Condições essenciais para a vida: Os seres vivos devem ser capazes de: Se auto-replicarem; Catalisarem reações químicas de forma

eficiente e seletiva. As vias

metabólicas são séries de alterações químicas executadas e controladas por enzimas. Propriedades gerais: Estrutura: proteica. Exceção: Ribozimas (ribonucleic
acid enzyme) (núcleos, mitocôndrias e cloroplastos de células eucarióticas). Subunidade maior dos ribossomos: ligação de aminoácidos na tradução;
processamento de RNA. A atividade depende da estrutura nativa. Massa molecular: de 12 kDa a mais de 1 milhão de Da. Enzimas: Padrões estruturais mais
comuns: (1) Predomínio de hélices alfa; (2) Estruturas alfa/beta; (3) Estruturas beta antiparalelas. Ainda: Domínios e Estruturas quaternárias. Enzimas: podem
precisar de cofatores: inorgânicos ou orgânicos; íons inorgânicos: Fe 2+, Mg2+, Zn2+, Na+) e/ou cofatores orgânicos = coenzimas; Se a ligação da coenzima é
forte (até covalente): “grupo prostético”; Holoenzima = Apoenzima (inativa) + cofator (e/ou coenzima). /Tabela: Coenzima - Grupo químico transferido -
Precursor da dieta em mamíferos: Biocitina-CO2-Biotina (vit. H, B7 ou B8); Coenzima A (CoA)-Grupos acila-Ácido pantotênico (vit. B5); 5’-
desoxiadenosilcobalamina (vit. B12)-H e grupos alquila-Vitamina B12; Flavina adenina dinucleotídeo (FAD)-elétrons-Riboflavina (vit. B2); lipoato-Elétrons
e grupos acila-Não essencial; Nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD(P))-Íons hidreto (H-)-Ácido nicotínico (niacina) (vit. B3 ou PP); Piridoxal fosfato-
Grupos amina-Piridoxina (Vit. B6); Tetraidrofolato-Grupos de 1 C-Ácido fólico (vit. B9 ou M); Tiamina pirofosfato-Aldeídos-Tiamina (Vit. B1)./A enzima
urease aumenta a velocidade de hidrólise da uréia em pH 8,0 e a 20 °C por um fator de 1014. De que maneira as enzimas aceleram as reações químicas? A
variação de energia livre de Gibbs ΔG tem de ser favorável (menor do que zero).ki = constantes de velocidade; Constante de equilíbrio K’eq = [P]eq / [S] eq;
Variação de energia livre ΔG°' = - R.T.Ln K’eq; R = 8,315 J. mol-1.K-1, T = 298,15 K (25 °C). Equação de Arrhenius: k=(kbT/h)e^(-ΔG*/RT). Variáveis: kB=
constante de Boltzmann = R/NA = 1.380650×10−23 J·K-1; h = constante de Planck = 6.6261 x 10-34 J. s. A maior parte do poder catalítico de enzimas é derivado
da liberação de energia livre na formação de muitas ligações fracas entre a enzima e seu substrato. Essa energia de ligação contribui à especificidade e à catálise.
Interações enzima – substrato: 1) Interações eletrostáticas; 2) Ligações de hidrogênio; 3) Interações de van der Waals: Contatos interatômicos. 4) Interações
hidrofóbicas. As interações fracas são otimizadas no estado de transição da reação; os sítios ativos são complementares aos estados de transição pelos quais
passam quando são convertidos em produtos. Ou seja, não são complementares aos substratos! Enzimas artificiais: ABZIMAS (anticorpos catalíticos: antibody
+ enzyme) Ou CATMABS (catalytic monoclonal antibody, ‘anticorpo catalítico monoclonal’). Especificidade e catálise: O sítio ativo da enzima tem resíduos
com grupos funcionais catalíticos (RC) e resíduos com grupos funcionais de posicionamento (RP). Fatores envolvidos na redução da energia de ativação: –
Redução da entropia (liberdade de movimento): grupos funcionais de posicionamento na enzima; – Alinhamento apropriado de grupos funcionais catalíticos
na enzima. Fatores envolvidos na redução da energia de ativação: – Distorção de substratos (balcão de estiramento). Classificação das enzimas: Em 1961 a
IUBMB (International Union of Biochemistry and Molecular Biology) propôs um sistema de classificação baseado na ação catalítica da enzima, permitindo
representar cada enzima de uma maneira inequívoca. Cada enzima tem: – Nome sugerido, ex: hexocinase – Nome sistemático: ATP-glicose fosfotransferase;
– E.C. 2.7.1.1 (2 = classe das transferases, 7 = sub-classe fosfotransferase, 1 = fosfotransferase com um grupo OH como aceptor). Classes de enzimas: Classe
1: óxido-redutases (E.C. 1): catalisam reações de transferência de elétrons (ex: como hidretos ou hidrogênios): Ex: desidrogenases, oxidases, redutases,
peroxidases. Coenzimas de óxido-redutases: 1. Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo NAD+ + 2 e- + 2H+ → NADH + H+ (transporta 2 e- como íon hidreto H-)
2. Flavina Adenina Dinucleotídeo FAD + 2 e- + 2 H+ → FADH2 (transporta 2 e- como 2 H). Classe 2: transferases (E.C. 2): catalisam reações de transferência
de grupos funcionais de uma molécula a outra. Ex: transaminases, transmetilases, transcarboxilases, cinases. Classe 3: hidrolases (E.C. 3): catalisam reações
de hidrólise: Ex: proteases, nucleases, lipases, amilases, esterases, fosfatases; São as enzimas de maior Interesse comercial. Classe 4: liases (E.C. 4): catalisam
reações de remoção de grupos deixando duplas ligações, ou fazem a adição a duplas ligações. Ex: descarboxilases, hidratases, desaminases, sintases. Classe 5:
isomerases (E.C. 5): catalisam rearranjos intramoleculares. Ex: epimerases, racemases, mutases. Classe 6: ligases (E.C. 6): catalisam a ligação de dois substratos
acoplada com a hidrólise de ATP. Ex: sintetases, carboxilases. Mecanismos catalíticos: catálise ácido-básica, catálise covalente, catálise por íon metálico,
interações eletrostáticas, efeitos de orientação e aproximação, ligação ao estado de transição. Grupos catalíticos e sua contribuição com a catálise: 1. Catálise
ácido-básica – Ácida geral: a doação de um H+ diminui a energia do estado de transição – Básica geral: a ligação de H+ diminui a energia do estado de transição
– Ácido-básica. Exemplo de catálise ácido-básica: Hidrólise de p-nitrofenilacetato por imidazol (catálise básica geral). 2. Catálise covalente -Forma-se uma
ligação covalente transitória E-S; sempre participa um grupo nucleofílico. 3. Catálise por íon metálico (1/3 das enzimas = metaloenzimas ou ativadas por
metais). Funções do íon metálico: Orientação do substrato, Estabilização de intermediários com carga, Participação em reações de óxido-redução, Neutralização
de cargas negativas sem alterar o pH. Exemplo: a anidrase carbônica catalisa a reação: CO2 + H2O → HCO3- + H+. Outros fatores que contribuem: 4. Interações
eletrostáticas, Distribuição de cargas ao redor do sítio ativo, Cargas na superfície, Eliminação da H 2O do sítio ativo; 5. Efeitos de orientação e aproximação;
6. Ligação ao estado de transição. Cinética enzimática: E+S ↔ ES → E+P. Ks = constante de Dissociação do Complexo de Michaelis ou enzima-substrato
(ES). Ks=(k-1)k1 = [E][S]/[ES]. As determinações cinéticas usam a “taxa inicial da reação” vo. Vo=Δ[P]/Δt, [S]<5% ~ [S]-[ES]~ [S] (consumido). Suposições
iniciais de Michaelis e Menten: k2 << k-1. Vo=k2[ES], vo é determinado pela quebra de ES para liberar o produto P, porém é difícil medir [ES]. Equação de
Michaelis-Menten: v= Vmax [S]/(Km + [S]. Equação para enzimas alostéricas cooperativas (h>1): V= (Vmax [S]^h)/([S]^h + K0,5^h). A constante de Michaelis
Km representa a [S] com a qual e enzima se encontra 50% saturada e portanto Vo=Vmax/2 (Vo=50% da Vmax). Se [S] = Km, então: Vmax[S]/(Km+[S]) =
Vmax/2[S] = Vmax/2. Concentrações baixas de substrato: ocorre aumento linear entre Velocidade (V0) e o Substrato [S]. Aumento de [S] → V0 aumenta cada
vez menos até atingir um patamar (Vmax). Km: Para uma enzima que usa diferentes substratos, varia com o substrato; Para diferentes enzimas que usam o
mesmo substrato, elas têm Km diferentes; Depende também das condições experimentais (temperatura, pH, etc.). Frequentemente a concentração molar da
enzima não é conhecida; podemos calcular: U = Unidade de enzima: é a quantidade de enzima que catalisa a formação de 1 µmol de produto por minuto em
uma dada condição experimental (em geral nas condições ótimas de medida); katal = quantidade de enzima que catalisa a formação de 1 mol de produto por
segundo (SI de unidades) (1 katal = 6 x 107 U). Número de transformação: kcat: é o número de moléculas de substrato transformadas por unidade de tempo
quando vo=Vmax.. Quando [S] é saturante, Vmax = k2 [ET] e k2 = kcat = Vmax/[ET]. Eficiência catalítica: v= Vmax[S]/(Km+[S]) → Vmax+kcat[Et] →
v=kcat[Et][S]/(Km+[S]). Se [S]<<Km, [ET]~[E] e portanto: v=(kcat/Km)[E][S]; kcat/Km = k1k2/(k-1+k2). k1>= kcat/Km~1.10^9/Ms. Fatores que influenciam
um ensaio enzimático: pH; Temperatura; Tampão; Cofatores; Inibidores / ativadores; Outros substratos; Efeitos alostéricos; Agentes estabilizantes (detergentes,
sais, agentes redutores, etc.). Caracterização de enzimas: Efeitos do pH: (1) ligação do substrato à enzima, (2) O estado de ionização dos resíduos envolvidos
na ação catalítica, (3) A ionização do substrato, (4) Efeitos sobre a estrutura proteica (em geral nos extremos de pH). Efeitos da temperatura: Nem todas as
enzimas são mais estáveis a 0 °C. Ex: a piruvato carboxilase é sensível ao frio e estável a 25 °C; Ciclos de congelamento/descongelamento para algumas
enzimas causa danos irreversíveis. Se esse for o caso, a adição de glicerol ou pequenas quantidades de dimetilsulfóxido (DMSO) antes do congelamento pode
melhorar a estabilidade. Temperatura ótima: No caso de enzimas microbianas, elas são classificadas de acordo com seu comportamento face à temperatura:
Psicrofílicas; Mesofílicas; Termofílicas; Hipertermofílicas.
Cinética enzimática As determinações cinéticas usam a “velocidade ou taxa inicial de reação” vo. Ensaios contínuos: o progresso da reação é monitorado
continuamente. Ensaios descontínuos: são retiradas amostras da solução a intervalos de tempo predeterminados, e o progresso da reação é analisado. Tipos de
ensaios: Ensaios diretos: medição direta da quantidade de substrato ou produto em função do tempo (Ex: Ensaio direto da atividade da citocromo c oxidase).
Ensaios indiretos: quando o substrato ou o produto não produzem um sinal adequado à medição das suas concentrações, mas a produção de produto pode ser
acoplada a uma segunda reação, não enzimática, produzindo um sinal conveniente (Ex: ensaio para celulase medindo a liberação de açúcares redutores (glicose)
a partir da degradação da celulose (papel)). Ensaios acoplados: a reação de interesse é acoplada a uma segunda reação enzimática, a qual pode ser
convenientemente medida (Ex:. glucose+ ATP →hexocinase→glucose-6-P + ADP; glucose-6-P → G6P desidrogenase → 6-P-gluconato + NADPH. Cálculo
da Vo: Vo em µmol de produto liberado por minuto: [(dA/dt)/ɛ] . Vf . (Vt/Vs) . 1000*. Vf=volume final no ensaio, Vt=volume total da amostra, Vs=volume
da alíquota usada no ensaio, ɛ = coeficiente de extinção molar (mol-1 L ou M-1) tirado da reta de calibração (inclinação). O que são Isoenzimas / isozimas?
Definição: São enzimas que cumprem a mesma função, porém têm sequência primária diferente, e portanto propriedades cinéticas também diferentes (Vmax,
Km, kcat, eficiência catalítica). Isoenzimas terão diferenças no seu E.C. apenas no último número. Exemplo clássico: Lactato desidrogenase (LDH). Inibição
de enzimas • Inibidor: substância que interfere com a catálise, deixando-a mais lenta ou inibindo-a por completo. Temos dois tipos: – Reversível • Competitiva
• Incompetitiva • Mista – Irreversível. Inibição reversível: A) inibição competitiva, Ex: Inibição competitiva da Succinato desidrogenase (SDH) por malonato.
Usos em terapêutica (exemplos): Sulfanilamida (infecções bacterianas); 6-mercaptopurina (leucemia); 5-fluorouracila (tumores); Metotrexato (leucemia);
AZT ou 3’-azido-2’-desoxitimidina (AIDS); Sildenafil ou Viagra(C) (disfunção erétil); Etanol (intoxicação por metanol); Captopril / Enalopril (hipertensão);
Ibuprofeno (analgésico e anti-inflamatório). B) inibição incompetitiva. C) Inibição mista. Inibição irreversível: Característica: inibidores irreversíveis ligam-se
covalentemente ou destroem um grupo funcional essencial para a enzima. Exemplos: Hg e Pb, reagindo com tióis de Cisteínas; Cianeto (reage com íons
metálicos: Fe, Zn, Cu); Sarin, DIFP* (reagem com Serinas); Parathion (inibe a acetilcolinesterase); (*) Diisopropilfluorfosfato. Exemplos: Dissulfiram =
Antietanol® = Antabuse® (inibe a acetaldeído desidrogenase no tratamento do alcoolismo); Sintomas no caso de ingerir etanol: Vermelhidão no rosto, pescoço
e peito, por vasodilatação induzida pela Histamina; Dores de cabeça palpitantes, náuseas, vômitos, diarreia, dores abdominais; Fraqueza, tonturas, confusão,
ansiedade; Vertigem e ataxia; Hipotensão quando em pé; Diaforese (suor excessivo); Palpitações e arritmias; Coceira. Podem ser usados para mapear os resíduos
essenciais do sítio ativo. Regulação de enzimas: Quais são reguladas? Primeira enzima de uma via metabólica (enzima marcapasso); A que catalisa um passo
irreversível. Como regular? Disponibilidade da enzima; Síntese; Degradação; Modificação covalente; Por clivagem; Por ligação covalente (fosforilação);
Regulação alostérica. Disponibilidade da enzima: Síntese: modelo lac-operon (E. coli), Na ausência de lactose (substrato), a lactase não é sintetizada; a lactose
libera a proteína repressora para transcrição do gene da lactase. Disponibilidade da enzima: Degradação pelo sistema proteassoma-ubiquitina. Modificação
covalente Irreversível A) Ativação de pró-enzimas por clivagem Pró-enzimas: são enzimas sintetizadas em forma inativa, que precisam ser ativadas.
Zimogênios: são as próenzimas de peptidases. Isso ocorre, por exemplo, com todas estas proteases pancreáticas que agem no intestino delgado: Tripsinogênio
→ tripsina; Quimotripsinogênio → quimotripsina; Pró-carboxipeptidase → carboxipeptidase; Pró-elastase → elastase. Células exócrinas pancreáticas:
Centroacinares e Basófilas. Modificação covalente reversível: B) Regulação por fosforilação (tipo mais comum). Resíduos alvo: Ser, Thr, Tyr. Enzimas:
proteína-cinases (fosforilação) proteína-fosfatases (remoção do fosfato). Regulação alostérica: Permite o ajuste de vias metabólicas por metabólitos situados
“adiante” ou “anteriores” à enzima regulada, às vezes provenientes de outros compartimentos subcelulares; Temos modulação homotrópica (em geral em
enzimas com estrutura quaternária) e heterotrópica (enzimas monoméricas e multiméricas); Modulação homotrópica: semelhante ao que a gente viu para a
hemoglobina: ligação cooperativa do substrato; Modulação heterotrópica: moduladores negativos (inibidores) e positivos (ativadores). Na equação modificada
para enzimas alostéricas, “h” simboliza a cooperatividade* e K0,5 ~ Km; O que acontece com enzimas alostéricas monoméricas e oligoméricas? V= (Vmax
[S]^h)/([S]^h + K0,5^h). (h = 1 para enzimas não cooperativas). Sistemas K: os moduladores alteram a K0,5 (~Km) à esquerda ou à direita; os estados T e R
têm afinidade diferente pelo S. Sistemas V: os moduladores alteram a Vmax (aumentam ou diminuem) R e T têm afinidade semelhante por S, porém afinidade
diferente por A e I, e eficiência catalítica diferente. Moduladores alostéricos se ligam a sítios alostéricos. Exemplo: Regulação simultânea da glicogênio sintase:
alostérica e covalente.

LISTA DE EXERCÍCIOS COM RESPOSTA 1.Qual será a relação entre Vo e Vmax se [S]=4.Km? R: Se [S]=4.Km, então a equação de MichaelisMenten
fica: Vo=(Vmax .4Km)/5Km, e v/Vmax=4/5 = 0,8 ou 80% da Vmax. 2. Se a velocidade máxima de uma enzima é de 100 μmoles/min e seu Km=2.103 M,
qual será a velocidade inicial quando [S]=20mM? R: Vo=(100.20)/(2+20)=90,9 mmoles/min (observe que deve usar a [S] e Km na mesma unidade). 3. O
que acontece à velocidade de uma reação enzimática se: a) duplicarmos a concentração da enzima na condição de [S]>>Km? R: Duplica, uma vez que
a velocidade é proporcional à [E], mais precisamente na forma de complexo [ES]; Vo = k2 [ES] = kcat [ES]. A concentração de substrato é suficiente para
garantir esse comportamento. b) duplicarmos a concentração de substrato em duas condições: [S]=1.103mM e [S]=5mM para uma enzima que apresenta
Vmax=10mM/s e Km=5mM? Faça o cálculo usando a equação de Michaelis Menten: na primeira condição Vo passa de 2 para 4.103 mM/s (duplica), enquanto
na segunda condição passa de 5,00 para 6,67 mM/s, aumentando apenas 33,4%: 100.(6,675,00)/ 5,00. 5. A Km de uma enzima por um substrato é 1.104 M.
Em uma concentração de substrato de 0,2 M, a velocidade é de 43 mM/min para uma dada concentração de enzima. Entretanto, com uma concentração
de substrato de 0,02 M, a velocidade tem praticamente o mesmo valor. a) Mostre que esta observação sobre V é precisa. b). Qual seria a melhor faixa
de [S] para a determinação de Km? a) Aplique a equação de MichaelisMenten: Vo=(43 mM/min.0,2 M)/(1.104 M+0,2 M)=42,98 mM/min. Depois:
Vo=(43mM/min.0,02M)/(1.104M+ 0,02 M)= 42,79 mM/min. Se você comparar a concentração em qualquer uma das situações, verá que ela é bem maior a
Km. Nessa condição você deve estar praticamente na Vmax, como o cálculo confirmou. b) A melhor faixa de concentrações de substrato para esse cálculo deve
ter a menor concentração abaixo de Km, indo até aproximadamente 10 vezes este valor. Pode usar o “gráfico direto” para estimar Km. 7. Se [S] << Km a
equação de Michaelis Menten é simplificada para: Vo = Vmax/Km [S]. Como podemos calcular a eficiência catalítica nessas condições? Lembremos
que Vmax = k2.[Et] = kcat.[Et]. Assim, teríamos que Vo.Km = kcat.[Et].[S], então kcat/Km = Vo/([Et].[S]) 9. Forneça: a. a classe e o primeiro dígito do
E.C. (Enzyme Commission) das enzimas que catalisam as seguintes reações: a) OOCCHOHCH2OPO3 2↔ OOCCHOPO3 2CH2OH (3fosfoglicerato
e 2fosfoglicerato) Veja que a enzima catalisa a transferência de um grupo fosfato do carbono 3 para o 2; logo tratase de uma isomerase, classe 5. b) H2NCONH2
+ H2O ↔ 2NH3 + CO2 (ureia e amônia) Neste caso a enzima catalisa uma hidrólise: é uma hidrolase, classe 3. c) OOCCH2CH2COO+ FAD ↔ OOCCH=
CHCOO+ FADH2 (succinato, coenzima e fumarato) Aqui temos a participação da coenzima FAD e uma oxidação, logo a enzima é uma óxidoredutase,
classe 1. d) OOCCH= CHCOO+ NH4 ↔ OOCCH2CHNH2COO+ H+ (fumarato, amônio e L-aspartato) Neste exemplo temos que a enzima age sobre
uma dupla ligação fazendo uma adição; temos uma liase, classe 4. 10. a. Para uma enzima que obedece a cinética de MichaelisMenten, qual seria a Vmax
em moles/min se Vo=35 μmoles/min quando [S]=Km? Se a [S]=Km, nessa concentração de substrato temos metade da Vmax; logo, esta será 70
mmoles/min. b. Qual seria a Km desta enzima se v= 40 μmoles/min quando [S]=2.105M? Vo=(Vmax .[S])/(Km+[S]) => Vmax .[S]/V=Km+[S] => (Vmax
.[S]/V) [ S]=Km = 1,5.105M c. Se I é um inibidor competitivo da enzima com um KI de 4.105M, qual seria o valor da velocidade inicial quando
[S]=3.102M e [I]=3.105M? Nessa condição a Km aparente será igual a: Km ap=a.Km= (1+[I]/Ki).Km, sendo o valor de =1,75; logo, Vo = (70
mmoles/min.3.102M)/(( 1,75.1,5.105M)+ 3.102M)= 69,9 mmoles/min.. f. Que valor teria a velocidade inicial dessa enzima não cooperativa quando [S]
fosse de 1.105 M? e qual seria a velocidade inicial de uma enzima alostérica cooperativa com os mesmos valores de Vmax e K0,5 (~Km), tendo cooperatividade
= 2,0? Aplicase a equação abaixo, que é a mesma equação de MichaelisMenten: se a enzima não é cooperativa, h=1. v=(Vmax.[S]h)/(K0,5 h+[S]h) Não
cooperativa1: Vo = (70 mmoles/min.1.105 M)/(1.105M+ 1,5.105M) = 28 mmoles/min. Alostérica e cooperativa: Vo = (70 mmoles/min.(1.105
M)2)/[(1,5.105M) 2+(1.105M) 2] = 21,5 mmoles/min. 11. Que transformações são necessárias para passar as velocidades dos exercícios acima para: (a)
Unidades Internacionais (U) e (b) Katal? A U é a quantidade de enzima que libera 1mmol de produto/min, enquanto o Katal referese a 1 mol de
produto/segundo. Para transformar os exemplos fornecidos para U ou Katal, adapte as unidades fazendo as conversões; por exemplo, se o valor fornecido estiver
em milimoles/min, multiplique o valor por 1.000 para calcular em micromoles/min (U). Se o valor estiver em segundos, divida por 60 para a mesma
transformação, etc.