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OBTENÇÃO DE CURVAS PADRÃO PARA

AÇÚCARES REDUTORES, AÇÚCARES SOLÚVEIS


TOTAIS, PROTEÍNAS E AMINOÁCIDOS

GRUPO 2

2002
GRUPO 2

OBTENÇÃO DE CURVAS PADRÃO PARA AÇÚCARES


REDUTORES, AÇÚCARES SOLÚVEIS TOTAIS,
PROTEÍNAS E AMINOÁCIDOS

1º Relatório apresentado a disciplina


Laboratório de Bioquímica de Plantas como
parte das exigências do curso de
Agronomia/Fisiologia vegetal em nível de
Mestrado.

Professor

Luiz Edson Mota de Oliveira

LAVRAS
MINAS GERAIS - BRASIL
GRUPO 2

OBTENÇÃO DE CURVAS PADRÃO PARA AÇÚCARES


REDUTORES, AÇÚCARES SOLÚVEIS TOTAIS,
PROTEÍNAS E AMINOÁCIDOS

1º Relatório apresentado a disciplina


Laboratório de Bioquímica de Plantas
como parte das exigências do curso de
Agronomia/Fisiologia Vegetal em nível
de Mestrado

Composição do Grupo:

Andrea Yu Kwan Villar Shan Ms/Agroquímica

Cristiano Martinotto Agrônomo

Inês Angélica Cordeiro Gomes Bióloga

Teresa Cristina L. L. de Sá e M. Marques Ms/Fitotecnia

Luiz Edson Mota de Oliveira


(Professor da Disciplina)

LAVRAS
MINAS GERAIS - BRASIL
1 INTRODUÇÃO

A análise química de uma amostra é em primeira ordem qualitativa. Uma


vez identificada a natureza de seus constituintes ou parte deles, faz-se necessário
sua determinação quantitativa, que dispõem atualmente de diversas técnicas as
quais dependem da natureza da informação que se busca, da amostra disponível
e relativa proporção do componente a ser determinado.
Um método extremamente empregado em determinações quantitativas
de biomoléculas (açúcares, proteínas e ácidos nucleicos) é a colorimetria que
consiste basicamente na comparação, em condições bem definidas, entre a cor
provocada pela substância presente em quantidade desconhecida numa amostra,
com a mesma cor provocada por uma quantidade conhecida do material, num
padrão.
Entre os métodos colorimétricos, a espectrofotometria tomou proporções
gigantescas no que diz respeito a sua utilização pois é um método de
comparação sensível, rápido e cujos resultados apresentam-se com maior
exatidão. Seu princípio baseia-se na comparação de sinais gerados pela diferença
entre as radiações transmitidas por soluções tomadas como referência e as
radiações transmitidas pelas amostras analisadas, num determinado
comprimento de onda, emitido pelo aparelho (espectrofotômetro), e que é
característico da absorção do composto que se quer identificar. Dessa forma,
pode-se construir curvas padrões cujas equações de regressão são utilizadas para
a quantificação dos compostos em amostras desconhecidas.

1
2 REFERENCIAL TEÓRICO

A colorimetria relaciona-se com a comparação entre a variação de cor


decorrente da mudança de concentração de determinado componente numa
solução, provocada pela formação de um complexo corado por meio da adição
de um reagente apropriado a esse sistema.
As variações entre as análises colorimétricas originam-se da utilização
de um dos seis diferentes métodos de comparação quantitativa (Série padrão,
Duplicação, Diluição, Balanceamento, Fotômetro Fotoelétrico) ou por mais de
um deles em combinação.
A espectrofotometria é o método comparativo mais utilizado por
apresentar maior sensibilidade e exatidão de resultados. Fundamenta-se nos
princípios teóricos da lei de Lambert-Beer as quais explicam a absorção da luz
em função da espessura do meio e relaciona-na com a absorbância ou
transmitância dos eletrólitos presentes no meio reacional. De fato, esta lei foi
gerada pela fusão de duas leis pré-concebidas e complementares, fundamentadas
nos experimentos de dois pesquisadores e sua tradução matemática implica na
definição de dois parâmetros: a Absorbância (A) referida também como
densidade óptica, e a Transmitância (T).
A porcentagem de radiação que atravessa uma solução homogênea é
designada por transmitância. Contudo, os resultados espectrofotométricos são
expressos geralmente em absorbâncias (A). Este parâmetro, segundo a lei de
Beer-Lambert, apresenta sobre a transmitância a vantagem de variar linearmente
com a concentração das amostras.
A lei de Lambert :
‘...quando uma luz monocromática passa através de um meio
transparente, a taxa de diminuição da intensidade com a espessura do meio é
proporcional à intensidade da luz’,

2
explica claramente que a intensidade da luz emitida diminui
exponencialmente com a espessura do meio absorvedor ou que qualquer camada
do meio, com uma certa espessura absorve sempre a mesma fração de luz
incidente sobre ela. Matematicamente temos:
I
T= t onde T = Transmitância; It = Luz transmitida;
Io
I0 = Luz incidente
I
A = log 0 onde A = Absorbância
It
então
1
A = log = − log T
T
Entretanto a lei de Lambert diz respeito a absorção e a transmissão da
luz de radiação monocromática em função da espessura da camada absorvedora.
Posteriormente, Beer demonstrou por meio de seus experimentos, ser possível
determinar quantitativamente concentrações diferentes entre soluções, a luz das
experiências de Lambert.
A lei de Beer:
‘a intensidade de um feixe de luz monocromática diminui
exponencialmente com a concentração da substância absorvedora’,
explica o efeito da concentração de um constituinte corado, numa
solução, sobre a transmissão ou a absorção da luz e estabelece relação entre
transmitância, concentração e a espessura da camada absorvedora.
c ∝ A
A =ε c l onde A = Absorbância;
ε = coeficiente de absorção molar;
l = comp. do percurso da luz através da amostra.

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A união entre estas duas leis gerou a lei de Lambert-Beer em que:

1 I0
A = log = −log T = = εcl
T It
A utilização destes princípios teóricos permitem construir um gráfico
comparativo de A ou log 1/T x concentração da substância de onde obtém-se
uma reta y = ax + b onde x = concentração da substância e y = absorbância ou
transmitância. Por comparação determinam-se concentrações desconhecidas de
substâncias em soluções, de um mesmo material, medindo-se a absorbância ou
transmitância obtidas com as mesmas variáveis.
Tecnicamente, a espectrofotometria dispõem da combinação de um
fotômetro de filtro e um espectrômetro, que por meio de um sistema ótico,
provoca a dispersão da radiação incidente. A união operacional destes dois
instrumentos gerou o espectrofotômetro que permite o uso de faixas de luz
monocromáticas que podem variar continuamente. Assim, são gerados sinais
correspondentes à diferença entre as radiações transmitidas por soluções
tomadas como referência e as radiações transmitidas pelas amostras analisadas,
num determinado comprimento de onda. Esses aparelhos podem ser constituídos
de feixe simples ou duplo. Os primeiros operam, em geral, com maior exatidão
(aproximadamente 0,2 %) quando contém um circuito zero para a medida da
transmitância o que implica em um sinal do amplificador que é
contrabalanceado com um sinal elétrico conhecido. Nos espectrofotômetros de
feixe duplo, um feixe dá o sinal de referência e o outro, o sinal de medida, e
então são comparados continuamente várias vezes por segundo. Assim,
respostas do detector, flutuações na intensidade da fonte e ganho do
amplificador são compensados.

4
Diferentes reações colorimétricas podem ser utilizadas para o
desenvolvimento de complexos corados e sua escolha depende do tipo de
molécula a ser analisada ou seja sua reatividade, e o tipo de instrumentação de
leitura. Dentre elas podem-se citar:
 Quantificação de Proteínas
- Método do Biureto: baseia-se no doseamento de complexos de cor
púrpura formados em soluções alcalinas pela complexação de Cu2+ com duas ou
mais ligações peptídicas (Figura 1). Embora altamente específico para peptídios
e proteínas, este método está sujeito a interferências por parte de compostos
presentes nas amostras que interagem com Cu2+ (por exemplo açúcares redutores
e grupamentos amídicos) além de apresentar baixa sensibilidade.

O C C O
NH NH

R CH CH R
+2
Cu
O C C O
NH NH

R CH CH R

Figura 1: Complexo corado pelo método do biureto.

- Método de Bradford (Bradford, 1977): é o mais comumente utilizado


pelo fato do Comassie Blue exibir um máximo de absorção de radiações com o
comprimento de onda de 595 nm, quando complexado com proteínas e baixa
sensibilidade a interferências por parte de compostos de natureza não proteica.
- Reação de Folin-Ciocalteau (método de Lowry) (Lowry et al, 1951):
baseia-se na complexação da proteína com o cobre alcalino e a redução do

5
fosfomolibdato-fosfotungstato a ácido fosfomolibdotúngtico provocada pelos
redutores tirosina e triptofano presentes nas proteínas em níveis mais
constantes. Esta reação resulta em coloração azul. A vantagem desta reação
reside em poder trabalhar tanto com amostras sólidas ou em soluções.
 Quantificação aminoácidos
- Reação da ninidrina (Schriner, 1983), : baseia-se na desaminação
oxidativa dos aminoácidos liberando amônia e reduzindo a ninidrina a
hidrindantina que posteriormente forma um complexo azul com a amônia
liberada (Figura 2).

O O
NH3
R
OH O
N
+ R
OH O
O
O O HO

O O

R
H2O
N NH2 + RCHO + CO2
O
O HO O

O O

OH
NH2 +
OH

O O

O O

NH

O O

Figura 2: Reação de ninidrina.

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- Outros métodos estão relacionados na Tabela a seguir.

Tabela 1: Ensaios químicos para aminoácidos específicos.

Aas Reação Reagentes Cor


Arg Sakaguchi α -naftol + hipoclorito de sódio Vermelho
Cys Nitroprussiato Nitroprussiato de sódio em amônia diluída Vermelho
4-sulfonato de sódio + 1,2- naftoquinona +
Cys Sullivan Vermelho
hidrosulfito de sódio
Hisr Pauly Ácido sulfanílico em solução alcalina Vermelho
Trp Ehrich p-dimetilaminobenzaldeído + HCl conc Azul
trp Kopkins-Cole Ácido glioxílico + H2SO4 Púrpura
Tyr Millon HgNO3 + HNO3 com traços de HNO2 Vermelho
Fonte: Schriner, 1983.

 Quantificação de açúcares:
- Reação de Molish: indicada para açucares solúveis totais. Baseia-se na
hidrólise ácida das ligações glicosídicas resultando em hidroximetilfurfural e
furfural, que se complexam com o α -naftol resultando em um complexo corado
(Figura 3).

OH OH

Açúcar
R CHO
H2SO4

O
α-naftol Hidroxifurfural CH

Complexo corado R

Figura 3: Reação de Molish.

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- Reação de antrona: a reação tem o mesmo princípio que a anterior
porém o reagente utilizado é a antrona resultando na formação de um complexo
corado de coloração verde (Figura 4).

O CHO

Açúcar
+ R CHO
H2SO4
O
Antrona Antronal
Hidroxifurfural
O

CH

Complexo corado
R

Figura 4: Reação de antrona.

- Reação com DNS: indicada para açúcares redutores. Baseia-se na


redução do ácido 3,5-dinitrosalicílico a ácido 3-amino-5nitrosalicílico resultando
em um complexo de coloração laranja (Figura 5).

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COOH COOH
OH OH
Açúcar redutor

O2N NO2 O2N NH3

Ác. 3,5-dinitrosalicílico Ác. 3-amino-5-salicílico

Figura 5: Reação com DNS.

- Reação de Somogy –Nelson: indicada para açúcares redutores. Baseia-


se na redução de cobre em meio alcalino pelo açúcar, resultando em óxido
cuproso (Cu2O). Esse composto formado é então oxidado em presença de ácido
arsenomolibdênio que passa a ácido arsenomolibdoso, um complexo de
coloração azul.
Além das reações colorimétricas/espectrofotométricas utilizadas para
quantificação de biomoléculas, outros métodos quantitativos podem ser citados
tais como:
 Açúcares: - Periodato (IO4-): o método baseia-se na
redução do periodato pelos açúcares e posterior titulação do I2
formado, por NaS2O3. O conteúdo de açúcares é doseado pelo Nº eq de
I2.
 Proteínas: - Método Kjeldahl: baseia-se na digestão da
amostra com H2SO4 concentrado em presença de um catalisador, sob
condições onde compostos de nitrogênio são convertidos a (NH4)2SO4.
Por destilação a vapor ou microdifusão na presença de uma base forte,
a amônia é liberada sendo captada novamente em um sistema
titulométrico que doseia a amônia formada. Pelo fato de todas as
proteínas conterem 16% de N em sua composição, isto é 1 mg de N

9
corresponde a 6,25 mg de proteína, é possível calcular a quantidade de
proteína presente.

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3 MATERIAL E MÉTODOS

Os experimentos foram conduzidos no Laboratório de Bioquímica de


Plantas do Departamento de Biologia/ Setor Fisiologia Vegetal da Universidade
federal de Lavras.
Na construção das curvas-padrão, foi utilizada: a espectrofometria, cujas
absorbâncias foram obtidas em espectrofotômetro de feixe simples Beckman
DU 640 B.
Os experimentos foram conduzidos em 2 repetições/curva padrão/cada
membro da equipe.

3.1 Construção de curva padrão de açúcares solúveis totais –


Método Antrona

3.1.1 Preparo dos reagentes

 Solução de glicose 60 µ g / mL (V = 100 mL).


Pesou-se 0,006 g de glicose (C6H12O6), adicionou-se aproximadamente
30 mL de água e completou-se o volume para 100 mL.
 Reagente antrona (V =126 mL)
Pesou-se 0,24 g de antrona, adicionou-se 6 mL de água destilada e
posteriormente, 120 mL de ácido sulfúrico concentrado (H2SO4) vagarosamente.

3.1.2 Obtenção da curva padrão

Adicionaram-se alíquotas de água destilada, glicose e antrona a sete


tubos de ensaio mantidos em banho de gelo conforme Tabela 2. Após, os tubos
foram agitados em vórtex e levados ao banho-maria à 100 ºC durante 3 minutos.
Os tubos foram resfriados em banho de gelo e levados para leitura em
espectrofotômetro ( λ = 620 nm).

Tabela 2: Alíquotas de reagentes requeridos para o meio reacional.


Glicose (60 µ g / mL) Água Antrona
Tubos
(mL)
1 0,0 1,0 2,0
2 0,1 0,9 2,0
3 0,2 0,8 2,0
4 0,4 0,6 2,0
5 0,6 0,4 2,0
6 0,8 0,2 2,0
7 1,0 0,0 2,0

3.2 Construção da curva padrão de açúcares redutores – Método


DNS

3.2.1 Preparo dos reagentes

 Preparo da solução de glicose 10 µ g / mL (V = 10 mL).


Preparou-se uma solução de glicose 1M (0,01 g para 10 mL). Retirou-se
uma alíquota de 0,1 mL e diluiu-se para 10 mL.
 Preparo do reagente DNS (ácido dinitrosalicílico) (V =
50 mL)
Dissolveu-se 15 g de Tartarato duplo de sódio e potássio (sal de Rochelle
- C4H2O6K+Na+) em 25 mL de água destilada. Levou-se ao aquecimento com
agitação constante até completa dissolução. Posteriormente, foram misturados a
solução de Rochelle recém preparada, 0,5 g de DNS e 10 mL de hidróxido de
sódio (NaOH) 2N e o volume foi completado para 50 mL.

12
3.2.2 Obtenção da curva padrão

Adicionaram-se alíquotas de água destilada, glicose e DNS a quatro


tubos de ensaio conforme Tabela 3. Os tubos foram agitados em vórtex e
levados ao banho-maria à 100 ºC durante 5 minutos. Após, foram resfriados à
temperatura ambiente, completados até 10 mL e levados para leitura em
espectrofotômetro ( λ = 540 nm).

Tabela 3: Alíquotas de reagentes requeridos para o meio reacional.


Glicose (10 µ g / mL) Água DNS
Tubos
(mL)
1 0,0 1,5 1,0
2 0,2 1,3 1,0
3 0,4 1,1 1,0
4 0,6 0,9 1,0

3.3 Construção de curva padrão para proteínas – Método Bradford

3.3.1 Preparo do reagente

 Comassie Blue G-250 (V = 1L)


Dissolveu-se 0,1g de Comassie Blue G-250 em 50 mL de etanol 95%.
Adicionou-se 100 mL de ácido fosfórico (H3PO4) 85% e completou-se o volume
para 1L com água destilada. Deixou-se em agitação constante por 12 horas em
overnight.
 Solução de BSA (Soro albumina bovina) 100 µ g / mL
Solução encontrava-se recém preparada não justificando a realização de
nova preparação.

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3.3.2 Obtenção da curva padrão

Adicionaram-se alíquotas de água destilada, BSA e Comassie blue G-


250 a seis tubos de ensaio conforme Tabela 4. Após, os tubos foram agitados em
vórtex e levados para leitura em espectrofotômetro ( λ = 595 nm).

Tabela 4: Alíquotas de reagentes requeridos para o meio reacional.


BSA (100 µ g / mL) Água Comassie Blue G-250
Tubos
(mL)
1 0,0 0,10 5,0
2 0,02 0,08 5,0
3 0,04 0,06 5,0
4 0,06 0,04 5,0
5 0,08 0,02 5,0
6 0,10 0,00 5,0

3.4 Construção de curva padrão de α -aminoácidos – Método da


ninhidrina

3.4.1 Preparo dos reagentes

 Reagente A: Tampão citrato de sódio 0,2M – pH = 5,0


(V = 25 mL)
Solução tampão encontrava-se recém preparada não justificando a
realização de nova preparação.
 Reagente B: Ninhidrina 5 % em metilcelosolve (V = 10
mL)
Pesou-se 0,5 g de ninhidrina e completou-se o volume para 10 mL com
metil celosolve (etileno glicol monoetil éter).
 Reagente C: Solução de KCN 2 % em metilcelosolve
(V = 100 mL) a partir de KCN 0,01M
Pesou-se 0,065 g de Cianeto de potássio (KCN), dissolveu-se em água
destilada e completou-se o volume para 100 mL. Retirou-se uma alíquota de 2

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mL dessa solução, transferiu-se para um balão volumétrico e completou-se o
volume para 100 mL com metilcelosolve.
 Etanol 60 % (v/v) (V = 100 mL)
Mediu-se 63,1 mL de etanol 95%, transferiu-se para um balão
volumétrico e completou-se para 100 mL com água destilada.
 Solução de Glicina 0,1 µ g /mL (V = 25 mL)
A solução encontrava-se recém preparada não justificando a realização
de nova preparação.

3.4.2 Obtenção da curva padrão

Adicionaram-se alíquotas de água destilada, glicina e reagentes A + B +


C (previamente misturados) a seis tubos de ensaio conforme Tabela 5. Após, os
tubos foram agitados em vortex e levados ao banho-maria à 100 ºC durante 20
minutos. Após o resfriamento à temperatura ambiente, adicionaram-se aos tubos,
alíquotas de etanol e agitaram-se novamente. Os tubos foram levados para
leitura em espectrofotômetro ( λ = 570 nm).

Tabela 5: Alíquotas de reagentes requeridos para o meio reacional.


Glicina (µ g /mL) Água Reagentes A+B+C Etanol 60 %
Tubos
(mL)
1 0,0 1,0 1,7 1,3
2 0,2 0,8 1,7 1,3
3 0,4 0,6 1,7 1,3
4 0,6 0,4 1,7 1,3
5 0,8 0,2 1,7 1,3
6 1,0 0,0 1,7 1,3
A = 0,5 mL; B = 0,2 mL; C = 1,0 mL.

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3.5 Representação do gráfico de dispersão

Os gráficos de dispersão, foram construídos por meio das leituras de


absorbância, onde os pontos em cada concentração correspondem a média de
todos os componentes. Aplicou-se a regressão linear, cuja fórmula y = ax + b
servirá para determinar a concentração das substâncias extraídas de um tecido
vegetal, sendo y o valor da absorbância e x a concentração da biomolécula a ser
determinada.

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4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 Construção de curva padrão de açúcares solúveis totais – Método


Antrona

Tabela 6: Valor de absorbância de açúcares solúveis totais (Abs620 nm) de cada


repetição.
ANDREA CRISTIANO INÊS TERESA
Tubo Média
R1 R2 R1 R2 R1 R2 R1 R2
01 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,000 0,0000 0,0000
02 0,1201 0,1342 0,0791 0,0532 0,1047 0,0930 0,0523 0,0590 0,0870
03 0,1783 0,1752 0,1234 0,1189 0,1412 0,1434 0,1073 0,1217 0,1387
04 0,2236 0,2301 0,2832 0,3222 0,3467 0,2768 0,2406 0,2591 0,2728
05 0,3023 0,3061 0,4162 0,4259 0,4342 0,4342 0,3471 0,3866 0,3828
06 0,4978 0,4957 0,5929 0,5780 0,5971 0,5877 0,4741 0,5156 0,5424
07 0,6149 0,5577 0,7018 0,7862 0,6531 0,5934 0,6912 0,5350 0,6417

0,8
Y = 0,0111 + 0,01066 X
r ² = 0,9582
0,6
Abs 620 (nm)

0,4

0,2

0,0
0 6 12 24 36 48 60

Açúcares Solúveis Totais (µg mL-1)

Figura 6. Curva padrão de açúcares solúveis totais. Cada ponto representa a


média de 8 medições.
4.2 Construção da curva padrão de açúcares redutores – Método
DNS

Tabela 7: Valor de absorbância de açúcares redutores (Abs540 nm) de cada


repetição.
ANDREA CRISTIANO INÊS TERESA
Tubo Média
R1 R2 R1 R2 R1 R2 R1 R2
01 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,000 0,0000 0,0000
02 0,1858 0,1913 0,2367 0,2059 0,1488 0,1805 0,1935 0,1174 0,1825
03 0,4114 0,4047 0,4611 0,4609 0,4434 0,4549 0,4687 0,3917 0,4371
04 0,7407 0,7145 0,6277 0,7137 0,7143 0,7854 0,7388 0,7263 0,7202

0,8
Y = -0,02733 + 0,12076 X
r ² = 0,9790
0,6
Abs 540 (nm)

0,4

0,2

0,0
0 2 4 6
-1
Açúcares redutores
Açúcares (µ g ml
Redutores )
(µM)

Figura7: Curva padrão de açúcares redutores, cada ponto representa a média de


8 medições.

18
4.3 Construção de curva padrão para proteínas – Método Bradford

Tabela 8: Valor de absorbância de proteínas (Abs 595 nm) de cada repetição.


ANDREA CRISTIANO INÊS TERESA
Tubo Média
R! R2 R1 R2 R1 R2 R1 R2
01 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000
02 0,2307 0,2244 0,2425 0,2576 0,2149 0,1665 0,2201 0,2031 0,2200
03 0,4269 0,4264 0,5851 0,4474 0,3804 0,4039 0,4103 0,4190 0,4374
04 0,6274 0,6243 0,6133 0,7113 0,5459 0,5300 0,6026 0,6007 0,6069
05 0,7539 0,7726 0,8000 0,8436 0,6754 0,6481 0,8106 0,7928 0,7622
06 1,0193 0,9871 0,9083 0,9013 0,7664 0,8131 0,9632 0,9920 0,9188

1,2
Y = 0,0344 + 0,00913 X
r ² = 0,9637
Abs 595 (nm)

0,8

0,4

0,0
0 20 40 60 80 100
-1
Proteína (µ g(µg
Proteína mL0,1
) mL-1)

Figura 8: Curva padrão de proteínas, cada ponto representa a média de 8


medições.

19
4.4 Construção de curva padrão para aminoácidos – Método da
ninidrina

Tabela 9: Valor de absorbância de aminoácidos (Abs 570 nm) de cada


repetição.
ANDREA CRISTIANO INÊS TERESA
Tubo Média
R! R2 R1 R2 R1 R2 R1 R2
01 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000
02 0,1947 0,1859 0,2816 0,2861 0,2816 0,1902 0,1944 0,1992 0,0540
03 0,3529 0,3637 0,4485 0,4160 0,4485 0,3924 0,3111 0,2999 0,0698
04 0,5682 0,6714 0,6509 0,5980 0,6509 0,5996 0,6351 0,7113 0,0695
05 0,7280 0,7780 0,8495 0,9154 0,8495 0,8009 0,8145 0,9121 0,0743
06 0,9290 0,9173 0,9728 0,9686 0,9728 1,0220 0,9310 0,9425 0,0843

1,2
Y = 0,0153 + 0,9792 X
1,0 r ² = 0,98
Abs 570 (nm)

0,8

0,6

0,4

0,2

0,0
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
Aminoácidos mL-1)
(µ g (µmol)
Aminoácidos

Figura 9: Curva padrão de aminoácidos, cada ponto representa a média de 8


medições.

4.5 Gráficos de dispersão

Para a construção dos gráficos de dispersão (Figuras 6, 7, 8 e 9) foram


utilizados os resultados mostrados nas Tabelas 6, 7, 8 e 9, respectivamente.

20
As equações de ajustes encontradas para os teores das biomoléculas
foram lineares (y = ax + b) e seus valores de R2 denotam boa correlação entre a
taxa de absorbância e as concentrações das soluções sendo que apenas para a
equação dos açúcares redutores (Figura 7) encontrou-se valor negativo na
intercessão da reta no eixo y (y = -0,02733 + 0,12076x). Uma maior variação
nas repetições, provavelmente, causou esta diferença na tendência da reta.
Maiores variações de desvio padrão, foram observados em todos os gráficos no
ponto de maior concentração da biomolécula.
Os pequenos desvios de R2 podem ser conseqüências dos desvios da lei
de Beer (Jeffery et al, 1992) que inferem:
 Quantidades de eletrólitos maiores do que exigido para a reação
provocariam um deslocamento no máximo de absorção assim como
alteram o valor do coeficiente de absorção molar;
• O Soluto corado pode ionizar-se, ou dissociar-se, ou associar-se em
solução variando a concentração;
• A formação de complexos cuja composição depende da
concentração.
É importante notar que a linearidade constatada na lei de Lambert-Beer
se restringe a zonas de aplicabilidade características de cada método para as
condições experimentais utilizadas. Efetivamente, em concentrações de amostra
excessivamente reduzidas ou elevadas, poderão ocorrer erros originados,
respectivamente, pela falta de sensibilidade do método, ou pela acentuação da
turbidez das soluções devido à polimerização inespecífica de moléculas em
solução.
Fatores aliados às condições de trabalho do experimento colaboraram
para as inúmeras dificuldades encontradas pelo grupo principalmente em
questão de padronização e reprodutibilidade dos métodos. A má conservação
dos reagentes (prazo de validade, umidade, luz, contaminação) e vidrarias de

21
precisão (provetas, pipetas graduadas e automáticas, balões volumétricos)
observadas, podem ter aumentado as fontes de erro já que as análises são feitas
em microescala. Qualquer erro, seja na pipetagem ou na pesagem dos reagentes
ou ainda na composição química destes, poderia provocar alterações na resposta
final das curvas pois alteraria a constante de equilíbrio (Keq) para a formação do
complexo corado e, consequentemente a absorção da luz.

22
5 CONCLUSÕES

As zonas de aplicabilidade de cada ensaio devem ser determinadas


experimentalmente, antes de ensaiar qualquer amostra, de modo a garantir a
validade dos resultados experimentais obtidos para as soluções problema.
As curvas padrões obtidas apresentaram boa calibração e poderão ser
utilizadas para a determinação dos teores das biomoléculas (açúcares redutores,
açúcares totais e proteínas) em tecidos vegetais, nos próximos experimentos
exigidos pela disciplina.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

BRADFORD, M.M. A rapid and snsitive method for the quantification of


microgram quantities of protein utilising the principle of protein - dye binding.
Anal. Biochem, v. 72, p. 248-254, 1976.

CLARK, J.M. Bioquímica experimental. Zaragoza: editorial Acribia, 1966, 290


p.

CORN, E.E.; STUMPF, P.K. Introdução a Bioquímica. 4 ed. tradução,


MENNUCCI et al. São Paulo: Edgard Blücher, 1980. 525 p.

JEFFERY, G.H., BASSETT, J., MENDHAM, R.C., DENNEY. 5. ed. Vogel:


Análise Química Quantitativa. Rio de janeiro: Guanabara Koogan S.A., 1992,
712 p.

LEHNINGER, A.L. et al. Princípios de Bioquímica. 2a ed. São Paulo, Sarvier


Ltda. 1996. 839p.

LOWRY, O.H.; ROSEBROUCHE, N.J.; FAN, A.L.; RANDALL, R.J. Protein


measurement with the folin phenol reagent. J. Biol. Chem, v. 193, p. 265, 1951.

OHLWEILER, O.A. Química analítica quantitativa. Rio de Janeiro: Livros


técnicos Científicos. Brasília. INL, v. 1,2,3.1974.

OTTO ALCIDES OHLWEILER. 1981. Fundamentos de Análise


Instrumental. Livros Técnicos e Científicos Editora S.A. Rio de Janeiro.

SHRINER, R. L.; FUSON, R. C.; CURTIN, D. Y.; MORRIL, T. C.


Identificação sistemática dos compostos orgânicos: manual de laboratório. 6.
ed. Rio de Janeiro: Guanabara dois, 1983. 520p.

SOARES, B. G.; SOUZA, N. A. de; PIRES, D.X. Química orgânica: teoria e


técnicas de preparação, purificação e identificação de compostos orgânicos. Rio
de Janeiro: Guanabara, 1988. 322p.

24
QUESTIONÁRIO 1
Preparo de soluções e reagentes para análise Bioquímica

1) Quais os critérios e cuidados a serem utilizados na escolha de uma solução


tampão?
A escolha de uma solução tampão deve ser estabelecida buscando-se eficiência e
maior capacidade tamponante da mesma. Para tal, existem dois fatores
determinantes:
Concentração do sistema = Concentração dos componentes do sistema
[Base conjugada] 1 10
Relação = = =1
[Ácido conjugado] 10 1

inferindo pela equação de Henderson-Hasselbach:


[ BC ]
pH = pKa + log
[ AC ]
pH = pKa ± log 1

Ou seja, uma solução tampão apresentará capacidade tamponante em um


intervalo correspondente a uma unidade de pH abaixo do pKa até uma unidade
de pH acima do pKa.
Portanto, a eficiência de uma solução tampão tende a ser maior quanto maior for
a proximidade entre pH da solução e pKa do ácido conjugado pois o
tamponamento ocorre em torno do pKa.

2) Qual é o princípio da “ação tamponante” de uma solução tampão?


O princípio gira em torno da capacidade desta solução em resistir a mudanças
bruscas de pH em intervalos próximos ao seu pKa.

25
3) Explique o princípio do desenvolvimento de cor resultante da reação do(s)
reagente(s) específico(s) utilizados para os métodos de determinação de
aminoácidos, proteínas, açucares redutores e totais. Mostre as reações.
Relatório, capítulo 2.

4) Construa as figuras representativas das curvas padrões determinando


inclusive suas equações de regressão.
Relatório, capítulo 4.

5) Compare os métodos de quantificação utilizados nesta aula com os


disponíveis na literatura.
Relatório, capítulo 2.

6) Tem-se uma solução de 25 ppm de Ca na forma de CaCl2. Qual o volume


dessa solução é necessário para preparar 100 mL de um padrão de Ca 0,3 mM.
25 V = 0,3 x 0,1 L
V = 0,0012 L = 1,2 mL

7) Transformar para ppm os seguintes valores:


a) 0,0015%;
1 mg 0,001 g
x = 1,5 mg em 100 g
x 0,0015 g

1,5 mg 100 g
x = 15 mg /1000 g =15 mg / Kg = 15 ppm
x 1000 g

26
b) 22,3 mg/L
1 ppm mg/Kg (em p/p)
1 ppm mg/L (em p/v)
portanto 22,3 mg/L = 22,3 ppm

c) 40 mg/100 mL
1 ppm mg/L (em p/v)
40 mg
= 400 mg / L
0,1 L

d) 125 g/ 5 L;
125 = 25g /L
5
1 mg 0,001g
x 25 g
x = 25000 mg/L
x = 25000 ppm

e) 0,025%;
1 ppm mg/Kg (em p/p)
1 mg 0,001g
x 0,025 g
x = 25 mg /100 g
x = 25 mg / 0,1 Kg
x = 250 mg / Kg
x = 250 ppm

27
f) 1000ppb;
1 ppb µg/Kg ng/mg
1 ppm mg/Kg
1 µg 10-3 mg
x = 1 ppm

g) 312 mg/ L;
1 ppm mg/Kg (em p/p)
1 ppm mg/L (em p/v)
portanto 312 mg/L = 312 ppm

h) 312 g/m3;
3
312 g 312 x10 mg
3
= 3
= 312 mg / L
10 L 10 L
1 ppm mg/L (em p/v)
x = 312 ppm

i) 3 g/T;
1 ppm mg/Kg (em p/p)
1 ppm 0,001 g / 0,001 T
3 g/T = 3 ppm

j) 5 mg/ mL;
1 ppm mg/L (em p/v)
5 mg 0,001L
x = 5000 mg/L = 5000 ppm

28
k) 0,07 g/1000 mL;
1 ppm mg/L (em p/v)
1g 1000 mg
0,07 g x
x = 70 mg/L = 70 ppm

m) (NH4)2SO4 - 5 mM. Quantos ppm de N, S, H e O?


132 mg 28 mg de N 132 mg 8 mg de H
5 mg x 5 mg x
x = 1,06 mg de N x = 0,3 mg de H
x = 1,06 ppm de N x = 0,3 ppm de H

132 mg 32 mg de S 132 mg 64 mg de O
5 mg x 5 mg x

x = 1,21 mg de S x = 2,43 mg de O
x = 1,21 ppm de S x = 2,43 ppm de O

n) MgHPO4 – 10 mM. Quantos ppm de Mg, P, H e O?


120 mg 24 mg de Mg 120 mg 1 mg de H
10 mg x 10 mg x
x = 2 mg de N x = 0,08 mg de H
x = 2 ppm de N x = 0,08 ppm de H

120 mg 31 mg de P 120 mg 64 mg de O
10 mg x 10 mg x

x = 2,58 mg de P x = 5,34 mg de O
x = 2,58 ppm de P x = 5,34 ppm de O

29
8) Uma solução de KNO3 tem 140 ppm de N. Quantos ppm tem de K?
39 g de K 14 g de N
x 0,140 g de N

x = 0,39 g de K = 390 mg /L
x = 390 ppm

9) Para obtermos 10 litros de uma solução de Ca 160 ppm, quanto de Ca(NO3)2 .


4H2O é preciso?
236000 mg de Ca(NO3)2.4H2O 40000 mg de Ca
x 160 mg de Ca
x = 944 mg / L = 944 ppm de Ca(NO3)2.4H2O

994 1L
x 10 L

x = 9440 ppm = 9440 mg / 10 L = 9,44 g

10) Preparar uma solução de 1 M em K, a partir de K2SO4.

Kps K2SO4 = 1 M
+ 2-
K2SO4 2K + SO4 K+
-Kps 2x = 1
x 2x x x = 0,5 M
2-
1 1 1 SO4 = 1

m
M= = 0,5 .1 .71 = 48 g7d Ke2S 4Oe 1mL d se o l u ç ã o
P xMV

11) Preparar 1 litro de solução que contenha 195 ppm de K e tendo como
solução estoque KNO3 1 M.

30
1M 101 g de KNO3 39 g de K
x x 0,195 g de K
x = 0,505 g de KNO3 = 0,505 g /L = 0,505 M
M V = M' V'
1 V = 0,505 x 1
V = 0,505 L = 505 mL de KNO3 1M

12) O que é normalidade, molaridade, molalidade e ppm?


 Normalidade (N): nº de equivalente-grama do soluto dissolvido em um litro
de solução.
N º eq
N= onde Nº eq = nº de equivalente-grama; V = volume
V
expressa em mol L-1
eqg
Nº eq =
N º ionizáveis

onde
eq g = equivalente-grama;
N º ionizáveis = Ácido = nº de H+ ionizáveis
Base = nº de OH- ionizáveis
Sal = nº do elemento de maior Nox

 Concentração molar ou molaridade (M): nº de mols de soluto dissolvidos em


um litro de solução, ou seja:
n
M= expressa em mol L-1 ou g L-1 ou g cm-3.
V
onde n = nº de mols; V = volume da solução.
m
Se n = onde m = massa do soluto; PM = peso molecular do soluto.
PM

31
Então, molaridade pode também ser definida por:
m
M =
PM x V

 Concentração molal (ω ): nº de mols de soluto dissolvido em um quilograma


de solvente.
n
ω= onde ω = molalidade; n = nº de mols; m = massa da solução.
ms
expressa em mol Kg-1 ou g Kg-1

 Partes por milhão (ppm): indica o nº de partes de soluto em um milhão de


partes de solução.
1g soluto
1ppm (p/p) = expressa em mg Kg-1 ou mg g-1
10 6 g solução

1mL soluto
1ppm (v/v) = expressa em mg L-1
10 6 mL solução

1g soluto
1ppm (p/v) = 6 expressa em mg L-1 ou mg mL-1
10 mL solução

Obs. É interessante ressaltar que os termos molalidade e molaridade estão sendo


substituídos por ppm (molalidade está completamente abolido) visto que a
tendência atual é somente trabalhar em termos de massa/massa.
Fazendo correlações encontra-se:

1 ppm (p/p) = expressa em mg Kg-1 ou µ g g-1


1 ppm (v/v) = expressa em µ L L-1
1 ppm (p/v) = expressa em mg L-1 ou µ g mL-1
1 M = 1000 ppm então 1 ppm = 1 mM

32
13) Como são divididos quimicamente os aminoácidos?
Os aminoácidos são divididos em quatro grupos de acordo com a polaridade do
seus grupamento R lateral. São eles:
 Aminoácidos com R = grupos apolares (hidrofóbicos)

H O H O

O N C C N C C
H
H O
N C C H CH2 H CH
N C C H3C CH2
H CH CH
H CH3 H3C CH3 H3C CH3 CH3

Alanina Valina Leucina Isoleucina


(Ala OU A) (Val ou V) (Leu ou L) (Ileu ou I)

H O H O H O H O

N C C N C C N C C N C C

H CH2 CH2 H CH2 H CH2


H2C
CH2 CH2
S CH3
N
Metionina Prolina Fenilalanina
(Met ou M) H
(Pro ou P) (Phe ou F)
Triptofano
(Trp ou W)

33
 Aminoácidos com R = grupos polares neutros (hidrofílicos)

H O

O N C C
H
H O H O
N C C H CH2
N C C N C C
H CH2 CH2
H CH2 H CH CH3
C C
O NH2 O NH2 OH OH

Asparagina Glutamina Serina Treonina


(Asdn ou N) (Gln ou Q) (Ser ou S) (Thr ou T)

H O O
H
N C C N C C
H O
H CH2 H CH2
N C C
SH
H H

Glicina Cisteína Tirosina


(Gly ou G) (Cys ou C) (Tyr ou Y)
OH

 Aminoácidos com R = grupos polares ácidos

34
H O

H O N C C
N C C H CH2
H CH2 CH2
C C
O O O O

Ácido aspártico Ácido glutâmico


(Asp ou D) (Glu ou E)

 Aminoácidos com R = grupos polares básicos

H O H O

N C C N C C
H O
H CH2 H CH2
N C C
CH2 CH2

CH2 CH2 H
C
HN CH
CH2 C
H2N NH2 HC NH
NH3

Lisina Arginina Histidina


(Lys ou K) (Arg ou R) (His ou H)

14) O que é precisão, exatidão e sensibilidade do método?


A exatidão é a concordância entre o resultado determinado e o
verdadeiro ou em outras palavras, exprime a correção de uma medida. A
precisão é a concordância de uma ou mais medidas de uma mesma variável, ou
seja, exprime a reprodutibilidade de uma análise.
Sensibilidade é a capacidade de aparelhos ou instrumentos ou análises,
de reagir à mínima ação ou variação de influências físicas externas, tais como
peso, pressão, temperatura, concentração, etc.

35
SUMÁRIO

1
1 introdução.......................................................................................................................1
2 referencial teórico...........................................................................................................2
3 material e métodos........................................................................................................11
3.1Construção de curva padrão de açúcares solúveis totais – Método Antrona..11
3.1.1 Preparo dos reagentes.....................................................................................11
3.1.2Obtenção da curva padrão................................................................................11
3.2 Construção da curva padrão de açúcares redutores – Método DNS............12
3.2.1 Preparo dos reagentes.....................................................................................12
3.2.2 Obtenção da curva padrão........................................................................13
3.3 Construção de curva padrão para proteínas – Método Bradford.................13
3.3.1 Preparo do reagente .......................................................................................13
3.3.2Obtenção da curva padrão................................................................................14
3.4 Construção de curva padrão de α -aminoácidos – Método da ninhidrina....14
3.4.1 Preparo dos reagentes.....................................................................................14
3.4.2Obtenção da curva padrão................................................................................15
3.5 Representação do gráfico de dispersão.......................................................16
4 resultados e discussão...................................................................................................17
4.1Construção de curva padrão de açúcares solúveis totais – Método Antrona..17
4.2 Construção da curva padrão de açúcares redutores – Método DNS............18
4.3Construção de curva padrão para proteínas – Método Bradford....................19
4.4 Construção de curva padrão para aminoácidos – Método da ninidrina.........20
4.5 Gráficos de dispersão.................................................................................20
5 Conclusões....................................................................................................................23
ReferênciaS bibliográficaS...............................................................................................24
ANEXO - QUESTIONÁRIO.............................................................................24