que, por exemplo, o
seu comprimento é reduzido, para que possua apenas as sequências nucleotídicas fundamentais
para a clonagem, como a origem de replicação, um gene de resistência a um antibiótico e uma
região de inserção de fragmentos de DNA (Lodish et al., 2013).
Normalmente inclui-se um passo de indução de expressão da proteína adicionando-se ao
meio o IPTG (Isopropil β-D-1-tiogalactopiranosídeo), que é um composto análogo à sacarose,

Figura 2: Imagem ilustrativa da indução de expressão do operão lac.

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mas não metabolizável pelas células bacterianas, que tem a capacidade de ativar a transcrição do
operão lac, permitindo a sobrexpressão do gene de interesse (Figura 2).
Ao utilizar um microrganismo geneticamente modificado, a produção do produto de
interesse pode ser libertado ou permanecer no interior das células. Quando o produto é
intracelular, é necessário recorrer a métodos que permitam romper as células e libertar
consequentemente o produto pretendido. Esta etapa possui uma influência considerável não
apenas na quantidade total da proteína de interesse a ser recuperada, mas também na sua atividade
biológica, na sua associação com outros componentes celulares e na possível presença de
degradação proteolítica e contaminantes que podem influenciar as etapas subsequentes de
purificação (Kula and Schütte, 1987). Existem inúmeros métodos de rutura celular, podendo ser
classificados em dois grupos principais: mecânicos e não mecânicos (Tabela 1). O primeiro leva
à destruição total e não especifica da parede celular dos microrganismos, enquanto que no
segundo não existe destruição havendo a permeabilização das células de um modo específico
(Geciova, Bury and Jelen, 2002).

Tabela 1: Métodos de rutura celular, mecânicos e não-mecânicos.

Métodos de rutura celular

Mecânicos • Atrito sólido (moagem por esferas de vidro e elevada pressão)
• Atrito hidrodinâmico (sonicação e microfluidificador)
Não-mecânicos • Físicos (termólise, descompressão e choque osmótico)
• Químicos (antibióticos, agentes quelantes, solventes e detergentes)
• Enzimáticos (enzimas líticas e auto-lise)

De entre os métodos mecânicos destacam-se a rutura por sonicação. A sonicação (Figura

3) consiste na aplicação de ondas sonoras, mais concretamente ultrassons, numa amostra de modo
a agitar as suas partículas, através de um sonicador. Isto pode gerar efeitos quer químicos, quer

Figura 3:Representação do efeito das ondas sonoras

(ultrassons) na rutura celular. Adaptado de EpiGentek.

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físicos. Assim, é uma técnica utilizada para diversos fins, como a produção de nanopartículas
(nanoemulsões ou lipossomas) ou a purificação de águas residuais e a extração de compostos
(Peshkovsky, Peshkovsky and Bystryak, 2013; Golmohamadi et al., 2013). Em termos de
aplicações biológicas, a sonicação é utilizada para romper membranas celulares e,
consequentemente libertar os componentes intracelulares (Zhang, Zhang and Wang, 2007).
Após a rutura celular, é necessário analisar a atividade da enzima, o que pode ser feito
através da medição dos açúcares redutores libertados como resultado da hidrólise do amido pela
α-amilase (Sundarram and Murthy, 2014). Isso pode ser feito pelo método do DNS, que consiste
na formação de um composto corado, possível de detetar por espetrofotometria, resultante da
reação entre açúcares redutores e o ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS).
Certas estirpes de E. coli, como a estirpe BL21 usada neste trabalho, não têm protéases
multiespecíficas levando à obtenção de elevados rendimentos de proteínas (Lübben ad Gasper,
2015).
Deste modo, a produção de uma proteína recombinante implica a seleção do gene de
interesse, a sua inserção num vetor de clonagem adequado e transformação no hospedeiro
selecionado (E.coli) (Rosano and Ceccarelli, 2014). Após a rutura celular pode-se separar os
diversos componentes presentes na amostra de forma a obter apenas os produtos de interesse ou
a utilização da enzima de interesse pode ser feita sem a sua purificação.
Este trabalho prático foi realizado com o objetivo de estudar a produção heteróloga de α-
amilase em E. coli. Para isso usou-se a estirpe E. coli BL21 (DE3) para expressar o gene da α-
amilase do B. subtilis. A enzima produzida foi caracterizada e foi avaliada a sua capacidade de
utilizar o amido como substrato.

Metodologia

* Os dados usados e a análise desta parte da metodologia foi feita com os dados do grupo 3.1

Meio de Cultura e Inóculo

O meio Luria-Bertani (LB) foi escolhido para avaliar o crescimento das bactérias
transformadas e o efeito do amido. Este meio consiste em peptona, triptona, extrato de levedura
e NaCl; os principais componentes são derivados de fontes biológicas complexas, como a digestão
de caseína pancreática e a porção de uma levadura (Baev et al.,2006).

Em um Erlenmeyer de 250 mL, a partir da receita comum (Miller, 1972) de 1 L (5 g de

extrato de levedura, 10 g de triptona, 10 g de NaCl), o meio foi preparado com a adição de 0,5 g
de triptona, 0,25 g de extrato de levedura e 0,5 g de NaCl, com pH ajustado de 6,95, sendo
necessário adicionar neste caso, 50 mL de água destilada. Continuamente o processo foi repetido

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para outro Erlenmeyer de 250 mL, mas desta vez com a adição de 1% de amido numa quantidade
de 0,5 g. Também é necessário preparar em outro Erlenmeyer de 500 mL, 100 mL de meio LB
para o pré-inóculo (0,5 g de extacto de levadura, 1 g de triptona, 1 g de NaCl). Finalmente, 50 mL
de meio LB com 5 g de agar são preparados, apresentando as mesmas condições mencionadas
acima para o referido volume. Todos os meios são autoclavados por 20 minutos a uma
temperatura de 121 ° C.

* Todo o procedimento descrito acima foi elaborado pelos professores e responsáveis pelo
laboratório

Inoculação e crescimento

Uma vez que o meio de cultura com agar foi autoclavado, no mesmo dia foi adicion 100
µL de canamicina e IPTG e procede-se, no interior da câmara de fluxo laminar, à inserção deste
em placas de Petri, deixando-se secar por 15 minutos e sendo armazenadas. Transferiouse
asseticamente a E. coli transformada BL21 (DE3) ao enlermeyer de 500 mL estéril para a
preparação do pré-inóculo e incubouse por 24 horas a uma temperatura de 37°C e 200 rpm. Tempo
posterior mediu-se a densidade óptica (DO) do pré-inoculo crescido a partir do dia anterior com
o fim de calcular o volume necessário para ser adicionado nos erlenmeyers com o meio restante,
para um OD de 0,1. Infelizmente, no momento da medição da densidade óptica, mesmo após a
agitação, resultou em uma concentração muito baixa e foi decidido usá-lo diretamente, sem
diluição.

Dentro da câmara de fluxo laminar, transferiu-se 2 mL do pre-inoculo, assepticamente

em cada um dos dois meios preparados restantes. Incubouse em agitação a 200 rpm e 37 ° C.

Nota: Depois de 1 hora do processo de incubação com agitação, foram removidas e

armazenadas 2 mL de amostra de ambos enlermeyers, que se referem ao T0, dos dois enlermeyers.

Também inoculou-se em 4 placas (2 para cada meio) de petri a bactéria Escherichia coli
BL21 (DE3) previamente transformada e pré-inoculada en meio LB+amido y sem amido. O
microorganismo é incubado por 24 horas a uma temperatura de 37 ° C.

Curva de crescimento

Nesta pratica foi necessário avaliar o crescimento da bactéria transformada dados os

seguintes passos com base na metodologia aplicada no protocolo "TÉCNICAS DE CULTURA
DE CÉLULAS MICROBIANAS: LEVEDURAS E FUNGOS FILAMENTOS" (das aulas de
laboratórios integrados de biotecnologia molecular):

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 Produção Heteróloga de α-Amilase de Bacillus subtilis em Escherichia coli

A partir das amostras das culturas em meio líquido de E. Coli transformada BL21 (DE3)
previamente coletadas, determinou-se a concentração de células pelo método da turbidimetria,
determinando a calibração entre a absorvância a 600 nm e o peso seco de suspensões celulares

- Montou-se o sistema de filtração e pesou-se 3 membranas estéreis dentro de uma caixa

- Retirou-se três amostras de 5 ml da cultura do pré-inoculo

- Filtrou-se individualmente cada amostra, lavando a biomassa retida no filtro com água
destilada

- Preparou-se o branco em duplicado, filtrando água destilada por cada membrana

- Colocou-se as membranas numa estufa a 80°C durante a noite

- Pesou-se as membranas depois de as deixar arrefecer num exsicador para evitar adsorção
de vapor de água e Descontou-se o peso médio dos controlos

- Foi calculado o peso seco (g/L) da cultura original

- Foi feita uma leitura preliminar no espectrofotómetro das amostras (T0) e fazer diluições
de modo a possibilitar a construção de uma curva padrão verificando-se a linearidade entre a
concentração celular e a densidade óptica a 600 nm

- Mediu-se a absorvância das várias diluições preparadas

- Foi calculado o peso seco (g/L) das diluições, com base no valor obtido para a cultura
original

- Construiu-se uma curva padrão tendo em abcissas os valores do peso seco em g/L e em
ordenadas os valores da absorvância.

A partir deste ponto, desenvolveu-se a curva de crescimento do microrganismo:

- De forma asseptica, recolhou-se 2 mL de cada cultura de 1 h em 1 h durante 7 horas,

sendo 1 mL para ler a sua absorvancia a 600nm (em triplicado) com o fim de determinar a
concentração de células (Diluir com água destilada de ser necessário). Este procedimento é
efetuado para os dois enlermeyers.

- Quando a DO600 nm atingiu os 0,4 correspondente ao T4, adicionou-se 50 µL de IPTG

aos 2 matrazes para induzir a síntese de α-amilase. Como também para cada um agrega-se 50
μL de kanamicina.

- Centrifugou-se cada um dos mililitros restantes (1 mL) das amostras durante 5 minutos
a 10000x, guardou-se e congelou-se o sobrenadante, para posterior análise.

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- Por ultimo, determinou-se o crescimento celular com a elaboração de uma curva em

função da concentração celular versus o tempo.

Uma vez terminado este procedimento, o volume restante dos meios de fermentação (LB
e LB com amido) foi dividido por 2 falcons e reservado no congelador para posterior utilização.

Consumo de amido

Avaliação qualitativa do consumo de amido utilizado o soluto de Lugol

Na experiência laboratorial pretendeu-se usar o soluto de lugol para indicar a presença de

amido. Para isto foi elaborado o soluto a partir da mistura do iodeto de potássio, cristais de iodo
e agua destilada. A partir daí, um dia após o crescimento das placas previamente feitas, entre 10
e 15 gotas do reagente Lugol foram adicionadas a cada placa e o resultado foi observado. Vale
ressaltar que um controle também foi desenvolvido em uma placa inoculada e, assim, crescer sem
a adição de IPTG.

Método amido-iodo

Preparou-se uma solução padrão a partir de 10 mL de uma solução de amido em uma

concentração de 2 g /L, para então se fez 8 diluições da solução e foi lida a concentração no
espectrofotômetro. Também preparou-se o reagente de iodo (é dada dissolvendo iodo e iodeto de
potássio em água)

- De cada amostra previamente armazenada, removeou-se 40 μL e foi misturada com 20

μL de HCL e 40 μL de água destilada em uma placa de 96 poços

- 100 μL de reagente iodo foi adicionado e deixado repousar até a solução mudar de cor.

- A absorbância a 580 nm é lida e os resultados foram usados para prepar uma linha de
calibração de acordo com os valores de concentração de amido e os valores de absorbância.

Rutura celular mecânica por sonicação

Primeiro, foi precisso recuperar as células do meio fermentativo, de modo que foi
centrifugado 10 mL da cultura em meio LB e meio LB+amido (10 min, 4000 rpm) previamente
armazenado. O pellet foi resuspendido em 6 mL com tampão de lise (20mM NaH2PO4, 0.5 M
NaCl, pH=7.4), de modo a concentrar a suspensão celular, isto foi feito duas vezes.

- Colocou-se 2,5 mL de suspensão de células bem homogeneizada (preparada com tampão

de lise) em 4 tubos de centrifuga.

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 Produção Heteróloga de α-Amilase de Bacillus subtilis em Escherichia coli

Notas: A amostra devia ser mantida fria (colocou-se os tubos em gelo) de modo a evitar
desnaturação das proteínas. Entre cada 10 impulsos, deixar arrefecer a amostra durante 60
segundos.

- Efetuou-se a rutura celular com uma potência de 200 W (output control = 5) , foram
feitos 35 impulsos de 10 em 10 impulsos com um tempo com 10 segundos entre si com 60
segundos de repaso.

- Depois da sonicação as amostras foram centrifugadas durante 5 min a 3000 rpm e foram
conservadas no gelo para usar posteriormente para doseamento de proteína e da sua atividade,
bem como a sua caracterização

*A partir deste ponto os dois conteúdos feitos dos dois grupos na metodologia foram utilizados

Doseamento de proteína através do método de Bradford

Para o conteudo centrifugado antes e depois da rutura Centrifuga foram feitas diferentes
diluições. – Para a curva padrão: Pipetou-se 0, 2, 4, 6, 10, 15 e 20 µL de uma solução padrão de
BSA (100 µg/mL) em poços devidamente assinalados de uma Microplaca de 96 poços.

- Das amostras de concentração desconhecida: Pipetou-se até 20 µl de cada diluição feita

anteriormente em poços individuais de uma Microplaca de 96 poços.

- Adicionou-se 200 µl de Reagente de Bradford em todos os poços contendo padrão ou amostra.

- Foi lida a absorvância a 595 nm

- As amostras foram medidas 2 minutos após a adição do reagente de Bradford.

* Para ler as absorbâncias de algumas metodologías, foi necessário diluir algumas amostras, estas
são mais detalhadas no ficheiro de Excel

Doseamento da atividade enzimática

Determinação de açúcares redutores pelo método de DNS

Uma amostra de 10 mL de meio LB + amido foi removida para análise da atividade

enzimática, dividida em dois tubos falcom e centrifugada a 1000 rpm por 15 minutos. Em
ependorffs de 2 mL, 1 mL de solução de amido solúvel foi preparado, em diferentes concentrações

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 Produção Heteróloga de α-Amilase de Bacillus subtilis em Escherichia coli

(5g / L 10g / L 20g / L 40g / L), em 50mM de um tampão de fosfato de potássio a um pH de 6,3
contendo 10 mM de ião cálcio. Para a solução de amido, o seguinte procedimento foi seguido:

- 100 μl de amostra correspondente ao branco da enzima foi removido

- 500 μl do lisado foram adicionados e colocados em banho-maria a 60 ° C

- Amostras de 200 μl de 3 foram removidas em 3 minutos para completar 15 minutos de

reação

Em paralelo, amostras de 100 μl retiradas das amostras que foram removidas a cada três
minutos foram coletadas e adicionadas em novos tubos ependorffs contendo 100 μl de reagente
DNS.

Os tubos foram colocados em banho-maria a 100 ° C por 5 minutos, arrefecidos e

misturados com 1 mL de água destilada.

- Em cada poço de uma microplaca ELISA, 200 µl de cada amostra foram adicionados
em triplicado e a absorbância das soluções foi lida a 540 nm.

Caracterização da enzima

Determinação do pH ótimo de atividade

Para determinar o pH ótimo a enzima usaramse diferentes tampões a 50 mM (preparados

previamente), de diferentes soluções feitas com NaHPO4 2H2O y NaHPO4 H2O, e foi testada a
enzima usando como substrato o amido, à temperatura uma temperatura de 60°C e no fim foram
quantificados os açúcares libertados pelo metodo de DNS

- Descongelou-se a amostra resultante da sonicação correspondente ao maior nível de

rutura celular.

- Foi Incubado previamente 50 μL desta amostra que contem a enzima de interesse por
60 minutos, com 50 μL de cada tampão

- Incubou-se 50 μL de uma mistura de enzima e amido numa concentração final de 1%

(p/v) durante 10 minutos com os diferentes tampões à 60°C

- Foi quantificada para cada ensaio a quantidade de açúcares pelo metodo DNS previamente
explicado.

Determinação da temperatura ótima de atividade

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 Produção Heteróloga de α-Amilase de Bacillus subtilis em Escherichia coli

Para determinar a temperatura ótima a enzima foi testada usando como substrato o amido,
testando diferentes temperatura de 70°C, 75°C, 80°C e 85°C. No fim foram quantificados os
açúcares libertados.

- Da amostra resultante da sonicação, incubaram-se tubos com 400 μL de solucion tampón

fostato NaHPO4 a pH 6 e 200 micro de amostra em baños de diferentes temperaturas durante 15
minutos.

- Uma vez decorrido este tempo, o método de quantificação pelo DNS é executado como
explicado acima.

Resultados e Discussão

Cinética de crescimento de E. coli BL21 (DE3) crescida em LB e LB com amido

Com o objectivo de caracterizar a enzima produzida e avaliar a capacidade das bactérias

de E.coli BL21 (DE3) transformadas em utilizarem o amido como substrato, procedeu-se à cultura
das mesmas em meio LB e em meio LB com junção de amido.

Para determinar a concentração celular presente em ambos os meios de cultura foi

utilizada a reta de calibração (Anexo 1) obtida pelo método de calibração da biomassa por peso
seco. A variação da concentração celular nos dois meios pode ser observada no gráfico da Figura
1.

Figura 1. Curva de crescimento de E. coli BL21 (DE3) transformada em meio LB e em meio LB com amido:
concentração celular (g/L) em função do tempo (horas

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 Produção Heteróloga de α-Amilase de Bacillus subtilis em Escherichia coli

Por observação do gráfico é possível verificar que inicialmente não há diferenças

significativas na concentração celular dos dois meios diferentes, sendo que estas começam a
existir aquando da adição de IPTG ao fim de 5 horas decorridas. A adição de IPTG aos dois meios
(LB e LB com amido) induz a expressão da enzima α-amilase, responsável pela degradação de
amido e sua conversão em açúcares redutores. No meio LB, a indução da expressão da enzima
não tem influência no consumo de substrato uma vez que não existe amido. Por sua vez, no meio
LB com amido a adição de IPTG provoca um aumento no crescimento das bactérias
transformadas visto que havendo amido poderá haver a formação de açúcares redutores que serão
utilizados pelas bactérias como fonte de carbono e energia havendo possibilidade de maior
crescimento celular, como verificado no gráfico acima (Figura 1).

Não foi realizado um controlo em que as células cresceriam sem adição de IPTG e seria
da mesma forma avaliado o seu crescimento ao longo do tempo pelo que não é possível a
comparação com os dados obtidos, porém pode-se concluir que se IPTG não for adicionado ao
meio, haverá menor expressão da enzima α-amilase, que por sua vez, não converterá tanto amido
em açúcares redutores, resultando num menor crescimento celular das bactérias transformadas.

A concentração celular máxima obtida no caso do meio LB foi de 2.139 g/L ao fim de 7
horas desde o início da experiência e no meio LB com amido de 2.180 g/L uma hora antes.

Os resultados obtidos através da linearização dos valores de concentração celular

correspondentes à fase exponencial de crescimento permitiram determinar os parâmetros
cinéticos, taxa especifica de crescimento máximo (µ máx), tempo de duplicação (td). Para o meio
LB, o valor de µ máx foi de 0.49h-1 e tempo de duplicação igual a 1.41h. Relativamente ao meio
LB com amido o valor de µ máx obtido foi de 0.56 h-1 e td igual a 1.24. sendo que os valores
obtidos são similares é possível concluir que a presença de amido no meio parece não ter impacto
significativo nos parâmetros cinéticos.

Avaliação do consumo de substrato através de um método qualitativo – Soluto de

Lugol

De modo a avaliar o consumo de amido por E.coli BL21 (DE3) foram utilizados dois
métodos, um qualitativo através da utilização da solução de lugol que é um reagente capaz de
detectar amido na medida em que aquando da reacção com o mesmo origina cor azul-escura.
Quando existe degradação do amido são visíveis halos esbranquiçados. Após crescimento das
bactérias transformadas nos meios de fermentação as mesmas foram cultivadas em placas com
meio LB, com amido, agar, canimicina e IPTG. Assim como a elaboração de um controle com

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 Produção Heteróloga de α-Amilase de Bacillus subtilis em Escherichia coli

um meio sem IPTG, todo representado na Figura 2, onde apenas três placas são mostradas em
representação dos resultados porque eram muito semelhantes entre si e não foi considerado
necessário incluir o resto das placas.

Figura 2. Fotografias tiradas das placas da metodologia Soluto de Lugol. A) Placa pertencente ao controle negativo,
preparada a partir da inoculação de uma cultura sem IPTG. B) placa de Petri com resultado positivo após inoculação
de cultura com LB + Amido + IPTG e adição de gotas de Lugol. C) Placa de cultura inoculada de uma cultura LB +
amido + IPTG e com 24 horas de crescimento, antes da adição do reagente Lugol

Como esperado, o controle elaborado apresentou ausência de quase total consumo de amido,
antes da indução da expressão da enzima com IPTG, como mostra a Figura 2A, sugerindo que
exista uma expressão basal da enzima amilase. Os resultados também relatam que para as
condições de meio LB com amido, bem como para aqueles que só possuíam o meio LB, existiam
praticamente zonas totais de consumo de amido, como mostrado na Figura 2 B

Avaliação do consumo de substrato através de um método quantiitativo – Método

de iodo

O método quantitativo utilizado foi o método do iodo que permite analisar a hidrólise do
amido ao longo do tempo. Foi utilizada a recta de calibração obtida pelo método de iodo (Anexo
2). O gráfico obtido (Figura 3) permite observar que, tal como esperado, ao longo do tempo a
concentração de amido vai diminuindo visto que existe a sua degradação e conversão em açucares
redutores tais como a glucose.

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 Produção Heteróloga de α-Amilase de Bacillus subtilis em Escherichia coli

Figura 3. gráfico de concentração de amido em função do tempo pelo método quantitativo, método de iodo

Rutura Celular por Sonicação

Para determinar se a enzima α-amilase presente nas bactérias transformadas E. coli BL21
(DE3) é intracelular ou extracelular recorreu-se ao método de Bradford para dosear a proteína.
Inicialmente através deste método realizou-se uma reta de calibração (Anexo 3).foi determinada
a concentração de proteína antes e depois da sonicação, método de rutura celular, onde foram
aplicados 35 impulsos. Os resultados obtidos não foram os esperados visto que antes da sonicação
previa-se que a quantidade de proteína encontrada fosse em quantidade perto de zero uma vez que
pela literatura se sabe que a enzima estudada é intracelular. O valor obtido para o grupo 1.1 foi
de 0,245 g/L no meio LB e 0,223 g/L no meio LB com amido. Os valores obtidos para o grupo
3.1 nas mesmas condições fora, respectivamente, 0,269 g/L e 0,274 g/L. Após a rutura celular por
sonicação seria de esperar um valor muito mais alto do que o obtido antes da mesma, no entanto
não se verificou, resultado que pode indicar que na quantificação após rutura não tenham sido
usados os sobrenadantes e houvesse presença de células no que foi avaliado. Os resultados obtidos
foram, para o grupo 1.1 com LB 0,380 g/L e 0,377 g/L LB com amido e para o grupo 1.3,
respectivamente, 0,353g/L e 0,367g/L. É de notar que não existem diferenças significativas nos
dois meios: LB e LB com amido.

Doseamento da actividade enzimática

Para avaliação da actividade da enzima α-amílase recorreu-se ao método DNS para

quantificação dos açúcares redutores. A reta de calibração utilizada encontra-se no anexo 4.
Testaram-se diferentes concentrações de substrato (amido): 5, 10, 20 e 40 g/L. No gráfico da
Figura 4 é possível observar os resultados obtidos podendo-se concluir que quanto maior a

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 Produção Heteróloga de α-Amilase de Bacillus subtilis em Escherichia coli

concentração de amido maior a concentração de açucares redutores, ou seja, verifica-se que a

actividade enzimática aumenta com o aumento de substrato. verificou-se também os parametros
da cinetica com um KM igual a 48,94 e um Vmáx igual a 0,127.

Figura 4. Medição da atividade enzimática com diferentes concentrações de substrato (amido), 5, 10, 20 e 40 g/L
obtenção das curvas de concentração de açúcares redutores em função do tempo

Caracterização da enzima

Para a caracterização da enzima quanto ao pH e temperatura óptimos que melhoram a sua

actividade foram testados diferentes pHs e diferentes temperaturas e avaliada a concentração de
açucares redutores recorrendo ao método de DNS.

Para os diferentes valores de pH 5, 6, 7 e 8 obtiveram-se os seguintes valores de concentração

de açúcares redutores: 3,88, 4,79, 3,84, 3,35 g/L, observados no gráfico da figura 4. É assim de
concluir que o pH óptimo é 6 pois permite uma maior conversão do amido pela enzima. Tendo o
valor pH óptimo para a enzima foram testadas seguidamente diferentes temperaturas: 70, 75, 80,
85 ºC (gráfico da figura 5). Os resultados obtidos para as mesmas foram, respectivamente, 9.39,
4,80, 4,33, 3,49 g/L de açúcares redutores o que indica que a temperatura melhor para esta enzima
é de 70ºC.

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 Produção Heteróloga de α-Amilase de Bacillus subtilis em Escherichia coli

Figura 5. Medição da concentração de açúcares redutores através de diferentes valores de pH

Figura 6. Medição da concentração de açúcares redutores através de diferentes valores de tamperatura

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 Produção Heteróloga de α-Amilase de Bacillus subtilis em Escherichia coli

Conclusão

Após a experiência laboratorial, é possível verificar, por um lado, no crescimento celular,

a importância da adição de IPTG para a expressão da enzima, mostrando basicamente que
enquanto a maior quantidade de amido no meio, haverá um aumento no crescimento bacteriana
para formar mais açúcares usados pelo corpo como fonte de carbono. Por outro lado, na avaliação
do consumo de substrato como visto nas duas metodologias avaliadas, é possível perceber que a
bactéria transformada consegue usar corretamente o amido que está no meio com o passar do
tempo, verificando que a transformação Foi feito corretamente. . Ao mesmo tempo, observa-se
que na análise com o reagente Lugol, por se tratar de um teste puramente qualitativo, não é
possível observar uma diferença significativa entre os testes realizados com meio LB e LB +
Amido, pois ambos representaram a coloração na maioria das zonas da placa, indicando a
presença de amido.

Embora antes e após a quebra celular, a proteína foi quantificada pelo método de Bradford
e, embora se soubesse na literatura que a enzima se revelou extracelular, não foi possível encontrar
uma grande diferença nos valores quantificados devido a problemas. técnicos na elaboração do
método, o que sugere estudos posteriores. Assim como observado na curva de crescimento,
quando há maior concentração de amido no meio, uma maior atividade enzimática pela referida
proteína também será observada.

Finalmente, após os testes para a caracterização da enzima, é possível inferir que a

temperatura em que a atividade enzimática é ótima é a 70 ° C, observando também que à medida
que a temperatura aumenta, a atividade enzimática diminui. Também é permissível raciocinar que
a um pH de 6 especificamente, é favorável para a atividade enzimática, sendo muito sensível a
mudanças no pH, por mínimas que possam ser.

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 Produção Heteróloga de α-Amilase de Bacillus subtilis em Escherichia coli

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 Produção Heteróloga de α-Amilase de Bacillus subtilis em Escherichia coli

Anexos
Anexo 1

Anexo 2

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 Produção Heteróloga de α-Amilase de Bacillus subtilis em Escherichia coli

Anexo 3

Anexo 4

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