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Coordenadoria de Biotecnologia

Curso de Bioquímica

Prática: Dosagem de glicose: método do DNS

Alunos: Jorge Barros, Lucas Santos e Nathan Coelho

Turma: QM 161

Professores: Fernanda Kamp e Márcio Loureiro

Data da realização da prática: 26/11/18

Data da entrega do relatório: 03/12/18

Avaliação:

Critério: Nota:
Apresentação
Introdução
Objetivo
Métodos
Resultados
Discussão
Bibliografia
Total:

1. Introdução
Carboidratos são substâncias orgânicas constituídas basicamente de carbono,
hidrogênio e oxigênio, algumas vezes podendo conter nitrogênio e enxofre, de pelo
menos três carbonos em sua composição. Apresentam formula molecular genérica de
(CH2O)n onde “n” é o número de carbonos que este carboidrato é constituído.
Muitos alimentos são fontes de carboidratos como arroz, batata, trigo (fontes de
amido), leite (lactose), cana-de-açúcar, frutas (glicose) e outros. São parte essencial da
dieta diária humana, compondo de 50 – 60% dos nutrientes necessários, isso porque
energia é demandada para funcionamento de órgãos incessantemente (o cérebro é um
grande dependente da glicose).
Além disso, os hidratos de carbono apresentam basicamente três funções gerais nos
organismos: energética, estrutural e reserva energética.
Os carboidratos são os principais fornecedores de energia na forma de ATP nos
organismos, poupando as proteínas para fins energéticos. Na sua quebra, além do ATP,
também é gerado gás carbônico e água.
Carboidratos são armazenados de formas específicas nos organismos. Nos animais são
encontrados na forma de glicogênio, e nos vegetais no formato de amido. Ambas formas
de reserva energética são polissacarídeos de glicose, que se diferenciam nas suas
estruturas.

Figura I: molécula de glicogênio. Figura II: representação da estrutura do amido.

De forma estrutural também atuam na composição das paredes celulares das plantas no
formato de um dos polissacarídeos mais abundantes no planeta: a celulose. Este polímero
de monossacarídeos é conhecido por ser indigesto para humanos pois não possuímos
enzimas capazes de digeri-las. Além disso, outros dois polissacarídeos que possuem
função estrutural são a quitina (que compõem o exoesqueleto de alguns artrópodes) e o
glicocálix (composto formado de açúcares e outras substâncias que se encontra externo à
membrana plasmática).
Figura II: organização da celulose.

Os sacarídeos podem ser encontrados em três formas básicas: monossacarídeos,


oligossacarídeos e polissacarídeos.
Basicamente, os monossacarídeos são compostos de três a sete carbonos e podem ser
divididos em dois grupos conhecidos como aldoses e cetoses. Nas aldoses, o grupamento
carbonila (carbono ligado a oxigênio por meio de ligação dupla) se encontra no final da
cadeia carbônica, enquanto nas cetoses este grupamento está no penúltimo carbono, como
é possível observar na imagem abaixo.
Entretanto, os glicídios não são encontrados de maneira linear no meio aquoso, mas
sim de forma cíclica. O anel é formado devido a reação da carbonila com a penúltima
hidroxila de sua cadeia, podendo gerar isômeros alfa e beta. Isômeros alfa indicam que a
hidroxila do carbono primário se encontra abaixo do plano do anel, enquanto isômeros
que iniciam-se com beta indicam que a hidroxila está acima do plano.
Os principais monossacarídeos são a frutose, galactose e glicose.
Figura IV: duas representações da molécula de glicose.

Quando dois monossacarídeos se unem é formado um dissacarídeo. Essa ligação que


os une é chamada de ligação glicosídica e consiste basicamente na interação da hidroxila
do carbono 1 de um carboidrato com a hidroxila do carbono 4 de outro carboidrato,
gerando a saída de uma molécula de água. Esses dois carboidratos estarão unidos por
meio de um átomo de oxigênio, como representado na figura abaixo:

Figura V: representação da maltose.

Existem diversos dissacarídeos importantes, dentre eles a lactose (glicose + galactose)


que é um açúcar redutor encontrado no leite, a sacarose (glicose + frutose) que é um
açúcar não redutor formado somente por plantas e a maltose (glicose + glicose) que é
encontrada nos cereais.
As enzimas, para quebrar esta ligação glicosídica, realizam o processo inverso de suas
sínteses, ou seja, adicionam água à esta ligação, fazendo com que se rompa, gerando dois
monossacarídeos.
Figura VI: síntese de dissacarídeos.

Por fim, existem os polissacarídeos, contendo centenas ou até milhares de


monossacarídeos em sua composição, formando cadeias lineares, como a celulose ou
ramificadas, como o glicogênio. O amido também é um polissacarídeo e, ao ingerirmos
algum alimento rico em amido, como a batata, esse amido é quebrado por enzimas em
maltoses e essas maltoses quebradas novamente em glicose. Essas glicoses se
reorganizarão novamente no formato de glicogênio dentro das células humanas para
serem utilizadas quando necessário.
Podemos também separar os carboidratos em açúcares redutores e não redutores, onde
os redutores são aqueles que possuem seu grupo carbonila livre e que é capaz de se oxidar
em meio a presença de agentes oxidantes de soluções alcalinas, ou seja, o seu grupo
carbonila se torna um grupamento carboxila. Açúcares não redutores não possuem essa
capacidade de se oxidarem.
Um dos métodos para se medir a quantidade de glicose no meio é o método DNS, que
consiste basicamente em medir por leitura espectofotométrica a absorbância de cada poço
da placa contendo determinados volumes de água, glicose e DNS.

2. Objetivo
A prática da dosagem de glicose pelo método do DNS teve como finalidade averiguar a
concentração de uma amostra desconhecida de glicose usando leitor de absorbância e
soluções padrão de glicose.
Já a prática de açúcares redutores objetivou a aferição do comportamento redutor de dois
carboidratos: glicose e sacarose, tendo como indicação o azul de metileno em pH alcalino.

3. Materiais e Métodos

3.1 Açúcares redutores


 Solução de NaOH 2% p/v;
 Solução de sacarose 1% p/v;
 Solução de glicose 1% p/v;
 Solução alcoólica de azul de metileno 0,1% p/v;
 4 tubos de ensaio;
 4 pipetas de 5mL;
 1 pipeta pasteur com uma pera pequena;
 2 pró-pipetes;
 Pedaços de Parafilm;

Foram transferidas alíquotas com auxílio do pró-pipete de acordo com a tabela de


açúcares redutores para tubos de ensaio, que foram vedados com Parafilm,
homogeneizados e encubados à temperatura ambiente. Depois de certo período de tempo,
observaram-se os resultados.

3.2 Dosagem de glicose: Método DNS


 Solução padrão de glicose 10 mM;
 Solução de DNS (DNS 1% p/v, tartarato duplo Na/K 30% p/v em NaOH 0,4
mol/L) - modo de preparo: dissolver 5g de ácido 3,5’di-nitro salicílico em 100 mL
de NaOH 2 mol/L. Em seguida, dissolver 150g de tartarato duplo de sódio e
potássio 250 mL de água com aquecimento. Misturar as duas soluções e avolumar
a 500 mL;
 Solução de glicose - concentração desconhecida;
 Banho-maria 100o C;
 Espectrofotômetro;
 7 tubos de ensaio;
 4 pipetas de 1 mL e 1 pipeta de 10 mL;
 3 beckers de 50 mL;
 2 pró-pipetes;
 7 cubetas;
 Pedaços de Parafilm.

Foram transferidas alíquotas com auxílio de pró-pipetes de acordo com os volumes da


tabela. Após homogeneizados, os tubos foram colocados em banho-maria à 100 graus
Celsius por 5 minutos. Os tubos foram retirados então e esfriados à temperatura ambiente
e então adicionou-se 13 mL de água em todos os tubos. Tampou-os com Parafilm e
homogeneizou-os. Foram transferidas alíquotas das soluções para a placa, seguido de
leitura no espectrofotômetro para leitura da absorbância a 540 nm.
4. Resultados

4.1 Dosagem de Glicose: Método do DNS


Vale ressaltar que os valores obtidos nesta prática foram pegos com o grupo composto por
Daniel Cavalcante, Luis Ferreira e Matheus Faesy, por consequência da falta de tempo
necessária para conclusão da prática ocasionada por erro no procedimento.
Os dados de absorbância obtidos relativos às concentrações vigentes de glicose foram
dispostos na tabela X-1, com o branco já descontado. O valor de absorbância do tubo 2 foi
removido por conta da discordância de valores entre os de absorbância dos tubos.

Tabela I - Relação entre as concentrações de açúcar e os valores de absorbância


Tubo Concentração de glicose Valores de absorbância
(mM) corrigidos (540nm)
1 0,133 0,049
3 0,400 0,2476
4 0,533 0,3388
5 0,667 0,4711
6 ? 0,1773

Com os valores tabelados, é possível deliberar uma equação do tipo y = ax + b, com os


valores de absorbância em função da concentração de glicose. Os cálculos estão evidenciados
abaixo:

Subtraindo as duas equações, tem-se que 0,1986 = 0,267*a, ou seja, a ≈ 0,7438


Para calcular o b, foi utilizada a equação 0,049 = 0,133*0,7438 +b, ou seja, b ≈ -0,0499
A equação da reta ficou, então: y = 0,7438*x – 0,0499. Com essa equação, a concentração
desconhecida pôde finalmente ser calculada, de acordo com os cálculos abaixo. Além disso, foi
confeccionado um gráfico (anexo 1) de valor de absorbância x concentração de glicose.
0,1773 = 0,7438*x – 0,0499
X = concentração desconhecida ≈ 0,3054 mM

Durante a prática, fotos foram tiradas antes e após o aquecimento e adição de água. Ambas
estão inseridas abaixo:
Figura VII: Aspecto dos tubos antes do aquecimento e adição de água.

Figura VIII: Aspecto dos tubos após aquecimento e adição de água.

4.2 Açúcares Redutores


Com as adições feitas conforme procedimento, os resultados das mesmas nos tubos foram
tabelados abaixo. As soluções inicialmente eram azuis por conta da adição do azul de
metileno e os resultados foram computados com base na mudança de cor ou não dos tubos e
estão dispostos na tabela X.
Tabela II – Resultados das reações feitas nos tubos
Tubo Sol. NaOH Sol. Sol. H2O (mL) Sol. alc. Resultados
(mL) Glicose Sacarose azul de
(mL) (mL) metileno
(gota)
1 3,0 3,0 - - 1 Solução
transparente
2 3,0 - 3,0 - 1 Sem
alteração
3 - 3,0 - 3,0 1 Sem
alteração
4 3,0 - - 3,0 1 Sem
alteração

Uma imagem (figura Y) foi tirada pelo grupo para evidenciar as mudanças ocorridas nos
tubos com as adições vigentes e está inserida abaixo:

Figura IX: Aspecto dos tubos após as adições vigentes.

5. Discussão

5.1 Dosagem de Glicose: Método do DNS


O reativo DNS possui um agente oxidante que, em contato com a glicose, se reduz e o
produto dessa redução é uma substância que pode absorver luz a 540 nm (medida usada na
prática) e ter sua absorbância lida no leitor de ELISA. Com as absorbâncias geradas, é
possível calcular a concentração do produto da redução do reativo, converter o valor para
concentração de produto da oxidação de glicose e, consequentemente, converter para a
concentração primordial da glicose.
Quanto maior for o valor de absorbância gerado, maior será a concentração dos produtos,
ou seja, maior será a concentração de glicose em solução. Isso pode ser exemplificado com o
fato de que na prática, as adições de glicose aos tubos eram crescentes e isso conferiu, além
de uma coloração diferente nos tubos (quanto maior a quantidade de glicose, mais escura era
a solução) após a adição de DNS, valores de absorbância crescendo conforme a concentração
de glicose padrão era maior.
Tal método não poderia ser utilizado para analisar sacarose, porque tal açúcar não sofre
oxirredução, já que sua carbonila não está livre para isso. O carbono anomérico que “guarda”
a carbonila está ligado a outra molécula de açúcar, o que faz com que essa carbonila fique
inativa e não disponível para reação de oxirredução.

5.2 Açúcares Redutores


O azul de metileno é um indicador de reação de oxirredução que sua solução, em contato
com um agente oxidante, apresenta coloração azul e em ambientes redutores, fica incolor.
Analisando a tabela e os resultados da prática, nota-se que a glicose presente no tubo 1
reduziu o azul de metileno e fez com que a solução ficasse não mais azul e sim incolor,
porém, com uma condição em específico: alta quantidade de HO - na solução. O alto pH
ministrado pelo NaOH foi necessário para que a redução acontecesse, visto que com um pH
próximo à neutralidade ministrado pela água não ocorreu reação. Além disso, nota-se que a
sacarose presente na solução do tubo 3 não conseguiu reduzir o azul de metileno apesar do
pH nessa solução também estar alto, ou seja, não se trata de um açúcar redutor.
O fato da glicose ser um açúcar redutor e a sacarose não ser pode ser explicado pelo fato
de que a sacarose, um dissacarídeo, não possui carbono anomérico na sua estrutura, enquanto
que a glicose, um monossacarídeo, possui tal carbono. O carbono anomérico na forma cíclica
do açúcar confere “liberdade” à carbonila presente na estrutura, já que no hemiacetal formado
pela ciclização do açúcar há uma carbonila “oculta” livre pronta para ser reduzida ou
oxidada. No caso dos dissacarídeos, não há carbono anomérico nem hemiacetal e sim um
acetal propriamente dito, o que faz com que a carbonila não fique livre para sofrer
oxirredução.
O NaOH nessa prática serve para aumentar a quantidade de HO- presente no meio a fim de
gerar uma reação inversa à da formação do hemiacetal que possui como produto um álcool, a
forma reduzida de um aldeído ou cetona. Portanto, em meio básico, a carbonila representada
pelo hemiacetal é reduzida a álcool.
6. Bibliografia
NEGRULESCU, A.; PATRULEA, V.; MINCEA, M. M.; IONASCU, C.; VLAD-
OROS, B. A.; OSTAFE, V. Adapting the reducing sugars method with dinitrosalicylic acid to
microtiter plates and microwave heating. Journal of the Brazilian Chemical Society, São
Paulo, v. 23, n. 12, 2012. http://dx.doi.org/10.1590/S0103-50532013005000003.
NELSON, D. L.; COX, M. M. Princípios de bioquímica de Lehninger. Porto
Alegre: Artmed, 2014.
GONÇALVES, C.; RODRIGUEZ-JASSO, R. M.; GOMES, N.; TEIXEIRA, J. A.;
BELO, I. Adaptation of dinitrosalicylic acid method to microtiter plates. Analytical Methods,
London, v. 2, 2010.