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GRUPO 2
2002
GRUPO 2
Professor
LAVRAS
MINAS GERAIS - BRASIL
GRUPO 2
Composição do Grupo:
LAVRAS
MINAS GERAIS - BRASIL
1 INTRODUÇÃO
1
2 REFERENCIAL TEÓRICO
2
explica claramente que a intensidade da luz emitida diminui
exponencialmente com a espessura do meio absorvedor ou que qualquer camada
do meio, com uma certa espessura absorve sempre a mesma fração de luz
incidente sobre ela. Matematicamente temos:
I
T= t onde T = Transmitância; It = Luz transmitida;
Io
I0 = Luz incidente
I
A = log 0 onde A = Absorbância
It
então
1
A = log = − log T
T
Entretanto a lei de Lambert diz respeito a absorção e a transmissão da
luz de radiação monocromática em função da espessura da camada absorvedora.
Posteriormente, Beer demonstrou por meio de seus experimentos, ser possível
determinar quantitativamente concentrações diferentes entre soluções, a luz das
experiências de Lambert.
A lei de Beer:
‘a intensidade de um feixe de luz monocromática diminui
exponencialmente com a concentração da substância absorvedora’,
explica o efeito da concentração de um constituinte corado, numa
solução, sobre a transmissão ou a absorção da luz e estabelece relação entre
transmitância, concentração e a espessura da camada absorvedora.
c ∝ A
A =ε c l onde A = Absorbância;
ε = coeficiente de absorção molar;
l = comp. do percurso da luz através da amostra.
3
A união entre estas duas leis gerou a lei de Lambert-Beer em que:
1 I0
A = log = −log T = = εcl
T It
A utilização destes princípios teóricos permitem construir um gráfico
comparativo de A ou log 1/T x concentração da substância de onde obtém-se
uma reta y = ax + b onde x = concentração da substância e y = absorbância ou
transmitância. Por comparação determinam-se concentrações desconhecidas de
substâncias em soluções, de um mesmo material, medindo-se a absorbância ou
transmitância obtidas com as mesmas variáveis.
Tecnicamente, a espectrofotometria dispõem da combinação de um
fotômetro de filtro e um espectrômetro, que por meio de um sistema ótico,
provoca a dispersão da radiação incidente. A união operacional destes dois
instrumentos gerou o espectrofotômetro que permite o uso de faixas de luz
monocromáticas que podem variar continuamente. Assim, são gerados sinais
correspondentes à diferença entre as radiações transmitidas por soluções
tomadas como referência e as radiações transmitidas pelas amostras analisadas,
num determinado comprimento de onda. Esses aparelhos podem ser constituídos
de feixe simples ou duplo. Os primeiros operam, em geral, com maior exatidão
(aproximadamente 0,2 %) quando contém um circuito zero para a medida da
transmitância o que implica em um sinal do amplificador que é
contrabalanceado com um sinal elétrico conhecido. Nos espectrofotômetros de
feixe duplo, um feixe dá o sinal de referência e o outro, o sinal de medida, e
então são comparados continuamente várias vezes por segundo. Assim,
respostas do detector, flutuações na intensidade da fonte e ganho do
amplificador são compensados.
4
Diferentes reações colorimétricas podem ser utilizadas para o
desenvolvimento de complexos corados e sua escolha depende do tipo de
molécula a ser analisada ou seja sua reatividade, e o tipo de instrumentação de
leitura. Dentre elas podem-se citar:
Quantificação de Proteínas
- Método do Biureto: baseia-se no doseamento de complexos de cor
púrpura formados em soluções alcalinas pela complexação de Cu2+ com duas ou
mais ligações peptídicas (Figura 1). Embora altamente específico para peptídios
e proteínas, este método está sujeito a interferências por parte de compostos
presentes nas amostras que interagem com Cu2+ (por exemplo açúcares redutores
e grupamentos amídicos) além de apresentar baixa sensibilidade.
O C C O
NH NH
R CH CH R
+2
Cu
O C C O
NH NH
R CH CH R
5
fosfomolibdato-fosfotungstato a ácido fosfomolibdotúngtico provocada pelos
redutores tirosina e triptofano presentes nas proteínas em níveis mais
constantes. Esta reação resulta em coloração azul. A vantagem desta reação
reside em poder trabalhar tanto com amostras sólidas ou em soluções.
Quantificação aminoácidos
- Reação da ninidrina (Schriner, 1983), : baseia-se na desaminação
oxidativa dos aminoácidos liberando amônia e reduzindo a ninidrina a
hidrindantina que posteriormente forma um complexo azul com a amônia
liberada (Figura 2).
O O
NH3
R
OH O
N
+ R
OH O
O
O O HO
O O
R
H2O
N NH2 + RCHO + CO2
O
O HO O
O O
OH
NH2 +
OH
O O
O O
NH
O O
6
- Outros métodos estão relacionados na Tabela a seguir.
Quantificação de açúcares:
- Reação de Molish: indicada para açucares solúveis totais. Baseia-se na
hidrólise ácida das ligações glicosídicas resultando em hidroximetilfurfural e
furfural, que se complexam com o α -naftol resultando em um complexo corado
(Figura 3).
OH OH
Açúcar
R CHO
H2SO4
O
α-naftol Hidroxifurfural CH
Complexo corado R
7
- Reação de antrona: a reação tem o mesmo princípio que a anterior
porém o reagente utilizado é a antrona resultando na formação de um complexo
corado de coloração verde (Figura 4).
O CHO
Açúcar
+ R CHO
H2SO4
O
Antrona Antronal
Hidroxifurfural
O
CH
Complexo corado
R
8
COOH COOH
OH OH
Açúcar redutor
9
corresponde a 6,25 mg de proteína, é possível calcular a quantidade de
proteína presente.
10
3 MATERIAL E MÉTODOS
12
3.2.2 Obtenção da curva padrão
13
3.3.2 Obtenção da curva padrão
14
mL dessa solução, transferiu-se para um balão volumétrico e completou-se o
volume para 100 mL com metilcelosolve.
Etanol 60 % (v/v) (V = 100 mL)
Mediu-se 63,1 mL de etanol 95%, transferiu-se para um balão
volumétrico e completou-se para 100 mL com água destilada.
Solução de Glicina 0,1 µ g /mL (V = 25 mL)
A solução encontrava-se recém preparada não justificando a realização
de nova preparação.
15
3.5 Representação do gráfico de dispersão
16
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
0,8
Y = 0,0111 + 0,01066 X
r ² = 0,9582
0,6
Abs 620 (nm)
0,4
0,2
0,0
0 6 12 24 36 48 60
0,8
Y = -0,02733 + 0,12076 X
r ² = 0,9790
0,6
Abs 540 (nm)
0,4
0,2
0,0
0 2 4 6
-1
Açúcares redutores
Açúcares (µ g ml
Redutores )
(µM)
18
4.3 Construção de curva padrão para proteínas – Método Bradford
1,2
Y = 0,0344 + 0,00913 X
r ² = 0,9637
Abs 595 (nm)
0,8
0,4
0,0
0 20 40 60 80 100
-1
Proteína (µ g(µg
Proteína mL0,1
) mL-1)
19
4.4 Construção de curva padrão para aminoácidos – Método da
ninidrina
1,2
Y = 0,0153 + 0,9792 X
1,0 r ² = 0,98
Abs 570 (nm)
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
Aminoácidos mL-1)
(µ g (µmol)
Aminoácidos
20
As equações de ajustes encontradas para os teores das biomoléculas
foram lineares (y = ax + b) e seus valores de R2 denotam boa correlação entre a
taxa de absorbância e as concentrações das soluções sendo que apenas para a
equação dos açúcares redutores (Figura 7) encontrou-se valor negativo na
intercessão da reta no eixo y (y = -0,02733 + 0,12076x). Uma maior variação
nas repetições, provavelmente, causou esta diferença na tendência da reta.
Maiores variações de desvio padrão, foram observados em todos os gráficos no
ponto de maior concentração da biomolécula.
Os pequenos desvios de R2 podem ser conseqüências dos desvios da lei
de Beer (Jeffery et al, 1992) que inferem:
Quantidades de eletrólitos maiores do que exigido para a reação
provocariam um deslocamento no máximo de absorção assim como
alteram o valor do coeficiente de absorção molar;
• O Soluto corado pode ionizar-se, ou dissociar-se, ou associar-se em
solução variando a concentração;
• A formação de complexos cuja composição depende da
concentração.
É importante notar que a linearidade constatada na lei de Lambert-Beer
se restringe a zonas de aplicabilidade características de cada método para as
condições experimentais utilizadas. Efetivamente, em concentrações de amostra
excessivamente reduzidas ou elevadas, poderão ocorrer erros originados,
respectivamente, pela falta de sensibilidade do método, ou pela acentuação da
turbidez das soluções devido à polimerização inespecífica de moléculas em
solução.
Fatores aliados às condições de trabalho do experimento colaboraram
para as inúmeras dificuldades encontradas pelo grupo principalmente em
questão de padronização e reprodutibilidade dos métodos. A má conservação
dos reagentes (prazo de validade, umidade, luz, contaminação) e vidrarias de
21
precisão (provetas, pipetas graduadas e automáticas, balões volumétricos)
observadas, podem ter aumentado as fontes de erro já que as análises são feitas
em microescala. Qualquer erro, seja na pipetagem ou na pesagem dos reagentes
ou ainda na composição química destes, poderia provocar alterações na resposta
final das curvas pois alteraria a constante de equilíbrio (Keq) para a formação do
complexo corado e, consequentemente a absorção da luz.
22
5 CONCLUSÕES
24
QUESTIONÁRIO 1
Preparo de soluções e reagentes para análise Bioquímica
25
3) Explique o princípio do desenvolvimento de cor resultante da reação do(s)
reagente(s) específico(s) utilizados para os métodos de determinação de
aminoácidos, proteínas, açucares redutores e totais. Mostre as reações.
Relatório, capítulo 2.
1,5 mg 100 g
x = 15 mg /1000 g =15 mg / Kg = 15 ppm
x 1000 g
26
b) 22,3 mg/L
1 ppm mg/Kg (em p/p)
1 ppm mg/L (em p/v)
portanto 22,3 mg/L = 22,3 ppm
c) 40 mg/100 mL
1 ppm mg/L (em p/v)
40 mg
= 400 mg / L
0,1 L
d) 125 g/ 5 L;
125 = 25g /L
5
1 mg 0,001g
x 25 g
x = 25000 mg/L
x = 25000 ppm
e) 0,025%;
1 ppm mg/Kg (em p/p)
1 mg 0,001g
x 0,025 g
x = 25 mg /100 g
x = 25 mg / 0,1 Kg
x = 250 mg / Kg
x = 250 ppm
27
f) 1000ppb;
1 ppb µg/Kg ng/mg
1 ppm mg/Kg
1 µg 10-3 mg
x = 1 ppm
g) 312 mg/ L;
1 ppm mg/Kg (em p/p)
1 ppm mg/L (em p/v)
portanto 312 mg/L = 312 ppm
h) 312 g/m3;
3
312 g 312 x10 mg
3
= 3
= 312 mg / L
10 L 10 L
1 ppm mg/L (em p/v)
x = 312 ppm
i) 3 g/T;
1 ppm mg/Kg (em p/p)
1 ppm 0,001 g / 0,001 T
3 g/T = 3 ppm
j) 5 mg/ mL;
1 ppm mg/L (em p/v)
5 mg 0,001L
x = 5000 mg/L = 5000 ppm
28
k) 0,07 g/1000 mL;
1 ppm mg/L (em p/v)
1g 1000 mg
0,07 g x
x = 70 mg/L = 70 ppm
132 mg 32 mg de S 132 mg 64 mg de O
5 mg x 5 mg x
x = 1,21 mg de S x = 2,43 mg de O
x = 1,21 ppm de S x = 2,43 ppm de O
120 mg 31 mg de P 120 mg 64 mg de O
10 mg x 10 mg x
x = 2,58 mg de P x = 5,34 mg de O
x = 2,58 ppm de P x = 5,34 ppm de O
29
8) Uma solução de KNO3 tem 140 ppm de N. Quantos ppm tem de K?
39 g de K 14 g de N
x 0,140 g de N
x = 0,39 g de K = 390 mg /L
x = 390 ppm
994 1L
x 10 L
Kps K2SO4 = 1 M
+ 2-
K2SO4 2K + SO4 K+
-Kps 2x = 1
x 2x x x = 0,5 M
2-
1 1 1 SO4 = 1
m
M= = 0,5 .1 .71 = 48 g7d Ke2S 4Oe 1mL d se o l u ç ã o
P xMV
11) Preparar 1 litro de solução que contenha 195 ppm de K e tendo como
solução estoque KNO3 1 M.
30
1M 101 g de KNO3 39 g de K
x x 0,195 g de K
x = 0,505 g de KNO3 = 0,505 g /L = 0,505 M
M V = M' V'
1 V = 0,505 x 1
V = 0,505 L = 505 mL de KNO3 1M
onde
eq g = equivalente-grama;
N º ionizáveis = Ácido = nº de H+ ionizáveis
Base = nº de OH- ionizáveis
Sal = nº do elemento de maior Nox
31
Então, molaridade pode também ser definida por:
m
M =
PM x V
1mL soluto
1ppm (v/v) = expressa em mg L-1
10 6 mL solução
1g soluto
1ppm (p/v) = 6 expressa em mg L-1 ou mg mL-1
10 mL solução
32
13) Como são divididos quimicamente os aminoácidos?
Os aminoácidos são divididos em quatro grupos de acordo com a polaridade do
seus grupamento R lateral. São eles:
Aminoácidos com R = grupos apolares (hidrofóbicos)
H O H O
O N C C N C C
H
H O
N C C H CH2 H CH
N C C H3C CH2
H CH CH
H CH3 H3C CH3 H3C CH3 CH3
H O H O H O H O
N C C N C C N C C N C C
33
Aminoácidos com R = grupos polares neutros (hidrofílicos)
H O
O N C C
H
H O H O
N C C H CH2
N C C N C C
H CH2 CH2
H CH2 H CH CH3
C C
O NH2 O NH2 OH OH
H O O
H
N C C N C C
H O
H CH2 H CH2
N C C
SH
H H
34
H O
H O N C C
N C C H CH2
H CH2 CH2
C C
O O O O
H O H O
N C C N C C
H O
H CH2 H CH2
N C C
CH2 CH2
CH2 CH2 H
C
HN CH
CH2 C
H2N NH2 HC NH
NH3
35
SUMÁRIO
1
1 introdução.......................................................................................................................1
2 referencial teórico...........................................................................................................2
3 material e métodos........................................................................................................11
3.1Construção de curva padrão de açúcares solúveis totais – Método Antrona..11
3.1.1 Preparo dos reagentes.....................................................................................11
3.1.2Obtenção da curva padrão................................................................................11
3.2 Construção da curva padrão de açúcares redutores – Método DNS............12
3.2.1 Preparo dos reagentes.....................................................................................12
3.2.2 Obtenção da curva padrão........................................................................13
3.3 Construção de curva padrão para proteínas – Método Bradford.................13
3.3.1 Preparo do reagente .......................................................................................13
3.3.2Obtenção da curva padrão................................................................................14
3.4 Construção de curva padrão de α -aminoácidos – Método da ninhidrina....14
3.4.1 Preparo dos reagentes.....................................................................................14
3.4.2Obtenção da curva padrão................................................................................15
3.5 Representação do gráfico de dispersão.......................................................16
4 resultados e discussão...................................................................................................17
4.1Construção de curva padrão de açúcares solúveis totais – Método Antrona..17
4.2 Construção da curva padrão de açúcares redutores – Método DNS............18
4.3Construção de curva padrão para proteínas – Método Bradford....................19
4.4 Construção de curva padrão para aminoácidos – Método da ninidrina.........20
4.5 Gráficos de dispersão.................................................................................20
5 Conclusões....................................................................................................................23
ReferênciaS bibliográficaS...............................................................................................24
ANEXO - QUESTIONÁRIO.............................................................................24