Coordenadoria de Biotecnologia

Curso de Bioquímica

Práticas: Dosagem de glicose: Método do DNS & Açúcares redutores

Alunos: João Víctor Gomes, Matheus Costa e Paulo Meirelles

Turma: BM 151

Professores: Marcio Loureiro e Ana Claudia Tessis

Data da realização da prática: 14/11/2018

Data da entrega do relatório: 28/11/2018

Avaliação:

Critério: Nota:
Apresentação

Introdução
Objetivos
Métodos
Resultados
Discussão
Bibliografia
Total:

1
1) Introdução

Os carboidratos são as macromoléculas mais abundantes na Terra.

Essas moléculas são essenciais para a vida, pois têm  funções estruturais,
energéticas e de armazenamento. Os carboidratos são compostos
majoritariamente por átomos de carbono, hidrogênio e oxigênio. Sua estrutura
pode ser representada pela fórmula (CH O) em que o n deve ser maior ou igual
2 n

a 3.
Os carboidratos mais simples são os monossacarídeos. Esses açúcares
possuem 2 famílias: com um grupo aldeído em sua extremidade ou um grupo
cetona. A nomenclatura de cada um desses glicídios vai depender do número
de carbonos e  do grupo funcional da molécula. Acrescenta-se o sufixo “ose” no
nome do carboidrato.
Exemplo:

                    
Imagem 1 - Representação de Fisher dos dois monossacarídeos mais simples:
Aldotriose e Cetotriose

A molécula da esquerda possui um grupo aldeído e 3 átomos de

carbono, por tanto é uma Aldotriose, enquanto a molécula da direita possui
uma cetona e 3 átomos de carbono, sendo uma Cetotriose. Caso houvessem
4 carbonos, seriam, respectivamente, aldotetrose e cetotetrose e assim por
diante.
Todos os monossacarídeos têm um ou mais átomos de carbono quirais (
exceto a cetotriose). Moléculas com n centros quirais possuem 2 n
estereoisômeros. Nos organismos, há predominância  do isômero D, e com o
passar do tempo as enzimas adquiriram estereoespecificidade para esses
isômeros selecionados.
Dois açúcares que diferem apenas na configuração de um carbono são
chamados de epímeros. Na projeção de Fisher as moléculas com o grupo OH
-mais distantes do carbonil- para direita é um isômero D, e para esquerda é um
isômero L.
2
 Imagem 2 - Representação de epímeros da glicose

As moléculas das extremidades apresentam mesmo esqueleto da

molécula de glicose, porém têm configurações diferentes no carbono
representado na imagem, o que faz com que haja uma certa variedade de
monossacarídeos.
Em meio aquoso as aldotetroses e todos os monossacarídeos com 5 ou
mais átomos de carbono ocorrem predominantemente em estruturas cíclicas.
Quando um OH reage com aldeído, forma uma reação hemiacetal, e quando
reage com cetona forma  uma reação hemicetal. A adição de mais um grupo -
OH produz o acetal ou cetal completo. Se os grupos -OH vierem da mesma
molécula, o resultado será um anel de 5 ou 6 membros. Quando a molécula
regente for um monossacarídeo, será formado um dissacarídeo.
A reação com a  primeira hidroxila cria um centro quiral adicional
(carbono do carbonil). Como o álcool pode atacar o carbonil por trás ou pela
frente, gera 2 formas isoméricas, os anômeros α e ß.

Imagem 3 - Formação das duas formas cíclicas da D-glicose

3
 Os compostos com anéis formados com 6 membros são denominados
piranoses e com 5 membros furanoses.

Imagem 4: representação de Haworth para a β-glicopiranose (esquerda)

e α-frutofuranose (direita).

Os carbonos anoméricos, ligados a OH e H, conferem uma propriedade

de potencial redutor ao açúcar. Porém, quando há uma ligação glicosídica
entre dois monossacarídeos, formando um dissacarídeo, há perda de uma
molécula de água, deixando o carbono anomérico sem sua extremidade
redutora. Por isso não são todos os açúcares que têm a propriedade redutora.

Imagem 5 – Representação da ação de um açúcar redutor no DNS.

O DNS é um reagente comumente utilizado para determinar o potencial

de redução dos açucares. Ele apresenta uma coloração amarela, porém
quando está em sua forma reduzida, adquire uma cor marrom-avermelhada.
Nesta aula prática ele foi utilizado para se realizar uma dosagem de
glicose. Isso é possível por conta de sua cor, podendo ser lida sua absorbância
em um espectrofotômetro.

2) Objetivos

2.1) Dosagem de glicose: método do DNS

4
 A realização deste experimento teve como principal objetivo a
determinação da concentração da solução de glicose de concentração
desconhecida por meio da construção de uma curva padrão, a qual é composta
pelas absorbâncias corrigidas de cada uma das concentrações das soluções
de glicose conhecidas.

2.2) Açúcares redutores

O objetivo desse experimento foi analisar o comportamento redutor da

glicose e da sacarose. Foi possível diferenciá-los por meio de uma solução
alcoólica de azul de metileno, utilizada como indicadora de mudança. Pôde-se
também observar como a presença de NaOH influencia neste processo, sendo
capaz de notar alterações das características da solução.

3) Materiais e Métodos

3.1) Materiais

A) Reagentes

 Solução Padrão de glicose 10 Mm;

 Solução de glicose com concentração desconhecida;
 Solução de DNS;
 Água destilada;
 Solução de NaOH 2%p/v;
 Solução de sacarose 1% p/v;
 Solução de glicose 1% p/v;
 Solução alcoólica de azul de metileno 0,1% p/v;

B) Instrumentos e materiais

 7 tubos de ensaio grandes;

 4 tubos de ensaio médios;
 4 beckers de 50 mL;
 1 pipeta automática de 200 μL;
 1 pipeta automática de 1000 μL;
 1 pipeta automática de 5000 μL;

5
  2 Pró-pipetes;
 4 Pipetas de 5 mL;
 Pipeta Pasteur pequena;
 Pedaços de Parafilm;
 Banho-Maria à 100°C;
 Leitor ELIZA

3.2) Métodos

A) Dosagem de glicose: método do DNS

Inicialmente, foram identificados 7 tubos de ensaio grandes, sendo

um deles intitulado como branco e os outros numerados de 1 a 6.
Transferiu-se então com auxílio de pipetas automáticas (p200 e p1000), a
partir do tudo branco até o tubo 4 (somente), alíquotas de 1000, 800,
600,400, 200 µL de água destilada. Logo após isso, do tubo 1 até o tubo 5 (
apenas) adicionou-se alíquotas de 200, 400, 600, 800 e 100 µL da solução
de glicose 10 mM. Em seguida, apenas no tubo 6 foi adicionada 100 µL de
solução de glicose de concentração desconhecida. Enfim, adicionou-se em
todos os tubos uma solução DNS.
Os tubos foram homogeneizados e aquecidos por 5 minutos em
banho-maria (100°C). Feito isso, esperou-se os tubos esfriarem em
temperatura ambiente na bancada, onde logo após foram adicionados 13
mL de água destilada, alcançando então um volume final de 15 mL em
cada tubo.
Estes foram vedados com Parafilm e homogeneizados mais uma vez.
Ao fim, alíquotas de todas as amostras foram transferidas para a placa de
96 poços, a qual foi levada para o leitor ELIZA para a leitura das suas
respectivas absorbâncias.

Tubo Água Solução padrão de Solução Solução

Nº destilada glicose 10 mM glicose [?] DNS

B 1,0 - - 1,0

1 0,8 0,2 - 1,0

6
 2 0,6 0,4 - 1,0

3 0,4 0,6 - 1,0

4 0,2 0,8 - 1,0

5 - 1,0 - 1,0

6 - - 1,0 1,0

Tabela 1

B. Açúcares redutores

Neste experimento, foram numerados quatro tubos de ensaio médios.

Primeiramente, adicionou-se 3,0 mL de solução de NaOH 2% p/v nos tubos
1,2 e 4. Em seguida, utilizou-se uma solução de glicose 1% p/v, a qual foi
acrescentada 3,0 mL nos tubos 1 e 3. A solução de sacarose 1% p/v foi a
terceira a ser utilizada, sendo aplicados os 3,0 mL apenas ao tubo 2. Enfim,
foram adicionadas alíquotas de 3,0 mL de água destilada nos tubos 3 e 4 e
adicionou-se 1 gota  de solução alcoólica de azul de metileno 0,1% p/v em
todos os tubos.
Os mesmos foram vedados com Parafilm e homogeneizados. Por fim,
os tubos foram incubados e à temperatura ambiente e observou-se os
resultados.

Tubo Solução NaOH Solução glicose Solução H2O

Nº (mL) (mL) sacarose (mL) (mL)

1 3,0 3,0 - -

2 3,0 - 3,0 -

3 - 3,0 - 3,0

4 3,0 - - 3,0

Tabela 2
Observação: em todos os tubos de ensaio foi adicionada 1 gota de
solução alcoólica azul de metileno.

7
4) Resultados

4.1) Dosagem de glicose: Método do DNS

Para a realização dos cálculos posteriores, é necessário determinar as

concentrações finais de glicose em cada tubo após todas as adições. O volume
final de todos os tubos foi de 15 mL. Sendo assim, utiliza-se a seguinte fórmula
para a realização dos cálculos:

C 1. V 1=C2 . V 2

Como a concentração inicial da solução padrão de glicose é de 10 mM,

basta substituir na fórmula com os diferentes volumes adicionados nos tubos
de 1 a 5. A seguir será demonstrado o cálculo para o tubo 1, sendo o mesmo
cálculo para os demais.

10 x 0,2=C2 x 15

C 2=0,133 mM

Tubo Concentração
(nº) (mM)
1 0,133
2 0,267
3 0,400
4 0,533
5 0,667

Tabela 3 – Concentrações finais de glicose nos tubos de 1 a 5.

Com o auxílio do leitor de ELISA, foi possível determinar os valores de

absorbância das soluções presentes em todos os tubos. Descontando o valor
de absorbância do tubo branco nos outros tubos, obtém-se os valores de
absorbância corrigida que seguem abaixo.

8
 Tubos Absorbância
corrigida
1 0,115
2 0,196
3 0,264
4 0,336
5 0,410
6 0,137

Tabela 4 – Valores de absorbância corrigida.

A partir dos valores de absorbância corrigida e das concentrações de

glicose, é possível construir uma curva padrão, a fim de determinar a
concentração da solução de glicose de concentração desconhecida. Para isso,
utilizamos a equação da reta:

y=ax+ b

Sendo “y” a absorbância e “x” a concentração de glicose, pode-se

calcular os valores de “a” e “b” através de um sistema de duas equações.

Tubos 1 e 2

0,115 = 0,133a + b

0,196 = 0,267a + b

Multiplicando a equação do tubo 1 por -1 e depois subtraindo-a da

equação do tubo depois, chega-se ao seguinte resultado:

0,196 – 0,115 = (0,267 – 0,133)a

0,081 = 0,134a

a = 0,604477612

Com o valor de “a” determinado, substituindo este valor em qualquer

uma das equações, é possível calcular o valor de “b”.

9
 0,115 = 0,133 x 0,604477612 + b

0,115 = 0,0803955224 + b

b = 0,0346044776

Para que os valores obtidos fossem os mais exatos possíveis, foi feito
um cálculo de média entre os valores de “a” e “b” existente.

a = (0,604477612 + 0,558052434 + 0,5525 + 0,552434457)/4

a = 0,566866126 ≈ 0,567

b = (0,0346044776 + 0,0407790263 + 0,0415175 + 0,0415262172)/4

b = 0,0396068053 ≈ 0,0396

Equação: y = 0,567x + 0,0396

A partir dos valores de “a” e “b” juntamente com o de absorbância do

tubo 6, calcula-se a concentração de glicose presente no tubo 6, com uso da
equação da reta feita.

0,137 = 0,567[glicose] + 0,0396

0,567[glicose] = 0,0974

[glicose] = 0,171781305 mM ≈ 0,172mM

Absorbância x [Glicose]
0.45
0.4
Absorbância

0.35
0.3
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7

[Glicose] (mM)

Gráfico 1 – Gráfico de Absorbância por Concentração de Glicose.

10
 Este valor de concentração não é concernente ao frasco de solução de
glicose. Para encontra-lo, deve-se multiplicar o valor do tubo por 15, que é o
fator de diluição, uma vez que foi pipetado 1 mL da solução do frasco e elevado
a um volume final de 15mL.

0,171781305 x 15 = [glicose]frasco

[glicose]frasco = 2,57671958 mM ≈ 2,58 mM

4.2) Açúcares redutores

Ao realizar o método 2.2, observou-se mudanças de coloração com o
passar do tempo nas soluções dos tubos 2 a 4. Apenas o tubo 1 permaneceu
incolor, exceto quando este foi agitado. Foi também observado na superfície da
solução do tubo 1, quando este estava incolor, uma coloração azul.

Imagem 6 - Resultados açúcares redutores

5) Discussão

5.1) Dosagem de glicose: Método do DNS

Pelo fato do DNS ser um reagente de cor amarela, inicialmente todos os

tubos apresentavam uma coloração amarela forte. Após a adição de glicose
aos tubos e estes serem postos em banho maria a 100ºC, a solução adquiriu
uma coloração do laranja ao vermelho, variando com a concentração de
glicose.

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 Essa variação na coloração ocorre devido a capacidade redutora da
glicose. O DNS, então, ao entrar em contato com a glicose, se apresenta em
sua forma reduzida, ocorrendo uma mudança em sua coloração, passando de
amarelo forte a laranja ou vermelho intenso, dependendo da concentração de
glicose.

A função do banho maria no experimento é acelerar a cinética da

redução, fazendo com que a maior parte das moléculas de DNS sejam
reduzidas pelas moléculas de glicose, por ocorrer um aumento na energia
cinética do sistema, aumentando a quantidade de choques efetivos entre as
moléculas presentes na solução.

Através de um análise meramente qualitativa das colorações após a

adição de glicose e os tubos serem submetidos ao banho maria, é possível
inferir que o tubo de concentração desconhecida (Tubo 6) possui uma
concentração de valor entre os tubos 1 e 2. Isto foi comprovado através da
realização dos cálculos presentes nos Resultados.

Se ao invés de glicose fosse utilizado sacarose, não seria possível

atingir os objetivos esperados para esse experimento. A explicação para isso
se baseia no fato da sacarose não ser um açúcar redutor por não possuir um
carbono anomérico disponível em sua estrutura, não apresentando a
capacidade de reduzir o DNS e mudar sua coloração.

5.2) Açúcares Redutores

O indicador azul de metileno é um indicador redox, ou seja, este
apresenta coloração azul quando oxidado e incolor quando reduzido. A glicose
atua como um agente redutor, provocando a redução do azul de metileno. Isso
explica a solução incolor no tubo 1. O contato com o oxigênio do ar promove a
oxidação da superfície da solução deste tubo.
A presença de NaOH explica o porquê da solução do tubo 1 ficar azul
quando agitada. A molécula de glicose quando está em meio alcalino passa a
ser uma molécula de enediol, que por sua vez atua como um intermediário na
reação de oxirredução da glicose com o azul de metileno. Além disso, o NaOH

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dissociado participa na transferência de ânions e cátions, ajudando na
circulação de elétrons pela molécula. Quando a solução é agitada, ocorre a
reversão do rearranjo estrutural do azul de metileno em sua forma oxidada,
pois a agitação promove colisões das moléculas, aumentando a interação
destas na solução.
No tubo 3, apesar de ter a glicose, não ocorre a redução do azul de
metileno. Isso se deve ao fato da solução não ter NaOH para deslocar o
equilíbrio para a redução como no tubo 1. Porém, a solução apresenta
coloração mais clara que nos tubos 2 e 4, pois a glicose reduz, mesmo que
muito pouco, o azul de metileno para o incolor.

Imagem 7 - Glicose virando Enediol

Nos tubos 2 e 4 as soluções apresentaram coloração azul, pois a

sacarose é um dissacarídeo que não apresenta potencial redutor. Quando os
monossacarídeos de glicose e frutose se ligam através de uma ligação
glicosídica, há perda de uma molécula de água. Essa ligação ocorre no
carbono anomérico desses dois monossacarídeos, havendo perda de uma
hidroxila da frutose e um hidrogênio da glicose. Como não há carbono
anomérico livre, essa molécula perde sua extremidade redutora.

Imagem 8 - Formação da sacarose

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6) Bibliografia
Nelson, David L.; COX, Michael M. Princípios de bioquímica de
Lehninger. Porto Alegre: Artmed, 2011. 6. ed. Porto Alegre: Artmed, 2014.

BERG, Jeremy M.; STRYER, Lubert; TYMOCZKO, John L. Bioquímica. 7. ed.

Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2014.

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