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I - Introdução

Enzimas são catalisadores biológicos de alta especificidade. Elas são de natureza proteica e aumentam
a velocidade de reações químicas específicas, por diminuição da energia de ativação requerida . [1]

Imagem 1: Representação gráfica de uma reação com e sem enzima.[2]

A cinética enzímática é um ramo da Bioquímica que estuda as enzimas em ação; a sua atividade
catalítica. No entanto, pode também ser encarada como um ramo da cinética química que estuda as
propriedades catalíticas das enzimas.
O estudo cinético de uma enzima visa primariamente caracterizar, ou seja descrever, a atividade dessa
enzima. In vitro estuda-se a atividade da enzima procurando saber que tipo de reações pode catalisar,
com que substratos pode interatuar e como se modifica essa atividade (qualitativa e/ou
quantitativamente) quando se fazem variar as condições em que é ensaiada. O valor de pH, a
temperatura, o tempo de incubação, as concentrações dos substratos, de cofactores ou de outras
substâncias (inibidores ou ativadores) são exemplos de condições de ensaio que podem ser modificadas
com o objetivo de observar como varia a atividade da enzima, ou seja, como varia a velocidade da
conversão ou conversões que esta catalisa. [3]
Em 1902,Henri e Brown admitiram a formação do complexo enzima-substrato (ES). Em 1913,
Michaelis e Menten conceituaram a formação desse complexo, em termos de derivação matemática, em
uma equação de velocidade que foi, posteriormente, generalizada por Briggs e Haldane com a
equação[1]:

Imagem 2: Equação genérica da ação enzimática [4]

Então, os cientistas chegaram a seguinte expressão:


Imagem 3: Equação de Michaelis–Menten[5]

A constante de Michaelis-Menten (Km) corresponde à concentração de substrato com a qual a


velocidade da reação enzimática atinge a metade da velocidade máxima.
As reações catalisadas por enzimas são saturáveis, e a sua velocidade de catálise não indica uma
resposta linear face ao aumento de substrato. Se a velocidade inicial da reação é medida sobre uma
escala de concentrações de substrato (denotada como [S]), a velocidade de reação (v) aumenta com o
acréscimo de [S]. Todavia, à medida que [S] aumenta, a enzima satura-se e a velocidade atinge o
valor máximo Vmax.

Imagem 4: Gráfico - Velocidade da reação X Concentração do substrato[6]

II – Objetivo
Observar através de experimentos químicos a velocidade da reação proporcionada pela enzima
invertase sob influencia da concentração, pH e temperatura.

III – Materiais e Métodos

• Materiais e Reagentes
Aparelhagem e Material utilizado:

-Tubos de ensaio 10 X 150 mm;


-Banho de água à 37ºC;
-Banho de água fervente;
-Banho de gelo;
-Pipetas de 2, 5 e 10 ml;
-Becheres de 400 e 600 ml;
-Estante para tubos de ensaio.

Reagentes:
-Enzima invertase;
-Tampão acetato pH 5,0;
-Solução de sacarose a 25 mmol/l (9,5 g/l) em tampão acetato pH 5,0;
-Solução de ácido 3,5-di- nitro-salicílico (DNS);
-Água destilada.
-Solução de sacarose a 0,2 mol/l (6,8 g/100 ml) em diferentes tampões (acetato pH 3,6; acetato pH 5,0
e fosfato pH 8,0).

Kits por bancada:

-7 tubos de ensaio com tampa;


-1 estante para tubos de ensaio;
-4 pipetas de 2 ml;
-2 pipetas de 5 ml;
-1 pipeta de 10 ml;
-2 becheres de 600 ml.

• Métodos
1. Influência da Concentração de Substrato
Em 7 tubos de ensaio com tampa, enumerados de 1 a 7, adicionou-se tampão acetato pH 5,0 e solução
de sacarose 25 mmol/l conforme indicado pela tabela abaixo:
Quadro 1: volumes adicionados de sacarose e tampão

REAGENTES TUBO TUBO TUBO TUBO TUBO TUBO TUBO


1 2 3 4 5 6 7
Tampão acetato 2,0 1,8 1,6 1,0 0,5 0,2 0,0
pH 5,0 (mL)
Solução de sacarose 0,0 0,2 0,4 1,0 1,5 1,8 2,0
25 mmol/L (9,5 g/L) (mL)

Colocou-se os 7 tubos e o tubo contendo a enzima em banho de água à 37º C por 5 minutos. Após se
retirou os tubos do banho e se adicionou 0,5 mL de enzima em cada tubo. Os tubos foram incubados a
37ºC por 15 minutos para que a hidrólise acontecesse. Adicionou-se 1 mL de DNS, em cada tubo,
retirou-se imediatamente do banho e foram levados ao banho de água fervente por 5 minutos. Os tubos
foram removidos do banho fervente e resfriados em água corrente. Logo em seguida em cada tubo foi
acrescentado 6,5 mL de água destilada e os tubos foram homogeneizados. Por fim, a absorbância foi
lida em um espectrofotômetro à 570 nm.

2. Influência do pH
Em 3 tubos foram adicionados 1,5 mL das soluções de sacarose a 0,2 mol/L em diferentes pHs: 3,6; 5,0
e 8,0. Os 3 tubos e o tubo contendo a enzima foram postos em banho à 37º C por 5 minutos. Adicionou-
se 0,5 mL de enzima a cada um dos 3 tubos. Depois os tubos foram incubados a 37º C por 15 minutos
e se adicionou 1 ml de DNS, em cada tubo. Retirou-se os tubos do banho e estes foram levados ao banho
de água fervente por 5 minutos, e depois os tubos foram resfriados em água corrente. Nos tubos foram
adicionados 6,5 mL de água destilada e foram homogeneizados. Em seguida se observou a coloração
dos tubos.

3. Influência da Temperatura
Adicionou-se em 3 tubos 1,5 mL da solução de sacarose a 25 mmol/L em tampão acetato (pH 5,0). Os
3 tubos com a solução de sacarose e o tubo contendo a enzima foram postos em suas respectivas
temperaturas (4, 37 e 100° C) por 5 minutos. Em seguida se adicionou 0,5 mL de enzima a cada um dos
3 tubos. Os tubos foram incubados, a diferentes temperaturas, por 15 minutos para que a hidrólise
acontecesse: banho de gelo (4º C), banho à 37º C e banho fervente (100º C). 1 mL de DNS foi adicionado
em cada tubo. Retirou-se os tubos imediatamente do banho e estes foram levados ao banho de água
fervente por 5 minutos, que depois foram resfriados em água corrente. Por fim, 6,5 mL de água destilada
foi adicionado e se observou a coloração dos tubos.

IV – Resultados e Discussão
Existem alguns fatores que podem influenciar na ação enzimática como a concentração da enzima,
concentração do substrato, pH, temperatura, entre outros.

1. Influência da Concentração da Enzima e do Substrato

Imagem 5: Variação da Concentração de Substrato

Como a solução de sacarose inicial foi diluída é preciso calcular as novas concentrações em cada
tubo:
Quadro 2: Concentrações de sacarose após a diluição

TUBO 2 TUBO 3 TUBO 4 TUBO 5 TUBO 6 TUBO 7


(g/L) (mg/mL) (mg/mL) (mg/mL) (mg/mL) (mg/mL)
C1V1=C2V2 C1V1=C2V2 C1V1=C2V2 C1V1=C2V2 C1V1=C2V2 C1V1=C2V2
9,5*0,2=C*2,5 9,5*0,4=C*2,5 9,5*1=C*2,5 9,5*1,5=C*2,5 9,5*1,8=C*2,5 9,5*2=C*2,5
C=0,76 C=1,52 C=3,80 C=5,70 C=6,84 C=7,60

O tubo 1 não entrou na listagem pois ele é realizado para efeito de ensaio em branco, o valor lido
neste tubo é descontado nos outros automaticamente pelo programa que realiza a leitura.
Através da curva de calibração presente no roteiro (gráfico 1) é possível calcular a concentração de
glicose. Já que y = 0,2598x – 0,0096, y é substituído pela absorbância lida e x corresponde a
concentração no tubo.

Gráfico 1: Curva de calibração (método DNS)

Quadro 3: Absorbâncias lidas e as respectivas concentrações de glicose

Tubo Absorbância Concentração de glicose


(mg/mL)
1 0,000 0,000
2 0,258 1,030
3 0,475 1,865
4 1,045 4,059
5 1,314 5,095
6 1,362 5,279
7 1,330 5,156

Como a solução foi diluída, calculou-se as reais concentrações de glicose em cada tubo:

Quadro 4: Concentrações reais de glicose em cada tubo

TUBO 2 TUBO 3 TUBO 4 TUBO 5 TUBO 6 TUBO 7


(mg/mL) (mg/mL) (mg/mL) (mg/mL) (mg/mL) (mg/mL)
C1V1=C2V2 C1V1=C2V2 C1V1=C2V2 C1V1=C2V2 C1V1=C2V2 C1V1=C2V2
1,030*9=C*2,5 1,865*9=C*2,5 4,059*9=C*2,5 5,095*9=C*2,5 5,279*9=C*2,5 5,156*9=C*2,5
C=3,708 C=6,714 C=14,61 C=18,34 C=19,00 C=18,56
A partir das concentrações acima é possível calcular a velocidade da reação usando a seguinte relação:

Com os dados de velocidade de formação de glicose, e sabendo-se a concentração de sacarose de cada


tubo é possível construir o gráfico da velocidade de reação versus concentração de substrato (gráfico
3).

Quadro 5: Concentrações de sacarose e as respectivas velocidades de formação

Tubo Concentração de sacarose Velocidade de formação de


(g/L) glicose
(mg/min)
1 0,00 0,0000
2 0,76 0,6180
3 1,52 1,119
4 3,80 2,435
5 5,70 3,057
6 6,84 3,167
7 7,60 3,093

Gráfico 2: Curva de substrato

Vmáx e Km só podem ser calculados quando V0 é medida em função de várias concentrações de substrato.
E para tal determinação é necessário que com estes valores proceda-se com uma transformação
matemática denominada Lineweaver-Bürk, que consiste em inverter os dois lados da equação de
Michaelis-Menten, dando origem a um gráfico de 1/V versus 1/[S], que é uma função do primeiro grau.
A vantagem deste método é a determinação acurada de V máx e Km. Outra característica do gráfico de
Lineweaver-Bürk é que quando a reta intercepta o eixo y tem-se o valor de 1/Vmáx e quando a reta
intercepta o eixo x tem-se o valor de -1/Km.
Gráfico 3: Gráfico de Lineweaver-Bürk

Como já comentado, os valores de 1/Vmáx e -1/Km são definidos nos pontos de interseção da reta com
os eixos y e x, respectivamente. Ou seja, quando x tiver valor igual a zero, a reta estará interceptando o
eixo y e vice-versa. A partir deste princípio, é possível determinar 1/V máx e -1/Km pela equação da reta
do gráfico acima. E, conseqüentemente, os valores de V máx e Km.

Se considerarmos a concentração das moléculas de enzimas, quanto maior for o seu teor, maior será a
velocidade da reação, seguindo proporcionalmente a quantidade suficiente de substratos para reagir
com as enzimas. Conforme a demanda no consumo de reagentes vai ocorrendo, a velocidade da
reação decai gradativamente.[7]

Ao aumentarmos gradativamente a concentração do substrato, a velocidade da reação enzimática


cresce bruscamente no início, porém chega um ponto de saturação das enzimas em que a velocidade
permanece constante, isto é, todas as enzimas estão ocupadas formando complexo com o substrato.
Nesse ponto, a velocidade máxima é atingida e a concentração de substrato não tem mais nenhuma
influência na velocidade da reação. O esquema abaixo e o gráfico 2 representam as situações citadas
acima. [8]
[9]
Imagem 6: Esquema - concentração do substrato.

2. Influência do pH

Imagem 7: Teste - Influencia do pH.

Na imagem acima, é possível observar os resultados dos testes da velocidade catalítica da enzima
invertase em solução tampão de pH 3,6 , 5,0 e 8,0 respectivamente. Foi possível observar que a
enzima teve uma melhor atuação em pH 8,0. Esse resultado não era o esperado para o estudo da
enzima em questão, que deveria apresentar uma melhor atuação em pH 5,0. No entanto, pode-se
considerar que o tipo de fermento utilizado para a sua extração tenha sido o causador dessa
alteração.
A influencia de pH ocorre porque as enzimas são uma espécie de proteínas, que por sua vez,
apresentam cadeias polipeptídicas compostas por aminoácidos. A estrutura tridimensional das
enzimas, portanto, depende das interações entre os aminoácidos com grupamentos laterais
ionizáveis presente na cadeia, cujo o estado de ionização depende do pH do meio. Valores
inadequados do pH podem provocar mudanças conformacionais irreversíveis e consequentemente
causar a perda da atividade catalítica. Dependendo do valor do pH a geometria do sítio ativo pode
ser mais ou menos adequado para o processo catalítico, resultado em variações na velocidade da
reação.
Muitas enzimas interagem com seus substratos através dos grupos ionizáveis de seus sítios ativos e
das moléculas do substrato. Logo, a formação de complexo produtivos dependem da ionização tanto
do sítio catalítico quanto do substrato. Pode-se dizer que os valores de pH influenciam na velocidade
da reação por pelo menos três fatores: conformação do sítio ativado, ionização do sítio ativado e
ionização do substrato.[10]

3. Influência da Temperatura

Imagem 8: Variação de Temperatura

Na imagem acima, é possível observar os resultados dos testes da velocidade catalítica da enzima
invertase em temperaturas de 4°, 37° e 100° C respectivamente. Foi observado que a temperatura de
maior atuação foi a de 100°C.
A temperatura está diretamente relacionada com a velocidade de uma reação química, como explica a
teoria de Arrhenius. Pode-se concluir que o mesmo ocorre com as reações catalisadas por enzima,
pois a variação de temperatura influencia as constantes cinéticas, K M e Vmáx.
Em baixas temperaturas, as reações são mais lentas devido á queda da energia cinética do sistema.
Como as enzimas são proteínas, o aumento da temperatura não apenas aumenta a velocidade, mas
causa efeitos opostos, como por exemplo até determinada temperatura, ocorre aumento de velocidade
de reação a partir de determinada temperatura, há diminuição na velocidade da reação. Esse é o efeito
da desnaturação. Ou seja, a partir de uma determinada temperatura elas perdem a sua função

4. Outras influências
 Concentração das coenzimas e ativadores
As concentrações de coenzimas ou de ativadores produzem variações na atividade enzimática, da
mesma forma que as concentrações de substratos. A velocidade da reação aumenta ligeiramente no
início com o aumento da concentração da coenzima ou do ativador, até um máximo, a partir do qual a
velocidade pode permanecer constante, desde que não haja inibição por excesso de concentração.

 Inibidores
Os inibidores enzimáticos podem ser dos tipos competitivo e não competitivo.
Os inibidores competitivos competem com o substrato, por diferença de concentração, nos lugares de
acoplamento à enzima. Eles não alteram a velocidade máxima da reação entre enzima e substrato, mas
requerem para isso maiores concentrações.
Já os inibidores não competitivos, que não competem com o substrato, alteram a velocidade máxima
da reação, conforme a concentração de inibidor mas não modificam o valor de Km.
A imagem abaixo representa a influência dos inibidores.

Imagem 9: Influência dos tipos de inibidores na reação enzimática[12]

V - Conclusão
Esclarece-se que a concentração do substrato, a temperatura e o pH influenciam na velocidade da
reação. Tanto quantitativamente como qualitativamente. Portanto, para que certa reação seja
catalisada de forma produtiva pela enzima, a solução deve-se encontrar em condições ideias, quem
inclui: ajuste do pH e da temperatura. Mesmo que por algum erro de procedimento a influencia do pH
tenha tido um erro e o pH ótimo foi o pH 8,0.
VI – Bibliografia
[1] - Cisternas, J. R. et al ; Varga, J. ; Monte, O. Fundamentos de Bioquímica Experimental - 2 ed. -
São Paulo: Editora Atheneu, 2001. págs 149 e 151

[2] - <https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Activacao_energia_cinetica_enzimatica.png>

[3] - <http://users.med.up.pt/ruifonte/PDFs/PDFs_arquivados_anos_anteriores/2011-
2012/cinetica_enzimica_2011_vs02.pdf>

[4] - <http://www.ebah.com.br/content/ABAAABKB0AF/atividade-enzimatica>

[5] - <http://www.fcav.unesp.br/Home/departamentos/tecnologia/luciamariacararetoalves/aula-7---
cinetica-enzimatica.pdf>

[6] - <https://es.wikipedia.org/wiki/Cin%C3%A9tica_enzim%C3%A1tica>

[7] - <http://brasilescola.uol.com.br/biologia/enzimas.htm>

[8] - Cisternas, J. R. et al ; Varga, J. ; Monte, O. Fundamentos de Bioquímica Experimental - 2 ed. -


São Paulo: Editora Atheneu, 2001. pág 192

[9] - <http://www.wikiwand.com/pt/Cin%C3%A9tica_enzim%C3%A1tica>

[10] - Pinto, G. F. et al Menezes, R. R. Rio de Janeiro: E-papers, 2009. Pág 280.


[11] - Batista, J. Cinética enzimática. USP. Disponível em
<<www.debiq.eel.usp.br/~joaobatista/aula2cineticaenzimatica.pdf>>.

[12] - <http://gallerily.com/enzyme+kinetics+graph>