2

Caracterização de um (Bio-)catalisador
Resumo
As enzimas são uma classe de macromoléculas com a capacidade de se ligar a pequenas moléculas
e de efetuar reações. Forças estabilizadoras, como apenas efeitos hidrofóbicos
dominar ligeiramente as forças desestabilizadoras, como as forças coulombianas de polaridade
igual;
assim, a entalpia livre de formação de proteínas de Gibbs, ∆Gformação, é apenas fracamente
negativo.
Em uma reação enzimática, a enzima E inicialmente livre e o substrato S livre em seus respectivos
estados fundamentais inicialmente combinam-se reversivelmente formando uma enzima-substrato
(ES).
complexo. O complexo ES passa por um estado de transição, ∆Gtr,cat, a caminho de
o complexo enzima-produto (EP) e depois para o estado fundamental da enzima livre
E e produto livre P. A partir da formulação da sequência de reação, uma lei de velocidade,
contendo adequadamente apenas observáveis em termos de concentrações, pode ser derivado.
Na catálise enzimática, a lei de primeira linha foi escrita em 1913 por Michaelis e Menten;
portanto, a cinética correspondente é chamada de mecanismo de Michaelis-Menten.
A lei de taxa de acordo com Michaelis-Menten apresenta cinética de saturação em relação ao
substrato (ordem zero em alta, primeira ordem em baixa concentração de substrato)
e é de primeira ordem em relação à enzima.
Marcos importantes na racionalização da catálise enzimática foram o conceito de chave e fechadura
(Fischer, 1894), o postulado de Pauling (1944) e o ajuste induzido.
(Koshland, 1958). O postulado de Pauling afirma que as enzimas derivam sua função catalítica
poder da estabilização do estado de transição; o postulado pode ser derivado da teoria do estado de
transição e da ideia de um ciclo termodinâmico. A equação de Kurz, kcat/kuncat
≈ KS/KT, é considerada a forma matemática do postulado e dos estados de Pauling
que os estados de transição, no caso de uma catálise bem-sucedida, devem vincular muito mais
firmemente à enzima do que aos estados fundamentais. As consequências da equação de Kurz
incluem os conceitos de concentração efetiva para reações intramoleculares, cooperação de
numerosas interações entre cadeias laterais de enzimas e moléculas de substrato e controle
difusional como limite superior para uma taxa enzimática.
As enzimas demonstram acelerações de taxa (razões kcat/kuncat) de ≤ 1,4 · 1017 e
proficiências [kcat/(kuncat KM) (= 1/KT)], de ≤ 1023 m–1. Surpreendentemente, para uma série de
reações enzimáticas, kcat está dentro de duas ordens de grandeza, enquanto kuncat varia de acordo
com
mais de seis ordens de grandeza; as maiores acelerações de taxa são observadas para
reações com baixo kuncat
Cada (bio)catalisador pode ser caracterizado pelas três dimensões básicas de mérito –
atividade, seletividade e estabilidade – conforme caracterizado pela frequência de rotatividade (tof)
(= 1/kcat), razão enantiomérica (valor E) ou pureza (e.e.) e ponto de fusão (Tm) ou
constante de taxa de desativação (kd). As dimensões de mérito importantes para determinar, avaliar
ou otimizar um processo são (i) rendimento do produto, (ii) produtividade do (bio)catalisador, (iii)
estabilidade do (bio)catalisador e (iv) produtividade do reator. As quantidades pertinentes são
número de faturamento (TON) (= [S]/[E]) para (ii), número de faturamento total (TTN)
(= produto molar/catalisador molar) para (iii) e rendimento espaço-tempo [kg (L · d)–1] para iv).
Os valores limite para um bom desempenho do biocatalisador são kcat > 1 s–1, E > 100 ou
e.e. > 99%, TTN > 104
–105
e chiqueiro. > 0,1 kg (L·d)–1.
2.1
Caracterização da Catálise Enzimática
2.1.1
Base da atividade das enzimas: o que é catálise enzimática?
As enzimas são uma classe de macromoléculas multifuncionais e multivalentes com a capacidade
de se ligar a pequenas moléculas e, muito mais importante, de subsequentemente efetuar
reação. Forças estabilizadoras, como efeitos hidrofóbicos (Tanford, 1961), apenas ligeiramente
dominar forças desestabilizadoras, como as forças coulombianas de polaridade igual; Assim, o
A entalpia de formação livre de Gibbs, ∆Gformação, é fracamente negativa. Sem exceção, as
enzimas são proteínas e consistem em uma ou mais cadeias lineares de, com raras
exceções, os 20 aminoácidos proteinogênicos comuns. As ligações dissulfeto bastante frequentes
entre as cisteínas são formadas através da reticulação de interações da cadeia lateral, mas não
constituem ramificação da cadeia principal. Extremamente raramente,
um 21º aminoácido geneticamente codificado adicional é encontrado, como a selenocisteína em
formato desidrogenase ou glutationa peroxidase (Chambers, 1986; Zinoni, 1986),
ou pirrolisina, o “22º” aminoácido, em metanógenos (pertencente ao domínio
de archaea (Capítulo 3; Hao, 2002; Srinivasan, 2002), ou p-fluorofenilalanina em um
célula de E. coli redesenhada (Mehl, 2003). Todos os três exemplos usaram um códon de parada
para codificar
para o aminoácido incomum.
Aminoácidos não proteinogênicos são encontrados muito mais comumente em proteínas não
enzimáticas. Um exemplo proeminente é o colágeno, proveniente da gelatina, que principalmente
consiste em trios de hidroxiprolina-glicina-prolina, nos quais a hidroxiprolina
é gerado via hidroxilação pós-tradução. Outras proteínas além das enzimas
existem que podem ligar substratos e catalisar reações, como anticorpos catalíticos
(Capítulo 18, Seção 18.1;
Pollack, 1986; Tramontano, 1986) ou ribozimas (Capítulo 18, Seção 18.2; Cech, 1986, 1993). Por
outro lado, existem muitas proteínas
que não catalisam nenhuma reação e, portanto, não são enzimas, mas funcionam como oxigênio
unidades de armazenamento e transporte (hemoglobina e mioglobina), receptores (proteínas de
transdução de sinal, como o receptor EGF) ou como proteínas estruturais (mielina).
2 Caracterização de um (Bio-)catalisador
21
2.1.1.1 Reação enzimática em um diagrama de coordenadas de reação
A ideia de uma reação enzimática que consiste em uma etapa de ligação e uma etapa subsequente
a etapa de reação é incorporada em um diagrama de coordenadas de reação de entalpia livre (∆G –
ξ)
representando a mudança na entalpia livre de Gibbs ∆G ao longo da extensão da reação ξ (zeta)
(Figura 2.1). Numa reação não catalisada, um ou mais substratos ou reagentes estão inicialmente em
seus respectivos estados fundamentais; durante a reação, os reagentes passam
o ponto de máxima entalpia livre ∆Gtr,uncat, denominado “estado de transição”, e
continue até o estado fundamental do(s) produto(s).
Em uma reação enzimática, a enzima E inicialmente livre e o substrato S livre também são
em seus respectivos estados fundamentais. Do estado fundamental, enzima e substrato
combinam-se reversivelmente em um complexo enzima-substrato (ES). Se [S] > KM, o complexo
ES forma um “intermediário”, ou seja, um mínimo local de entalpia livre. (Se [S] < KM,
a entalpia livre do complexo ES é superior ao estado fundamental da enzima; no
[S] = KM, ambos os níveis de entalpia livre são iguais.) O complexo ES passa
outro estado de transição, ∆Gtr,cat, a caminho do complexo enzima-produto (EP)
e então para o estado fundamental da enzima E livre e do produto P livre.
O máximo da entalpia livre de Gibbs entre os estados fundamentais do substrato
e o produto forma a entalpia de ativação livre de Gibbs com a diferença de energia
∆G≠
, que determina a constante de velocidade da reação. Como todo catalisador, um
enzima diminui o valor de ∆G≠
e assim acelera a reação. (Um agente
aumentando o valor de ∆G≠
é denominado “anticatalisador”.)
2.1.2
Desenvolvimento de Cinética Enzimática a partir de Ligação e Catálise
A partir da ideia da cinética enzimática como uma etapa de ligação e reação com o
curso correspondente da curva de energia no diagrama de coordenada de entalpia-reação livre de
Gibbs (∆G – ξ), o esquema de reação representado pela Eq. (2.1) pode ser desenhado.
2.1 Caracterização da Catálise Enzimática
22
E + S ⇔ ES → EP → (⇔) E + P (2.1)
Entre as diversas maneiras de verificar ou refutar tal esquema de reação (Capítulo 9, Seção 9.2), a
derivação de uma lei de taxas ligando uma taxa de formação de produto ou
taxa de consumo de substrato com concentrações pertinentes de reagentes, produtos,
e agentes auxiliares, como catalisadores, provavelmente têm a maior utilidade, já que a conversão
em produto pode ser prevista. Uma lei de taxa adequada contém apenas observáveis, e
sem intermediários ou outros parâmetros não observáveis. Na catálise enzimática, o primeiro
lei de taxa foi escrita em 1913 por Michaelis e Menten (a cinética correspondente
é, portanto, apropriadamente chamado de mecanismo Michaelis-Menten (MM)).
Os esquemas cinéticos para a descrição das reações enzimáticas são semelhantes aos
para catálise homogênea e heterogênea e foram desenvolvidos aproximadamente simultaneamente.
Na catálise heterogênea, um mecanismo que postula uma reação
de uma molécula de substrato móvel em uma superfície sólida é modelada por uma lei de taxa
denominada
depois de Langmuir e Hinshelwood, e mais tarde também depois de Hougen e Watson (Hougen,
1947) (LHHW). LHHW e MM assumem um número limitado de sites ativos
que pode ser saturado com moléculas reagentes de uma fase contínua.
O esquema cinético de acordo com Michaelis-Menten para uma reação de um substrato
(Michaelis, 1913) assume três possíveis etapas elementares de reação: (i) formação
de um complexo enzima-substrato (complexo ES), (ii) dissociação do complexo ES
em E e S, e (iii) reação irreversível ao produto P. Neste esquema, a etapa de formação do produto de
ES para E + P é assumida como limitante da taxa, de modo que o complexo ES é modelado para
reagir diretamente à enzima livre e à molécula do produto,
que se presume se dissociar da enzima sem a formação de um complexo enzima-produto (EP) [Eq.
(2.2)].
E + S ⇔ ES → E + P (2.2)
Na derivação segundo Michaelis e Menten, associação e dissociação
entre a enzima E livre, o substrato livre S e o complexo enzima-substrato ES
são considerados em equilíbrio, KS = [ES]/([E] · [S]). [A derivação de Briggs-Haldane (1925),
baseada na suposição de um estado estacionário, é mais geral; consulte o Capítulo 5, Seção 5.2.1.]
Com esta suposição e um balanço de massa sobre todas as enzimas
componentes ([E]total = [E]livre + [ES]), a lei de taxas na Eq. (2.3) pode ser derivada.
v = vmax[S]/(KM + [S]) = kcat[E]total [S]/(KM + [S]) (2.3)
Em contraste com [E]livre, [E]total é observável. Eq. (2.3) é escrito com KM, o Michaelis
constante, em vez da constante de ligação de equilíbrio KS; a menos que a reação enzimática seja
muito rápida (Seção 2.3.3.); ou seja, em quase todos os casos, KM ≈ KS. Na equação (2.3), o
a taxa de reação é tradicionalmente denotada por v [concentração/tempo] e kcat é a constante da
taxa de reação [tempo–1]. A equação descreve uma cinética de dois parâmetros, com um
taxa de reação aumentando monotonicamente em relação à concentração de substrato e saturação
em alta concentração de substrato. A taxa máxima de reação na saturação é
denotado por vmax, com vmax = kcat[E]. O valor KM corresponde ao substrato
2 Caracterização de um (Bio-)catalisador
23
concentração na meia saturação (vmax/2) e é uma medida da afinidade de ligação do
substrato para a enzima: um valor alto de KM corresponde a ligação fraca, e um valor baixo
valor para ligação forte entre enzima e substrato. Em baixa concentração de substrato, mais
precisamente se [S] KM, Eq. (2.3) simplifica para v = vmax[S]/KM e consequentemente é de
primeira ordem em relação à concentração de substrato [S]. Em contrapartida, em
alta concentração de substrato, mais precisamente se [S] KM, Eq. (2.3) simplifica para
v=vmax e, conseqüentemente, é de ordem zero em relação a [S]. Em todas as situações, v é
proporcional (primeira ordem em relação) a [E].
2.2
Fontes e razões para a atividade das enzimas como catalisadores
2.2.1
Cronologia das teorias mais importantes da atividade enzimática
Apenas um ano após a hipótese de Ostwald sobre a existência de catalisadores em 1893,
quando ninguém ainda tinha uma ideia clara da estrutura e composição das enzimas,
Emil Fischer expressou pela primeira vez a ideia de que uma molécula de substrato se encaixa no
bolso de uma enzima, a “hipótese da fechadura e chave” (Fischer, 1894). Tanto a fechadura
(enzima), bem como a chave (substrato) eram consideradas rígidas .
Esta hipótese foi modificada posteriormente de várias maneiras. De acordo com Haldane (1965),
a catálise de uma reação ocorre apenas se um catalisador no centro ativo for complementar
para o estado de transição do substrato durante a reação. Portanto, a transição
O estado entre substrato e produtos cabe melhor em uma bolsa próxima à enzima.
A molécula do substrato está sujeita a tensão ao se ligar ao centro ativo e
muda sua conformação para caber no centro ativo; a chave (o substrato) faz
não cabe completamente na fechadura, mas está tenso e dobrado.
Numa modificação adicional deste conceito, uma reação é acelerada se um catalisador
estabiliza o estado de transição; em contraste, a estabilização do estado fundamental leva a
uma desaceleração da reação. Este conceito de estabilização do estado de transição, formulado
primeiro por Haldane, foi expandido mais tarde por Linus Pauling (Pauling 1946, 1948).
A noção de redução de ∆G≠
 atribuído à estabilização do estado de transição
pelo catalisador ou à desestabilização do estado fundamental em comparação com o
estado de transição é geralmente aceito hoje em dia.
Em vez de assumir uma enzima “sólida”, em cujo centro ativo a molécula do substrato é “curvada”
(o conceito de deformação do substrato), a ideia foi desenvolvida (Koshland
1958, 1966) que as enzimas podem abraçar a molécula do substrato de forma flexível no ativo
reação de centro e efeito pela formação de interações específicas, as chamadas
“ajuste induzido”. Este quadro é especialmente apropriado com enzimas ativadas alostericamente
ou em situações em que parte da molécula da enzima precisa girar ou se mover.
em distâncias mais longas para efetuar a catálise (movimento da dobradiça), como por exemplo
com a maioria
Enzimas dependentes de NAD(P)(H) (Stillman, 1999).
Uma equação para a aceleração da taxa de reação por um catalisador deliberado e
a força relativa da ligação ao estado de transição e ao estado fundamental foi para 2.2 Fontes e
Razões para a Atividade de Enzimas como Catalisadores
24
mulado em 1963 por Kurz, que combinou as ideias do ciclo termodinâmico e
teoria do estado de transição e cujo resultado, não reconhecido por Kurz, pode ser considerado
como
uma quantificação do postulado de Pauling (Kurz, 1963). Apenas alguns anos depois, Jencks
originou a ideia de análogos do estado de transição como inibidores e citou referências em
a literatura (Jencks, 1969). Finalmente, foi observado (Kraut, 1977) que os melhores inibidores de
serina proteases como subtilisina, quimotripsina, tripsina ou elastase
todos levaram a estados de transição geometricamente semelhantes para a reação de hidrólise e
todos
ligado no buraco oxiânion complementar. Todas as quatro proteases pertenciam ao pequeno
número de enzimas cuja estrutura tridimensional era então conhecida.
2.2.2
Origem da Atividade Enzimática: Derivação da Equação de Kurz
A equação chave resultante da aplicação de duas teorias conhecidas, a Born–
O ciclo de Haber e a teoria do estado de transição foram formulados para qualquer catalisador e
sem referência a enzimas (Kurz, 1963); uma boa derivação pode ser encontrada no
artigo de Kraut (1988).
A teoria do estado de transição baseia-se em duas suposições: a existência de um gargalo dinâmico
e um equilíbrio anterior entre um complexo de estado de transição.
e reagentes. Eq. (2.4) resultados, onde k denota a constante de taxa de reação observada,
κ o coeficiente de transmissão e ν a frequência média de travessia da barreira.
k = κ · ν · K≠ (2.4)
Todos os fatores de correção, como tunelamento, retrocruzamento da barreira e solvente
efeitos de atrito são capturados por κ, que está entre 0,1 e 1 para as reações em
solução em questão aqui. A constante de equilíbrio K≠
é expresso por partição
funções, onde o modo normal à coordenada de reação ν é aproximado por
o termo kBT/hν. Na equação resultante. (2.5), ν se anula.
k = κ · (kBT/h) · K≠
′ (2,5)
Observe que K≠
′ não é a constante de equilíbrio termodinâmico e kBT/h não é um
frequência universal para a decomposição dos complexos do estado de transição em
produtos.
O ciclo termodinâmico relevante para discussão adicional é mostrado na Figura 2.2.
Se compararmos a constante de velocidade de primeira ordem para a reação elementar de substrato
único catalisada por enzima ke com aquela para a reação não catalisada ku,
Eq. (2.6) é obtido com a Eq. (2.4).
Figura 2.2 Ciclo termodinâmico (Born-Haber).
E + S E + S≠
KS KT E + P
ES [ES]≠
2 Caracterização de um (Bio-)catalisador
25
ke/ku = (κe · νe · Ke
≠
)/(κu · νu · Ku
≠
) (2.6)
No caso de uma reação enzimática elementar simples, ke é idêntico a kcat. Ao utilizar o ciclo
termodinâmico o quociente das constantes de formação do
estado de transição Ke
≠
/Ku
≠
pode ser equiparado ao quociente das constantes de dissociação para o substrato KS e o estado de
transição KT [Eq. (2.7)].
kcat/ku = (κe · νe · KS)/(κu · νu · KT) (2.7)
Embora apenas alguns dados estejam disponíveis para a comparação de κe · νe e κu · νu, é
assume-se que os dois termos não diferem muito em magnitude, de modo que a Eq. (2.8)
contém aproximadamente companheiro.
kcat/ku ≈ KS/KT (2.8)
Esta é a equação derivada por Kurz, expressa aqui para o caso de uma enzima
reação. A proporção entre reação catalisada por enzima e reação não catalisada kcat/ku ou
kcat/kuncat,
isto é, a aceleração da taxa, muitas vezes atinge ordens de grandeza de 1010 a 1012 (Radzicka,
1995), e no melhor caso até agora 1,4 · 1017 (orotidina monofosfato descarboxi lase, OMPD), o que
se traduz em uma proficiência kcat/(kuncat · KM) de 1023 m–1 (Lee,
1997). Isso ressalta a qualidade das enzimas como catalisadores. Em comparação, o
o melhor valor para a taxa de aceleração de anticorpos catalíticos é 2,3 · 108
(Zhong, 1999),
e os valores típicos são 103
para 105
(Hasserodt, 1999). Radzicka (1995) descobriu que kcat
pois as reações em questão estão frequentemente dentro de uma ou duas ordens de grandeza;
curiosamente, as maiores eficiências são observadas com reações de kuncat muito baixo. Por isso,
Eq. (2.8) significa que os estados de transição, no caso de catálise bem-sucedida, devem ligar-se
muito mais próximo da enzima do que os estados fundamentais; desta forma, a Eq. (2.8) é o
forma matemática do postulado de Pauling (Pauling 1944, 1948). É enfatizado
novamente que a ação das enzimas através da estabilização do estado de transição é
não é um conceito independente, mas é derivado da teoria do estado de transição e do
ideia de um ciclo termodinâmico.
2.2.3
Consequências da Equação de Kurz
A equação de Kurz [Eq. (2.8)] simplificou e canalizou muitas discussões em
enzimologia. Muitas outras explicações sobre a ação enzimática e muitos fenômenos
observado com reações enzimáticas pode ser reduzido à validade da Eq. (2.8), conforme mostrado
nos parágrafos seguintes.
y O princípio da estabilização do estado de transição pode explicar por que muitas enzimas
mostram maior atividade contra moléculas de substrato maiores e estericamente mais exigentes do
que contra moléculas menores. Paradoxalmente, a causa do aumento da atividade foi um aumento
de kcat, e não uma diminuição do valor de KM, ou seja, um aumento máximo
taxa e não uma ligação mais forte ao substrato. Este fenômeno levou ao postula 2.2 Fontes e Razões
para a Atividade das Enzimas como Catalisadores
26
definição de “ajuste induzido”. Mas se o modelo enzimático se ligar mais ao estado de transição
firmemente do que o estado fundamental, pode-se esperar que partes periféricas do
molécula de substrato tem um papel importante para a ligação no estado de transição
mas não necessariamente para a ligação no estado fundamental. Mudanças conformacionais
do modelo enzimático não precisa ser postulado. Frequentemente, no entanto, são observadas
alterações conformacionais durante a ligação e a catálise, que são então
também chamado de “ajuste induzido” por vários autores.
y Os locais exatos de ligação e catálise não podem ser distinguidos com exatidão. Em subtili sin, os
aminoácidos que formam a tríade catalítica, Ser221 – His64 – foram substituídos em
todas as combinações por Ala. Mesmo o triplo mutante sem nenhum aminoácido do
centro catalítico original exibiu uma taxa de reação 1000 vezes maior do que o
reação não catalisada, e o restante da molécula da enzima ligou-se ao
substrato melhor no estado de transição do que no estado fundamental (Carter, 1988).
y As numerosas interações entre cadeias laterais de enzimas e moléculas de substrato
agem sinergicamente, então o ajuste é bastante exato. Esta cooperatividade melhora o substrato
especificidade, pois uma pequena mudança de substrato pode efetuar uma grande mudança na
ligação do estado de transição. A triose fosfato isomerase é apenas 1/1000 tão eficaz
se o resíduo Glu165 for afastado do substrato em até 1 Å, como foi
demonstrado com a troca de Glu165 por Asp165 (Joseph-McCarthy, 1994).
A mudança de apenas um aminoácido da tríade na subtilisina provoca uma atividade
diminuição de 10–6, enquanto a troca de todos os três causa uma diminuição de apenas
7 × 10−7
e não de 10–18 (Carter, 1988). Os resultados parecem ser explicados por uma
situação de tudo ou nada em vez de aditividade.
y As reações intramoleculares ocorrem muito mais rapidamente do que as intermoleculares
devido à estabilização entrópica. Page e Jencks calcularam as entropias de
translação, rotação e vibração (Page, 1971). A perda de entropia dos reagentes
já realizado no complexo enzima-substrato (ES) permite um processo muito mais rápido
reação do que na situação sem complexação, ligação ou orientação geométrica. A introdução de
uma concentração eficaz [S]eff alivia o problema de
comparando resultados de catálise intermolecular com constantes de taxa de dimensão
[concentração·tempo]–1 (reação de segunda ordem) com aquelas de catálise intramolecular com
constantes de dimensão [tempo]–1. Os altos valores frequentemente alcançados para [S]eff
(frequentemente> 10 m) refletem a eficiência da catálise intramolecular. Nesse contexto,
enzimas são frequentemente chamadas de “armadilhas de entropia”, porque muitas contribuições
para
entropia são “congelados” após a ligação do substrato à molécula da enzima.
y Muitos mecanismos de reação enzimática são acelerados ou mesmo apenas possíveis pela
ausência de água ou outros solventes. A enzima suporta desolv ação
redirecionando parte da possível energia de ligação liberada da ligação
entre enzima e substrato.
y Limite superior da constante de velocidade de uma reação enzimática: controle de difusão
2 Caracterização de um (Bio-)catalisador
27
O limite superior da taxa de reação é alcançado quando cada colisão entre
moléculas de substrato e enzima levam à reação e, portanto, ao produto. Nisso
caso, o fator de Boltzmann, exp(–Ea/RT), é igual a 1 na teoria do estado de transição
equações e a reação é limitada por difusão ou controlada por difusão (devido ao
diferença de massa, a reação é controlada apenas pela taxa de difusão do
molécula de substrato). A taxa de reação sob controle de difusão é limitada pela
número de colisões, cuja frequência Z pode ser calculada de acordo com o
Equação de Smoluchowski [Smoluchowski, 1915; Eq. (2.9)].
–dc/dt = –8πRD · c
2 (2,9)
R é o raio normalizado de ambas as partículas participantes (1/r1 + 1/r2), D o coeficiente de difusão
normalizado (1/D1 + 1/D2). A frequência de colisão Z é então calculada a partir da Eq. (2.10).
Z = 2RT/(3000η · [(r1 + r2)
2
/r1r2]) (2.10)
Como a molécula da enzima é muito maior que a molécula do substrato ou do produto
(rE rS) e, portanto, difunde-se muito mais lentamente (DE DS), Eqs. (2.9) e (2.10) podem
ser simplificado para as Eqs. (2.11) e (2.12).
–dc/dt = –8πRDE · c
2 (2.11)
Z = 2RT/(3000η · rE) (2.12)
No caso de uma solução altamente viscosa, a influência da viscosidade η pode dominar
(Eichhorn, 1997). Para partículas simples e sem carga em água a 25 °C, a constante de taxa de
segunda ordem é 3,2 × 109
(m·s)–1 (Gerischer, 1969; Creutz, 1977). Alguns casos
das reações enzimáticas total ou parcialmente controladas por difusão estão listadas na Tabela 2.1.
Rearranjo da Eq. 2.7 resulta na Eq. 2.13.
kcat/KS = (ku · κe · νe)/(κu · νu · KT) (2.13)
Eq. (2.13) é a manifestação da constante de velocidade de segunda ordem para uma reação entre
enzima livre e substrato livre para dar enzima livre e produto livre; por isso,
a constante de taxa não pode exceder o valor máximo para kdiff, ou seja, 3,2 × 109 m–1 ·s−1
.
Enzima do substrato kcat [s–1] KM [M] kcat/KM [s–1 ⋅ M–1]
CO2 ⇔ HCO3
–
Anidrase carbônica 1 × 106
0,012 8,3 × 107
H2O2 Catalase 4 × 107
1.1 4 × 107
fumarato Fumarase 800 5 × 10–6 1,6 × 108
benzilpenicilina β-lactamase 2 × 103
2 × 10–5 1 × 108
Tabela 2.1 Reações enzimáticas total ou parcialmente controladas por difusão (adaptado de Fersht,
1985).
2.2 Fontes e Razões para a Atividade das Enzimas como Catalisadores
28
Uma enzima perfeitamente evoluída apresenta, portanto, uma constante de ligação Ks diminuída,
o que significa uma ligação mais forte no estado de transição, possivelmente até o limite
termodinâmico.
A limitação de uma reação por difusão translacional em solução é bastante rara
caso. Muito mais frequentemente, a limitação da taxa de reação global observada é
por transferência de massa externa (através de um filme laminar em torno de um transportador
macroscópico sólido) (Capítulo 5, Seção 5.5.1) ou transferência de massa interna (difusão de
substrato ou
produto através dos poros de um transportador sólido ou de uma rede de gel até uma molécula
enzimática no interior do transportador) (Capítulo 5, Seção 5.5.2).
2.2.4
Eficiência da catálise enzimática: além do postulado de Pauling
Voltemos mais uma vez à equação de Kurz [Eq. (2.8)], que é considerado como
a quantificação do postulado de Pauling de que a estabilização do estado de transição, ou seja, o
uma ligação mais forte entre a enzima e o estado de transição, expressa por KT, em comparação
com a ligação entre a enzima e o estado fundamental, expressa por KS, é a fonte
de aumento da taxa catalítica.
kcat/kuncat ≈ KS/KT (2.8)
Identificando KS com KM, KT é aproximadamente igual à razão (kuncat · KM)/kcat, que
é o inverso da chamada “proficiência”, que foi determinada experimentalmente
para vários sistemas (ver Seção 2.3.4 abaixo). Se a equação de Kurz capturasse o
toda a essência da catálise enzimática, KT deve ser proporcional a (kuncat · KM)/kcat.
No entanto, a Figura 2.3 revela que a correlação de KT (≡ “KTS”) para alguma enzima
as reações são muito melhores com kuncat (≡ “knon”) do que com kcat (Bruice, 2000).
Figura 2.3 Comparação da relação do KTS com a constante de taxa de reação enzimática,
kcat, e com a solução não catalisada ou constante de taxa de reação de referência knon (Bruice,
2000).
2 Caracterização de um (Bio-)catalisador
29
Esta aparente contradição com o postulado de Pauling e a noção da energia e conformação do
estado de transição como a única fonte de poder catalítico enzimático
moldar a geometria do substrato pronto para interagir com a enzima, ou seja, substrato
pré-organização, para um papel novo e mais importante. Embora a discussão sobre este
O assunto está longe de estar resolvido, surgiu um novo conceito baseado em cálculos de mecânica
molecular da estabilidade de diferentes conformações de substrato, denominados conformadores de
substrato, que enfatizam a pré-organização do substrato. O substrato
conformadores que permitem que as reações ocorram mais facilmente se assemelham claramente ao
estado de transição e são chamados de “quase-atta”.ck conformadores” (NACs) (Bruice, 2000,
2002). O
constatou-se que as constantes de taxa relativa de formação de anidrido krel a partir de ésteres
mono-p-bromofenílicos se correlacionam com as frações molares (P) dos confórmeros do estado
fundamental
que poderiam ser classificados como NACs de acordo com a Eq. (2.14) (Bruice, 2002).
log krel = 0,94 log P + 7,48 (r
2
= 0,915) (2,14)
Os resultados estão representados na Figura 2.4

2.3
Critérios de Desempenho para Catalisadores, Processos e Rotas de Processo
2.3.1
Critérios Básicos de Desempenho para um Catalisador: Atividade, Seletividade e Estabilidade de
Enzimas
Todo catalisador, e portanto também todo biocatalisador, pode ser caracterizado pelos três
dimensões básicas do mérito, nomeadamente atividade, seletividade e estabilidade. Adicional, mas
não são frequentemente empregados, critérios de desempenho além das dimensões básicas são
discutido na Seção 2.3.3.
1. Os biocatalisadores apresentam frequentemente uma seletividade muito melhor do que os
catalisadores não biológicos,
então eles são desenvolvidos para uso devido à sua seletividade, seja enantiosseletividade,
quimio ou regiosseletividade.
2. Como a atividade é simples de medir e necessária de saber até mesmo para os
protocolo experimental básico, a atividade enzimática é frequentemente bem estudada. Em
contraste com
outros catalisadores, a maioria das enzimas só são ativas e estáveis em temperaturas e faixas de pH
muito limitadas (principalmente entre 15 e 50 °C ou pH 5 e 10).
3. Ao contrário da atividade, a estabilidade das enzimas é muitas vezes interpretada de forma
simplista como
estabilidade, isto é, uma temperatura além da qual a enzima perde estabilidade. Embora
esta quantidade é importante, em primeiro lugar, toda declaração de estabilidade a uma determinada
temperatura depende do tempo de exposição e, portanto, é muitas vezes ambígua; e segundo, para
aplicações de processos biocatalíticos, uma quantidade mais importante é o processo ou
estabilidade operacional, que é a estabilidade a longo prazo sob condições específicas.
2.3.1.1 Atividade
O valor da atividade enzimática (geral) é geralmente fornecido em “Unidades Internacionais”
ou “Unidades”:
1 Unidade ≡ 1 UI ≡ 1 U ≡ 1 µmol min–1
Na maioria dos casos, um valor para a actividade global da enzima não é muito interessante.
Muito mais importantes são tanto a atividade específica, dimensionada para a massa do catalisador,
e a atividade volumétrica, baseada na atividade por unidade de volume:
1 U (mg de proteína) –1 = 1 µmol (min mg de proteína) –1 ≡ atividade específica
e
1 U mL–1 = 1 µmol (min mL)–1 ≡ atividade volumétrica
Todos os dados de atividade não têm sentido sem uma especificação das condições de medição.
Connonen, a atividade das enzimas é fornecida em níveis quase fisiológicos
2 Caracterização de um (Bio-)catalisador
31
condições a 30 °C e pH 7,5, salvo indicação em contrário. Qualquer enzima vendida
comercialmente vem com informações sobre as condições detalhadas do ensaio usadas para chegar
à atividade específica (preparação sólida) ou volumétrica (preparação líquida). Para
julgar a qualidade de um biocatalisador, sua atividade específica pode servir como diretriz: o
o limite para um biocatalisador útil é 1 U (mg de proteína pura) –1; o limite para um
biocatalisador desenvolvido para nível de planta, no entanto, está muito mais alto, um pouco mais
próximo
a 100 U (mg de proteína pura) −1
.
A atividade volumétrica de um (bio)catalisador pode ser aumentada pela simples adição de
mais catalisador para um sistema. Contudo, a actividade específica deve ser melhorada através de
otimização das condições de reação, ou através da variação da estrutura do
carreador (Capítulo 5) ou mesmo da enzima (Capítulos 10 e 11).
Uma quantidade de atividade independente da massa, superior à atividade específica, é a frequência
de rotação (tof), definida como:
frequência de rotatividade (tof) = número de eventos catalíticos
tempo número de sites ativos
A frequência de rotação permite a comparação do desempenho entre diferentes sistemas
catalisadores, biológicos e/ou não biológicos. Seu limite é de 1 evento por segundo por site ativo.
De acordo com a definição, a frequência de rotação só pode ser determinada se o número de sítios
activos for conhecido (Capítulo 9, Secção 9.2.3). Para um
reação enzimática obedecendo à cinética de Michaelis-Menten, Eq. (2.15) é válido.
tof = 1/kcat (2,15)
2.3.1.2 Seletividade
A noção de seletividade precisa ser especificada mais detalhadamente: a seletividade pontual é a
seletividade incremental, geralmente em relação ao produto, em um grau específico de conversão,
enquanto a seletividade integral é a seletividade média geral no mesmo grau específico de
conversão. Devido à importância da pureza enantiomérica das moléculas do produto alvo em
aplicações de ciências biológicas e à posição preeminente dos biocatalisadores
desfrutar no que diz respeito à consecução desse objetivo, a enantiosseletividade é a mais
importante tipo de seletividade no contexto da biocatálise.
A razão enantiomérica ou valor E (Chen, 1982) serve como uma medida de seletividade enantio em
um certo grau de conversão (para a derivação de E, ver Capítulo 5,
Seção 5.7) [Eq. (2.16)].
E = (kcat/KM)A/(kcat/KM)B = ln ([A]/[A]0)/([B]/[B]0) (2.16)
Embora o valor E seja medido em um grau específico de conversão, ainda assim
é uma medida de seletividade integral. Isto é ainda mais evidente no caso do
outra medida normalmente empregue, o excesso enantiomérico, e.e. [Eq. (2.17)], que
reflete a seletividade geral até o ponto de isolamento do produto.
e.e. = ([A] – [B])/([A] + [B]) × 100% (2,17)
2.3 Critérios de Desempenho para Catalisadores, Processos e Rotas de Processo
32
O limite para um (bio)catalisador enantiosseletivo é em E = 100 ou em 99% e.e.,
depende decidir se alguém está avaliando a reação em si ou uma reação
produtos. [Esses valores estão vinculados à exigência da Food and Drug Administration dos Estados
Unidos (FDA), o órgão mais importante do mundo para
estabelecendo diretrizes para procedimentos de aprovação de novos medicamentos e avaliação de
desempenho de medicamentos, que um estudo toxicológico separado seja conduzido para qualquer
impureza, incluindo um enantiômero do medicamento ativo, excedendo um nível de concentração
de
0,5% (Capítulo 13).]
Além da enantiosseletividade, a regiosseletividade (Capítulo 12, Seção 12.6) e, em menor grau,
Em certa medida, a quimiosseletividade (Capítulo 7, Seção 7.3.2) também são questões importantes
de seletividade da reação enzimática.
2.3.1.3 Estabilidade
A estabilidade de uma enzima é geralmente entendida como significando estabilidade à
temperatura, embora inibidores, oxigênio, um valor de pH inadequado ou outros fatores, como
estresse mecânico ou cisalhamento, possam influenciar decisivamente a estabilidade (Capítulo 17).
A estabilidade térmica de uma proteína, frequentemente empregada na bioquímica de proteínas, é
caracterizada
pela temperatura de fusão Tm, a temperatura na qual uma proteína em equilíbrio entre as espécies
nativa (N) e desdobrada (U), N ⇔ U, é meio desdobrada (Capítulo 17, Seção 17.2). A temperatura
de fusão de uma proteína é influenciada por um
mão por sua sequência de aminoácidos e o número de pontes dissulfeto e sal
pares e, por outro lado, por solvente, tipo de sal adicionado e concentração de sal adicionado.
Verificou-se que a estabilidade estrutural da proteína também se correlaciona com o Hofmeister
série (Capítulo 3, Seção 3.4; Hofmeister, 1888; von Hippel, 1964; Kaushik, 1999)
[Eq. (2.18)].
Tm = T0 + K[S] (2.18)
Na equação (2.18), T0 é a temperatura de fusão na ausência de sal, [S] a concentração de sal e K o
coeficiente correspondente.
Estabilidade de armazenamento ao longo do tempo sob condições fixas de temperatura, valor de pH
e
a concentração de aditivos muitas vezes pode ser expressa por uma lei de decaimento de primeira
ordem (análoga ao decaimento radioativo) [Eq. (2.19)].
[E]
t
= [E]0 exp(–kd·t) (2.19)
A validade de uma lei de decaimento de primeira ordem ao longo do tempo para a atividade de
enzimas de acordo com a Eq. (2.19), com [E]t
e [E]0 como a concentração de enzima ativa no tempo t ou 0,
respectivamente, e kd como a constante de taxa de desativação, é baseado na adequação de
pensando no processo de desativação de enzimas em termos das estatísticas de Boltzmann.
Essas estatísticas fazem com que um certo número de moléculas de proteínas ativas sejam
desativadas
momentaneamente com uma constante de velocidade proporcional à quantidade de proteína ativa
[para
evidências de tal decomposição “catastrófica”, ver Craig (1996)].
Os critérios de estabilidade relevantes para aplicações de processo (estabilidade do processo ou
estabilidade operacional) são discutidos na próxima seção.
2 Caracterização de um (Bio-)catalisador
33
2.3.2
Critérios de Desempenho para o Processo
Ao avaliar um biocatalisador para uma determinada tarefa de processamento, existem critérios de
desempenho a serem atendidos não apenas para o biocatalisador, mas também para o processo. As
dimensões de
mérito é importante ao determinar, avaliar ou otimizar uma rota para um processo
são (i) rendimento do produto, (ii) produtividade do (bio)catalisador, (iii) estabilidade do
(bio)catalisador, e
(iv) produtividade do reator.
2.3.2.1 Rendimento do Produto
O rendimento químico do produto é mais importante para a economia do processo. O rendimento do
produto é inversamente proporcional à quantidade de reagentes necessários por unidade de
saída do produto. Como o substrato principal e outras matérias-primas na maioria dos processos
maduros representam mais de 50% do custo variável, um elevado rendimento do produto é
indispensável para um processo económico. O rendimento do produto y está ligado à seletividade σ
e o grau de conversão x pela Eq. (2.20).
y = x · σ (2.20)
de modo que a concentração do produto [P] pode ser calculada a partir da Eq. (2.21).
[P] = [S]0 · y = [S]0 · x · σ (2.21)
Rendimentos muito inferiores a 100% já não são aceitáveis, nem económica nem ecologicamente.
Na separação de um racemato, onde o rendimento por corrida é limitado a 50%
por passe, isso significa que a racemização interna ou externa é necessária, a menos que
ou o substrato é barato o suficiente para perder até 50% ou o coproduto pode
ser comercializados em quantidades semelhantes. Ambas as últimas situações são altamente
improváveis.
É difícil definir um limiar para um rendimento suficientemente elevado, uma vez que o valor limiar
parece correlacionar-se inversamente com o valor unitário do produto. Enquanto para o básico,
rendimentos de produtos químicos em grande volume de 98 ou 99% são absolutamente essenciais, a
situação
em produtos químicos finos exige rendimento de 90-95%, e na fase inicial de produção de
produtos químicos de desempenho extremo, como produtos farmacêuticos, rendimentos de > 80%
são muito
aceitável; às vezes é necessário encontrar valores abaixo de 50%. Aceitável
os rendimentos dependem do número de etapas do processo, incluindo o isolamento do produto. Eu
cai
supõe-se que as etapas obtenham um rendimento de 90%, o rendimento geral depende do número
de etapas n como na Eq. (2.22).
yoverall = (ystep)
n
= (0,9)n(2,22)
de modo que, para um processo de uma etapa, no geral, 1 = 90%, para um processo de três etapas
menos no geral,3 = 73%,
e para um processo de dez etapas no geral, 10 = 35%!
2.3 Critérios de Desempenho para Catalisadores, Processos e Rotas de Processo
34
2.3.2.2 Produtividade do (bio)catalisador
Se uma grande quantidade de (bio)catalisador for adicionada a uma solução de substrato, melhores
resultados serão obtidos.
alcançado do que se apenas uma pequena quantidade de um catalisador altamente produtivo for
usada. Igualar
chamar um agente de catalisador, uma condição é que o agente seja adicionado, no mínimo, em
quantidades subestequiométricas. Quanto menor for a quantidade de catalisador que deve ser
adicionada
para o mesmo resultado, melhor será o seu desempenho. O critério relevante é o número de
rotatividade adimensional, TON [Eq. (2.23)].
TON = quantidade de substrato do produto
quantidade de catalisador razão de catalisador = [S]/[C] (2,23)
O número de rotatividade não é usado frequentemente em biocatálise, possivelmente como o
número molar
A massa do biocatalisador deve ser conhecida e levada em consideração para obter um número
adimensional, mas é o critério decisivo, além da frequência de rotatividade e
seletividade, para avaliação de um catalisador em catálise homogênea (química) e é
assim citado em quase todos os artigos pertinentes. Outra razão para a baixa popularidade do
número de rotatividade na biocatálise, além do desafio da dimensionalidade, é o foco na reutilização
dos biocatalisadores e a correspondente maior ênfase no desempenho ao longo da vida útil do
catalisador, em vez de em uma reação em lote. como
é comum na catálise homogênea (Blaser, 2001). Para avaliação da vida útil do biocatalisador, ver
secção 2.3.2.3.
O número de rotatividade de um catalisador não se refere à escala de tempo de atividade do
esse catalisador em um processo. Se o cronograma da atividade for levado em consideração, o
a produtividade do catalisador é recuperada, expressa como um número de produtividade, PN,
definido na Eq. (2.24).
PN = massa do produto
tempo unitário do catalisador (2,24)
2.3.2.3 Estabilidade do (bio)catalisador
Como em todos os processos catalíticos, a estabilidade do catalisador é um critério chave do
processo. Em contraste
à mera temperatura ou estabilidade de armazenamento, que se referem ao catalisador
independentemente
de um processo, a estabilidade operacional ou estabilidade do processo é o fator relevante e decisivo
dimensão do mérito. É determinado comparando a quantidade de produto gerado com a quantidade
de catalisador gasto. A quantidade relevante, às vezes também encontrada
na catálise homogênea, é o número de rotatividade total (TTN) [Eq. (2.25)].
TTN = mols de produto produzido
mol de catalisador gasto (2,25)
Bastante comum em biocatálise aplicada, onde a pureza do biocatalisador muitas vezes não é
conhecido, é a expressão da estabilidade do biocatalisador como um consumo de enzima
número (e.c.n.) [Eq. (2.26)].
e.c.n. = quantidade de preparação enzimática gasta g de enzima
quantidade de produto gerado kg (ou lb) de produto (2,26)
2 Caracterização de um (Bio-)catalisador
35
O e.c.n. O valor depende dos parâmetros do processo, como temperatura, valor de pH,
e concentrações de substrato(s) e produto(s). Com as massas molares da enzima e do produto, e.c.n.
e TTN podem ser interconvertidos [Eq. (2.27)].
TTN = (1000/e.c.n.) × (MWenzima/MWproduto) (2,27)
Deve-se enfatizar que o TTN não é uma quantidade totalmente adequada para o
avaliação da estabilidade operacional porque o número de moles do biocatalisador não é
uma referência adequada pela complexidade e custo de sua fabricação. No entanto, o
valores para o numerador e o denominador na Eq. (2.27) são geralmente conhecidos e
pode ser expresso em termos monetários. Para verificar a aplicação de tal biocatalisador, a
contribuição do biocatalisador para o custo global pode ser avaliada facilmente.
O parâmetro relevante para estudos de estabilidade operacional de enzimas é o produto da
concentração da enzima ativa [E]ativa e do tempo de residência τ, [E]ativa · τ. Em um
reator tanque continuamente agitado (CSTR), as quantidades [E]ativas e τ estão ligadas por
Eq. (2.28), onde [S0] denota a concentração inicial do substrato, x o grau de
conversão e r(x) a taxa de reação dependente da conversão (Wandrey, 1977;
Bommarius, 1992).
([E]ativo · τ)/[Então] = x/r(x) (2.28)
Para uma comparação e discussão dos conceitos de estabilidade em repouso [Eq. (2.19)] e
estabilidade operacional [Eq. (2.28)], consulte o Capítulo 5, Seções 5.6.1–5.6.3.
O valor limite para estabilidade suficiente do biocatalisador depende da aplicação, assim como o
valor do rendimento do produto. Para qualquer aplicação em síntese o TTN
deve exceder 10 000 e, para o processamento em grande escala, é preferível um valor > 1 000 000.
2.3.2.4 Produtividade do Reator
Para a avaliação da produtividade do reator que é independente do catalisador, o espaço–
rendimento de tempo (s.t.y.) [Eq. (2.29)]. é considerado, como em qualquer processo químico.
chiqueiro. = massa de produto gerado/(volume do reator × tempo) [kg (L · d)–1] (2,29)
Um aumento no chiqueiro no mesmo reator é equivalente a um aumento na taxa de reação.
Ao considerar a equação de Michaelis-Menten [Eq. (2.3): v = vmáx[S]/(KM + [S])
= kcat[E][S]/(KM + [S])], existem três maneiras possíveis de atingir uma taxa de reação máxima:
1. Alta concentração de substrato (aumento se de rendimento de espaço). As reações enzimáticas
podem
ser acelerado aumentando a concentração de substrato até o limite de saturação (≈ 10KM). Se [S]
KM, a enzima está saturada e a Eq. (2.3) é reduzido a
Eq. (2.30).
v = vmax = kcat · [E] (2,30)
2.3 Critérios de Desempenho para Catalisadores, Processos e Rotas de Processo
36
Na saturação do substrato, a reação é de ordem zero em relação ao substrato.
Com um substrato fracamente ligado, isto é, um alto valor de KM, a enzima é frequentemente
saturado apenas acima do limite de solubilidade do substrato. Para melhorar a taxa de reação ou o
chiqueiro. além disso, de acordo com a Eq. (2.29) o rendimento por unidade de tempo deve
ser aumentado, o que significa aumentar a concentração do biocatalisador e/
ou a constante de tempo kcat.
2. Alta concentração de enzimas. A taxa de reação e o estilo de vida pode ser aprimorado por
aumentar a concentração do catalisador [E]; na prática, porém, em contraste com o
formalismo da Eq. (2.3), devido a um aumento excessivo de viscosidade ou a um excesso
de proteína desativada no reator, um limite máximo de concentração de enzima
é atingido.
3. Aumento da constante de tempo. De acordo com a Eq. (2.3), kcat significa a constante de tempo
da reação enzimática [tempo–1], e a reação correspondente é realizada em uma escala de tempo
1/kcat [tempo]. Um aumento pode ser efetuado através do
temperatura (comportamento de Arrhenius), mas também, por exemplo, através da alteração de um
grupo protetor na síntese de peptídeos (Fischer, 1994). Um aumento no kcat também
aumenta a razão de aceleração kcat/kuncat (Radzicka, 1995) do catalisador enzimático, em
contraste com o caso 2) (ver Seção 2.3.3).
Um valor limite mínimo para a produtividade do reator pode ser definido em um rendimento
espaço-temporal de cerca de 100 g (L · d)–1, um valor que tende a ser mais comprometido pela falta
da solubilidade do substrato do que pela reatividade do biocatalisador. Processos biocatalíticos bem
desenvolvidos geralmente apresentam rendimentos espaço-tempo de > 500 g (L · d)–1 ou mesmo >
1 kg (L · d)–1
(Fischer, 1994; Rozzell, 1999; Bommarius, 2001).
2.3.3
Links entre parâmetros de desempenho de reação enzimática
2.3.3.1 Aceleração da Taxa
Embora os utilizadores de biocatalisadores estejam frequentemente preocupados, em primeiro lugar,
com um elevado
taxa máxima vmax, um valor kcat alto e possivelmente também um valor KM baixo, um bom
(bio)catalisador é aquele que aumenta a taxa de fundo químico pelo fator mais alto possível, pelo
menos 105
, possivelmente 1010 ou até mais. A proporção adimensional
da constante de taxa catalítica da enzima sobre a constante de taxa não catalisada (ou seja, a base
química), kcat/kuncat, é chamada de aceleração de taxa. Uma alternativa não utilizada na literatura,
a eficiência ou proficiência, deve ser reservada
para o termo kcat/(kuncat · KM) quantificando o custo energético total da catálise enzimática
(Taylor, 2001). Surpreendentemente, ao analisar a fonte de boas acelerações de taxa, ou seja, altos
valores de kcat/kuncat, ou a fonte de altas proficiências, ou seja, altos
valores kcat/(kuncat · KM), descobriu-se que kcat estava dentro de duas ordens de grandeza para
uma variedade de enzimas, enquanto o kuncat variou em várias ordens de grandeza,
independentemente do valor de kcat (Figuras 2.5 e 2.6; Radzicka, 1995; Wolfenden,
2001) Os dados fornecem uma orientação clara de que a maior melhoria nos catalisadores
enzimáticos pode ser alcançada para reações com constantes de velocidade química de base muito
baixas e não através da otimização de constantes de velocidade ou especificidades que já são
bastante
alto.
2.3.3.2 Razão entre a Constante Catalítica kcat e a Constante da Taxa de Desativação kd
No Capítulo 17, Seção 17.4, encontraremos a equação de taxa para uma desativação
enzima em um reator descontínuo [Eq. (2.31)].
x · [S]0 – KMln (1 – x) = [E]0 · (kcat/kd) · {1 – exp(– kd · t)} (2.31)
A influência da desativação depende linearmente da razão adimensional kcat/kd,
o que pode servir como uma proporção para avaliar rapidamente o potencial de uma enzima
desativadora para síntese.
2.3.3.3 Relação entre Constante de Taxa de Desativação kd e
Número total de faturamento TTN
O consumo específico de enzima [U por kg de produto], um parâmetro prático, pode ser
obtido da Eq. (2.32) (Kragl, 1996), onde avol,0 [U L–1]é o volume volumétrico inicial
atividade).
consumo específico de enzima = (avol,0 · kd)/(s.t.y.) [U (kg produto) –1] (2,32)
Um alto valor para chiqueiro. e valores baixos para [E]′ (uma concentração de enzima modificada
[g enzima L–1]), avol,0 ou kd levam a um consumo favorável, ou seja, baixo e específico de
enzimas.
Para converter o consumo específico de enzima no número total de rotatividade
TTN, o consumo específico de enzima, e.c. [U (kg produto)–1] [Eq. (2.32)] primeiro
deve ser convertido no número de consumo de enzima e.c.n. [g enzima
(kg de produto) –1] [Eq. (2.26)].
e.c.n. = (e.c. · [E]′)/avol,0 [g enzima (kg produto) –1] (2.33)
Se a Eq. (32) é inserido na Eq. (2.33) e a equação resultante na Eq. (2.27), o
o resultado é a Eq. (2.34), que com [E]′/MWenzima = [E]0 [mol L–1] torna-se a Eq. (2.35).
TTN [produto mol (catalisador mol) –1] =
(MWenzima/produto MW) (1000 × chiqueiro)/([E]′ · kd) (2,34)
TTN = (1000 × chiqueiro)/(MWproduto·[E]0·kd) (2,35)
Um TTN favorável, ou seja, alto, é alcançado aumentando o chiqueiro. de um experimento
pertinente, mantendo ambos [E]0 e kd baixos. (O fator de conversão de 1000 não
apareça se chiqueiro é expresso em [g (L · d)–1] e não em [kg (L · d)–1].)
2 Caracterização de um (Bio-)catalisador
39
2.3.4
Critérios de desempenho para esquemas de processos, economia atômica e quociente ambiental
Roger Sheldon, da TU Delft (Delft, Holanda), compilou uma lista de tendências
para tecnologia de processos químicos e bioquímicos (Sheldon, 1994); eles estão em direção
y reações catalíticas em vez de estequiométricas,
y reações com 100% de seletividade a 100% de conversão,
y altas concentrações de substrato,
y sem solventes prejudiciais e sem mudança de solvente durante o processo,
y uso aprimorado de ácidos e bases sólidas ou voláteis, bem como técnicas de pH-stat.
Este conjunto de tendências é mais fácil de quantificar do que os “Doze Princípios da Química
Verde” (Anastas, 1998) discutidos no Capítulo 1. Reconhecemos a importância de alta
conversão, alta seletividade e, portanto, altos rendimentos de produto; e de alto substrato
concentração, muitas vezes levando a alto chiqueiro. e TTN. No entanto, existem vários
diretrizes adicionais que ajudam a otimizar um processo completo.
Alguns desses critérios foram discutidos acima no contexto do catalisador ou
o processo, como enantiosseletividade ou diastereosseletividade em vez de simples seletividade
para o produto, e dados de desempenho do catalisador, como frequência de rotatividade (tof),
número de rotatividade (TON), número de rotatividade total (TTN) e rendimento espaço-tempo
(s.t.y.).
Outros têm que lidar com entradas e saídas do processo além dos reagentes,
catalisadores e produtos, como:
1. a economia atômica, ou seja, a fração de carbono (ou outros elementos) do substrato que é
utilizada ou recuperada no produto
2. o consumo específico (consumo por kg de produto) de solventes, sais e outros
auxiliares, como materiais de processamento (carvão ativo, auxiliares de filtro) e
3. o grau de recuperação de todos os materiais, desde os principais componentes do processo
a solventes, sais e vestígios, bem como ao conteúdo de fluxos de vestígios, muitas vezes
denominados
perdas acessórias.
anúncio 1) Economia do átomo. O grau de utilização dos insumos no produto final é
denominada economia atômica (Trost, 2002). Um processo econômico atômico usa tantos
máximo possível de átomos na estequiometria da reação. Exemplos de processos químicos simples,
mas com economia de átomos, são a fabricação de anidrido maleico por oxidação de butano /
buteno com ar em vez de benzeno, ou de óxido de propileno por oxidação de propileno (propeno)
com ar em vez de fechamento de anel. substituição de epicloridrina
(com perda de HCl). Um exemplo de processo com baixa economia de átomos é qualquer síntese
com etapas de proteção/desproteção, como aquelas que ocorrem durante a síntese peptídica.
síntese (embora possivelmente ainda apresentando rendimentos de produto muito elevados).
ad 2) Consumo específico de solventes, sais e auxiliares. Isso pode ser capturado
avaliando o quociente ambiental, EQ (Sheldon, 1994), que consiste em uma massa relativa de
subproduto versus produto alvo [kg kg–1] (ou para o nosso americano leia 2.3 Critério de
Desempenho ria para catalisadores, processos e rotas de processo
40
ers, lb lb–1) multiplicado por uma medida de hostilidade ambiental. Água ou
mesmo o NaCl pode ter um fator de 1 ou próximo de 1, enquanto o mercúrio, halogenado
solventes ou outros subprodutos tóxicos podem ter um fator de 10 ou até 100.
ad 3) Recuperação de todos os materiais. Os equilíbrios ecológicos tornaram-se cada vez mais
populares
com os reguladores para avaliar o impacto das descargas. Cada vez mais, tais instrumentos
substituir a simples cobrança de custos nas descargas ou a fixação de limites máximos inflexíveis
para
concentrações de uma série de agentes ecologicamente hostis.
Ao almejar a expansão ou quando já estiver executando um processo em um piloto ou
escala industrial completa, em vez de tentar obter conhecimento sobre um problema sob
condições laboratoriais controladas, deve-se garantir que os diferentes objetivos sejam
refletido em diferentes medidas tomadas para obter dados ou para desenvolver um catalisador ou
processo em grande escala. A Tabela 2.2 contrasta práticas laboratoriais típicas com
condições prevalecentes na escala de produção. É prudente, no entanto, que os processos sejam
ser praticado em larga escala para ser desenvolvido adequadamente, mesmo durante a fase de teste
em escala de laboratório.