Benevides Pessela.

ISPTEC 2017

Enzimas: como atuam ?

• catalisadores
• classificação
• especificidade e mecanismos de ação
• regulação enzimática
• inibidores e aplicações

Atenção ! Use o modo “apresentação de slides” para ativar as animações

 Um pouco de História sobre enzimas:

1700:
Estudos da digestão de carnes por secreções do estômago .
1833:
Payen e Persoz: descobriram a conversão do amido em açúcar pela saliva .
1850:
Louis Pasteur concluiu que leveduras catalisam a conversão de
açúcares em álcool.
1878:
Friedrich Wilhelm Kühne cunha o nome "enzima",
"en" = dentro e "zyme" = levedura.
1897:
Buchner descobriu que extratos de levadura podiam converter o açúcar em
álcool, e que fermentos eram moléculas.
1926:
J.B.Sumner cristaliza a primeira proteína, urease, e demonstra que a
atividade enzimática é uma característica de moléculas definidas.
Enzimas são proteínas que agem como catalizadores biológicos:

Composto B (produto)
enzima
Reação
catalisada
pela enzima

Composto A (substrato)

Centro ativo
ou
sítio catalítico Observe que não há consumo
de uma enzima é a porção ou modificação permanente da
da molécula onde ocorre a enzima
atividade catalítica
 Teoria da catálise
v1
Considere as reações: A + B C
v-1

No equilíbrio da reação, as velocidades das reações se igualam: v1 = v-1

- concentrações de todos os reagentes não se alteram mais

- pode se dizer que a reação terminou

Catalisador acelera as velocidades de ambos os lados da reação

- o ponto do equilíbrio é atingido mais rápido

- o ponto do equilíbrio não se altera, ou seja [reagentes]

e de [produtos] no “final” da reação” são as mesmas da
reação não catalisada
- termodinâmica da reação não se altera

Catalisador não é consumido na reação pode atuar em [ ] baixas

 O gráfico mostra a variação de energia ao
Teoria da catálise longo de uma reação.

Energia de ativação ou barreira

energética:
Estado de transição
quantidade de energia
Reação não que é preciso fornercer aos
catalisada reagentes para a reação ocorrer
Energia
de
ativação
Energia

Estado de transição ou
complexo ativado:

Reação forma molecular inter-

Substrato (S)
catalisada mediária entre o reagente e
o produto, existe somente
Produto (P)
no alto da barreira
Progresso da reação energética.
É altamente instável.

Um Catalisador diminui a barreira energética criando percursos alternativos

da reação para formação do estado de transição.
 Enzimas são catalisadores biológicos:

Equação geral representa o

de uma reação E + S ES P + E estado de
enzimática transição

Que diferenças existem entre catalisadores inorgânicos, como íons

metálicos, e as enzimas ?

• enzimas são mais eficientes: podem acelerar reações até 1014 vezes contra
102 – 103 vezes dos catalisadores inorgânicos;

• enzimas são específicas: catalisam reações envolvendo às vezes apenas um

único tipo de reagente;

• enzimas são estereo-específicas e não produzem sub-produtos reacionais;

• enzimas operam em condições amenas de temperatura, pressão e pH;

• enzimas podem ser altamente reguladas através de fatores extrínsecos à reação,

tanto por ativadores como por inibidores.
 Enzimas acelaram reações várias ordens de grandeza

Compare esses números !

Velocidade na Velocidade da
ausência de enzima reação catalisada Poder
Enzima catalítico
“Reações/segundo” “Reações/segundo”

Anidrase carbônica 1.3 X 10 –1 1.0 X 106 7.7 X 106

H2O2 H 2O + ½ O 2

Triosefosfato isomerase 4.3 X 10 –6 4.300 1.0 X 109

Carboxipeptidase A 3.0 X 10 –9 578 1.9X 1011
AMP nucleosidase 1.0 X 10 –11 60 6.0 X 1012
Nuclease de estafilococos 1.7 X 10 -13 95 5.6 X 1014

Número de “turnover” ou de renovação: quantas vezes a enzima completa

o ciclo da reação em um segundo
Número moles de S catalisado por segundo
de =
moles de enzima
turnover
 Por que a catálise por enzimas é mais eficiente ?
1) Aumento da concentração dos reagentes na superfície da enzima: “atração” dos reagentes
para interação com a enzima).
2) Orientação correta dos reagentes (substratos): parte da energia de ativação representa o
posicionamento adequado dos reagentes para que haja contacto entre os átomos corretos. O sitio
ativo da enzima favorece o posicionamento correto dos reagentes.
3) Aumento da reatividade dos reagentes: as cadeias laterais (R) dos aminoácidos da enzima ou
co-fatores e coenzimas podem interagir diretamente com os substratos, dando-lhes carga elétrica
ou polarizando-os, tornando-os quimicamente mais reativos, ou ainda cedendo ou transferindo
certas funções químicas.
4) Indução de deformação física no substrato, por contacto com as cadeias laterais (R) dos
aminoácidos das enzimas, que desestabilizam a molécula do substrato e facilitam o rompimento de
laços covalentes

A hidrólise lento
não enzimática Cadeias
de uma ligaçãolento rápido rápido Muito
laterais de
peptídica é lenta rápido aminoácidos
e requer no sítio ativo
condições de uma
drásticas de pH e Água, enzima
temperatura um dos substratos hidrolítica

Sem catálise Catálise ácida Catálise básica Catálise

ácido-básica
Algumas proteínas, enzimas em especial, contêm em sua molécula uma porção
não proteica, que é essencial para atividade biológica.

metal Distinção entre cofator e coenzima

Grupo depende da força de ligação com a
cofator
prostético apoproteína. Ex: o NAD+ pode ser
coenzima cofator de uma enzima (ligação
fraca) e ser coenzima de outra
Enzima (ligação forte). O mesmo ocorre
holozima
com as metais.

Apoenzima
parte proteica

ativa
Coenzima Reação com Vitamina

Grupo
Prostético
inativa Biocitina CO2 Biotina
Coenzima A Grupos acil Ác. Pantotênico
Coenzima B12 H e grupos alquil Vitamina B12
FAD, FMN óxido-redução Riboflavina
Coenzimas participam do ciclo
NAD, NADP óxido-redução Niacina
catalítico das enzimas
recebendo ou fornecendo Fosfato de piridoxal Grupos aminos Piridoxina
grupos químicos para a reação Pirofosfato Tiamina Grupos aldeídos Tiamina
Tetrahidrofolato unidades C Ácido fólico
Algumas enzimas formam intermediários covalentes com seus substratos

Grupo reativo Intermediário

Enzimas
no sítio ativo covalente
Quimotripsina
Elastase
Esterases
Trombina
Tripsina

Papaína Enzimas com o mesmo

Gliceraldeído-3-PO4 tipo de mecanismo
desidrogenase catalítico, ou seja,
possuem o mesmo grupo
Fosfatase alcalina
de aminoácidos no sítio
Fosfoglicomutase
ativo, formam
intermediários covalentes
Fosfoglicerato mutase similares
Succinil-CoA sintase

Aldolase
Descarboxilases
Enzimas dependentes
de piridoxal fosfato
 Transferência de elétrons
Classificação das Enzimas: 1. Óxido-redutases
( Reações de óxido-
Se uma molécula se
reduz, há outra que se
redução).
oxida.

considera tipo de 2. Transferases

•grupos aldeído
•gupos acila
(Transferência de grupos
reação e substratos funcionais)
•grupos glucosil
•grupos fosfatos (quinases)

•Transformam polímeros em monômeros.

Atuam sobre:
Nomenclatura oficial das enzimas é 3. Hidrolases •Ligações éster
•Ligações glicosídicas
dada pela Enzyme Comission da (Reações de hidrólise)
•Ligações peptídicas
International Union for Biochemistry •Ligações C-N
and Molecular Biology (IUBMB) :
•Entre C e C
4. Liases
•Entre C e O
(Adição a ligações duplas) •Entre C e N
ATPase (Adenosinatrifosfatase): EC
3.6.1.3
- é uma hidrolase.........................3
- atua num anidrido......................3.6 5. Isomerases
- o anidrido contém fosfato..........3.6.1 (Reações de isomerização)
- esse anidrido é ATP..................3.6.1.3
Números identificam o tipo 6. Ligases •Entre C e O
(Formação de laços •Entre C e S
de reação e o tipo de covalentes com gasto de •Entre C e N
substrato alvo ATP) •Entre C e C
Enzimas são específicas para o reconhecimento de seus substratos.

Emil Fisher, na década de 1950, propôs

Modelo Chave-Fechadura o modelo chave-fechadura para expli-
car o reconhecimento (especificidade) do
substrato pela enzima. Nesse modelo, o
Formas rígidas sítio ativo da enzima é pre-formado e
tem a forma complementar à molécula
do Substrato, de modo que outras
moléculas não teriam acesso a ela.

No entanto, o modelo chave-fechadura

não explica a interação das enzimas com
inibidores e análogos dos substratos.
Modelo Chave-Fechadura
Na década de 1970, Daniel Kosland
E e S se deformam, para propôs o modelo de encaixe induzido,
otimizar o encaixe
no qual o contacto com a molécula do
substrato induz mudanças conformacio-
nais na enzima, que otimizam as intera-
ções com os resíduos do sítio ativo.
Esse é o modelo aceito hoje em dia.
Carboxipeptidase A é uma enzima digestiva da classe das metaloproteinases.

Em A: o sítio catalítico dessa enzima é formado pelos resíduos (em vermelho) de Tyr248
(acima, à direita) e de Glu270 (centro), e um átomo de Zn2+, que está acima do Glu270.

A B

Em B: A ligação do substrato dipeptídico glicil-L-tirosina (em verde) causa uma profunda

mudança conformacional nas vizinhanças do sítio ativo da carboxipeptidase A. Clique com
o mouse para observar a re-orientação da posição da Tyr248 em relação à outra figura.
 Mecanismo de ação da quimotripsina,
quimotripsina
um exemplo típico de uma serino proteinase
Enzima interage
com substratos
aromátcos Ligação a ser hidrolisada
A H2O entra no sítio
ativo e forma uma
ponte de H+ com a
Tríade catalítica His-57
Ser – His - Asp

A H2O transfere H+
para a His-57 e –OH
A Ser-195 transfere H+
para o substrato,
para His-57 formando um
formando um segundo
estado de transição
estado de transição
tetraédrico com o
tetraédrico
substrato. O Asp-102
estabiliza o próton na His-
57 fazendo uma ligação
iônica

O H+ é transferido da His-57
de volta para a Ser-195. A
O H+ é transferido da His- outra porção do substrato é
57 para o substrato. A liberada da enzima, que
ligação susceptível é retorna ao estado inicial
clivada, e parte do
substrato fica ligado
covalentemente à enzima
 Fatores que afetam a atividade enzimática:

1. Condições do meio que afetam estabilidade protéica

• pH
• temperatura

2. Tempo da reação

3. Concentração dos reagentes

• a enzima
• o substrato
• co-fatore(s)

Vários são os fatores que afetam o funcionamento das enzimas como catalisadores.
Alguns desses fatores são decorrentes da natureza proteica das enzimas, como o
efeito do pH e da temperatura. Para se estudar o efeito isolado de um dos fatores
acima, é necessário que todos os outros fatores sejam mantidos fixos.
 Fatores que controlam a atividade enzimática:

1. Fatores que afetam a estabilidade proteica das enzimas

• Variações de pH: pH ótimo

O pH ótimo de uma enzima

% atividade enzimática máxima

reflete variações no estado de

ionização de resíduos de
aminoácidos do sítio ativo. A
enzima está pelo menos
parcialmente desnaturada em
pHs afastados do pH ótimo.
Quando o substrato é uma
molécula ionizável, o pH ótimo
da enzima também reflete o seu
estado de ionização .

pH ótimo=1,5 pH ótimo=6,8 pH ótimo=9,9

 Fatores que controlam a atividade enzimática:

1. Fatores que afetam a estabilidade proteica das enzimas

• Variações de pH: pH ótimo
• Variações de temperatura: temperatura ótima

Desnaturação
% atividade enzimática máxima

100- térmica da
Temperatura proteína
ótima

Pouca energia
50- para a reação
acontecer Ao contrário da curva em
forma de sino no caso da
atividade enzimática versus
pH, a enzima só está
0-
desnaturada em
temperaturas acima da
temperatura ótima.
 Fatores que controlam a atividade enzimática:
2. Tempo da reação O gráfico abaixo ilustra como as
concentrações de E, S e P variam ao
longo do tempo da reação.
3. Concentração:
• da enzima
• do substrato
• de co-fatore(s)

concentração
A [substrato] cai na mesma razão em que a
[produto] aumenta em função do tempo.

A enzima existe sob duas formas: enzima

livre E e complexo enzima-substrato ES. No
início da reação, a [E] livre cai e a do
complexo [ES] aumenta e atinge um máximo,
em que não há mais [E] livre no meio. Nessa
situação (indicada no retângulo cinza), diz-se
que a enzima está saturada (só existe no
complexo ES). A velocidade da reação é a
máxima.
tempo
Na década de 1950:

Michaelis e Menten formularam as bases da cinética enzimática, para explicar como a

concentração do substrato [S] afeta a velocidade da reação v, conforme se observa
no gráfico abaixo.
A velocidade da reação apresenta três regiões de comportamento diferente, a medida
que se aumenta a concentração do substrato:
-parte a: v aumenta proporcionalmente
com aumentos de S.
-parte b: v aumenta não proporcional-
mente com aumentos de S.
-parte c: v não aumenta mais, tendendo
a um valor máximo (Vmax),
sendo independente da [S]

O gráfico mostra um conjunto de reações

que estão acontecendo simultâneamente,
conforme as equações abaixo:
Para se chegar à equação da hipérbole quadrada do gráfico V x S, o gráfico de
Michaelis Menten, considera-se que o conjunto
de reações está em equilíbrio, ou seja, a [ES]
é constante e o sistema tem a sua velocidade
máxima, Vmax.

Quando [ES] é constante, as velocidades de

formação (Vf) e de desdobramento (Vd) do
complexo ES são iguais:
Vf formação ES = Vd desdobramento ES
Aplicando a Lei de Ação das Massas para definir Vf e Vd, temos:
Igualando-se Vf = Vd e resolvendo para V, chega-se
Vf = k1 [ES] à Equação de Michaelis-Menten:
[E]+[S]
sendo KM = k-1+ k2
Vd= k-1 [E]+[S] + k2 [E]+[P]
k1
[ES] [ES]
Constante de Michaelis-Menten
 A constante de Michaelis-Menten (KM) é um parâmetro cinético que traz
informações sobre a afinidade que a enzima tem pelo substrato.

O KM é numéricamente igual à [substrato] que

produz metade da Vmax .
Substituindo na equação v por Vmax/2, vemos:

Vo=Vmax Vmax = Vmax.[S]

2 2 Km + [S]
Vmax.Km + Vmax.[S] = 2Vmax.[S]
KM = k-1+ k2 Vmax.Km = Vmax.[S] Km = [S]
k1
Considerando a afinidade da E pelo seu S, temos 2 casos:
1. E tem baixa afinidade por S 2. E tem alta afinidade por S

Quando Vd é mais alta do que Vf Quando Vf é mais alta do que Vd

k-1+ k2 = grande Km alto k-1+ k2 = pequeno Km baixo
k1 = pequeno k1 = grande
 Uma outra forma de se obter os valores de KM e de Vmax é através do gráfico dos
duplos recíprocos (1/V x 1/S), e da equação de Lineweaver-Burk. Aplicando-se o
inverso a ambos
os lados da
equação de
Michaelis-Mentem,
obtem-se a
equação de
Lineweaver-Burk,
que é uma função
linear (uma reta):

Tang  =KM/Vmax

equação
y = a . x + b de reta
O intercepto da reta no eixo x é igual a -1/KM
Onde:
substituindo y = 0 na equação, temos:
a = coef. angular = Km/Vmax
0 = Km . 1 + 1 -1 = Km . 1 (tangente ângulo alfa)
Vmax [S] Vmax Vmax Vmax [S]
b = coef. linear = 1/Vmax
-1 = Km -1 = 1 (intercepto no eixo y)
[S] Km [S]
 A velocidade da reação
somente é proporcional à
[E]
quando a enzima está
saturada, ou seja, reação é
de ordem zero (independe)
em relação a [S]

Eficiência catalítica

Kcat/Km
- k2 ou kcat (constante catalítica) mede o “poder
catalítico” da enzima Parâmetro mais adequado
para comparações
v = k2 Etotal + [P] k2 = Vmax (s-1)
cinéticas
[ES] [Etotal]
Para calcular kcat considera-se que toda a E existe como ES, e que v=Vmax
 Interações secundárias de proteinases com seus substratos
Enzima Substratos kcat KM Razão
kcat/ KM
(seg-1) (mM)

Tripsina (pH 7.5) Z-Lys-OMe 101 0.23 1

Z-(Ala)2-Tyr-Lys-OMe 106 0.08 3

Quimotripsina (pH 7.9) Z-Tyr-Gly-OMe 0.6 23 1

Z-(Ala)2-Ala-OMe 10 2 190
Elastase (pH 8.0) Z-Ala-OMe 6.7 153 1
Z-(Ala)2-Ala-OMe 73 0.43 3900

A tabela ilustra como interpretar Kcat, KM e eficiência catalítica (kcat/K M), comparando a ação
de enzimas proteolíticas sobre diferentes substratos sintéticos. O ponto de clivagem dos
substratos está indicado pela flecha. Conforme o número de resíduos de aminoácidos
aumenta à esquerda do ponto de clivagem, a eficiência catalítica (kcat/K M) das enzimas
melhora (considerando-se como 1 o valor obtido com o substrato mais curto).

No caso da tripsina, o Km diminue 3X, sem alterar o kcat, ou seja a formação do complexo
ES com o substrato maior é facilitado, mas não foi afetada a sua transformação em produto.

No caso da elastase, o Km diminue ~300 X e o kcat aumenta ~10x, ou seja todas as etapas
da reação são facilitadas com o substrato mais longo.Como resultado, a eficiência catalítica
aumentou 3.900 vezes.
 35Å

QUIMOTRIPSINA
18 Å

SÍTIO ATIVO SÍTIO

S4 S3 S2 S1 S1¹
CATALÍTICO

P4 P3 P2 P1 P1¹
SUBSTRATO LIGAÇÃO
SUSCEPTÍVEL

Representação esquemática do sítio de reconhecimento do substrato da QUIMOTRIPSINA.

O sítio ativo de uma enzima proteolítica em geral é uma fenda onde se localizam os
resíduos de aminoácidos (S) dotados de capacidade catalítica. O resíduo de aminoácido da
enzima que efetua a clivagem do substrato é designado S1, e sucessivamente à esquerda na
seqüência primária da enzima, ficam os resíduos S2, S3, S4, etc. De maneira análoga, os
resíduos de aminoácidos da enzima à direita de S1 são designados com S’1, S’2, S’3, etc.
O resíduo catalítico S1 da enzima cliva o substrato proteico no resíduo P1, determi-
nando sua especificidade primária. À esquerda e à direita de P1 na seqüência do substrato
proteico, estão os resíduos P2, P3, etc, e P’1, P’2, etc, respectivamente.
A figura acima explica os dados da tabela no slide anterior. O encaixe da enzima com
a molécula do substrato melhora quando outros resíduos, além de S1 e P1, interagem. Na
tabela, os substratos com resíduos P2 a P4 proporcionaram melhores parâmetros, mostrando
que as interações que esses realizam com a enzima influenciam sua atividade enzimática.
 Como são controladas as enzimas in vivo, além de alterações na disponibilidade
de S e da própria E ?
Lembrar que em geral não ocorrem variações bruscas de pH e de temperatura.

A atividade enzimática pode ser regulada por diferentes mecanismos, que muitas
vezes atuam em conjunto na mesma enzima.

Entre estes mecanismos, destacam-se:

1. Inibidores:
• irreversíveis: não protéicos e protéicos
• reversíveis: competitivo, não competitivo ou misto, incompetitivo

2. Alosteria:
• ativadores e inibidores
• cooperatividade
Agora vamos falar de:
3. Modulação covalente
• Ativação de zimogênios
• Fosforilação e defosforilação
 Inibidores irreversíveis:
Compostos orgânicos clorados ou fosforados são bons exemplos de inibidores enzimáticos irreversíveis,
pois reagem com o resíduo S1 de serino-enzimas, formando um complexo irreversível. Uma das enzimas
altamente sensível a esses compostos é a acetilcolinesterase, responsável pela metabolização do
neurotransmissor acetilcolina em neurônios centrais e periféricos.

Este é o mecanismos de ação dos inseticidas organofosforados, como o malathion e o parathion. Tanto a
acetilcolinesterase de insetos como de mamíferos são igualmente inibidas por essas drogas. Contribue
para a toxicidade desses inseticidas a longa meia vida que esses apresentam no ambiente.

Inseticidas
organofosforados
dose letal: 3-13 mg/Kg, oral

meia vida – 23 anos

Acetilcolinesterase complexada com sarin ou “gás dos nervos” (dose letal 0,01 mg/kg, oral), um
organofosforado altamente tóxico e volátil, que reage com o resíduo de Ser ativo da enzima.
 H3C SO2F
E
E
F-

PMSF
Enzima + diisopropilfluorofosfato enzima inibida phenylmethane
sulphonyl fluoride

No laboratório, serino-enzimas podem ser identificadas por serem eficientemente inibidas por
compostos organofosforados menos tóxicos como o diisopropilfluorofosfato (DFP) ou o fluoreto
de fenilmetilenosulfonila (PMSF).

Diferentes compostos são utilizados em laboratório para identificar o mecanismo catalítico de

enzimas, baseado em reações específicas para as cadeias laterais de aminoácidos que podem
fazer parte do sítio ativo dessas.
Inibidores proteicos de enzimas proteolíticas desempenham importantes papéis
fisiológicos. Entre esses estão as serpinas, inibidores de serino-proteinases, e as
cistatinas, inibidores de cisteíno-proteinases. Em ambos os casos, os inibidores
funcionam como “falsos substratos”, sendo reconhecidos e clivados pelas enzimas,
que ficam “aprisionadas” num complexo com o inibidor.

Modo de ação de serpinas:

A serpina e a enzima inicialmente

formam um complexo não
covalente (EI), complexo de
Michaelis. Em seguida, a
clivagem da ligação peptídica na
alça reativa forma em um
intermediário acil-enzima (EI*),
que pode resultar em
transposição e inserção da alça
da serpina na enzima,
bloqueando-a permanentemente,
ou em certas circunstâncias, na
liberação da serpina clivada e da
enzima livre.
Serpinas: serine proteinase inhibitors
 Neurotropic factors
Hormone transport
PEDF – F1
neuroserpin I-1
PN1 – E2
Alzheimer disease CBG – A6 PCI – A5

Tumor cell invasion alfa1-ACT – A3

TBG – A7
A Superfamília das
Serpinas
Inflammation &
Complement activation
maspin –B5
PI14 – I2
alpha1-PI A5 • são conhecidas cerca de 500
alpha1-ACT A3
Prohormone conversion KAL A4
ov-serpins B*
serpinas (até set.2001)
alfa1-ACT – A3

Blood pressure regulation •apresentam 1 cadeia com 350-

Renal development AGT A8 500 aminoácidos
AGT – A8 angiogenesis
megsin – B7
PEDF - F1
•filogenéticamente formam 16 clãs
maspin- B5
Sperm development ATIII - C1
PAI1 – C5
•a maioria tem atividade como
PCI – A5
fibrinolysis
inibidor de serino proteinases
Coagulation
PCI – A5
PAI1 – C5
PAI2 – B2 •existem serpinas não inibitórias
alpha2-AP – F2
ATIII – C1
HCFII – D1
PAII – E1 apoptosis
•a figura ao lado mostra vários
ECM maintainance and
remodelling
alpha1-PI A5
processos fisiológicos e/ou
alphaPI – A1
alpha1- ACT – A3
alpha1-ACT A3
ov-serpins B*
patológicos nos quais existe
PAI – E1
PN1 – E2 participação de serpinas
HSP47 – H1 Microbial infection

B-cell development

serpinas inibitórias
C1 Inh G1

centerin – B9
ov-serpins B*
serpinas não inibitórias
 Como são controladas as enzimas in vivo, além de alterações na
disponibilidade de S e da própria E ?

A atividade enzimática pode ser regulada por diferentes mecanismos, que muitas
vezes atuam em conjunto na mesma enzima.

Entre estes mecanismos, destacam-se:

1. Inibidores:
• irreversíveis: não protéicos e protéicos
• reversíveis: competitivo, não competitivo ou misto, incompetitivo

2. Alosteria:
• ativadores e inibidores
• cooperatividade
Agora vamos falar de:
3. Modulação covalente
• Ativação de zimogênios
• Fosforilação e defosforilação
 • o inibidor é análogo estrutural do substrato e
Inibição competitiva compete com ele pela ligação ao sítio ativo
• com aumento da [substrato], ocorre diminue da
inibição caracterizando uma competição entre S e I
I S • não há alteração da Vmax
S S • há um aumento de Km por um fator , que
permite o cálculo da constante de inibição, Ki
S P
E IS SS

S S I

S
 I Inibição não competitiva ou mista
S S
• inibidor não é análogo estutural do
substrato - não se liga ao sítio ativo
E S
I I
P • inibidor se liga à E e ao ES
I
S • aumento da [substrato] não diminue a
S inibição - não há competição
S • Km aumenta e Vmax diminuí
I I E
E
S I
I
S S
 Inibição incompetitiva
S S
I
• inibidor é análodo do estado de transição
I I E S
I S e se liga somente ao complexo ES
• Km aumenta e Vmax diminuí
S
 Como são controladas as enzimas in vivo, além de alterações na
disponibilidade de S e da própria E ?

A atividade enzimática pode ser regulada por diferentes mecanismos, que muitas
vezes atuam em conjunto na mesma enzima.

Entre estes mecanismos, destacam-se:

1. Inibidores:
• irreversíveis: não protéicos e protéicos
• reversíveis: competitivo, não competitivo ou misto, incompetitivo

2. Alosteria:
• ativadores e inibidores
• cooperatividade

3. Modulação covalente
Agora vamos falar de:
• Ativação de zimogênios
• Fosforilação e defosforilação
Enzimas alostéricas possuem uma região diferente do sítio ativo ao se liga
um efetor ou modulador alostérico. A mudança conformacional decorrente da
ligação do efetor alostérico se propaga pela molécula e afeta o sítio ativo,
ativando-o ou inibindo-o. Observe nas figuras.

Ativador alostérico Inibidor alostérico

Gráfico V x S
Enzimas tipo K: efetores alostéricos alteram o Km
(Michaelis-Menten) é
Enzimas tipo V: efetores alostéricos alteram a Vmax uma curva sigmóide
 A aspartato transcarbamoilase fornece N-carbamoil-aspartato para a rota de
síntese de pirimidinas. É uma enzima alostérica tipo K, inibida por CTP e ativada
por ATP, sendo composta por 6 unidades regulatórias e 6 catalíticas.

Carbamoil + aspartato N- Carbamoil +H 2

PO-4

PO42- aspartato

pirimidinas

Sem efetores ativa

alostéricos
A ligação de CTP às
subunidades regulatórias “fecha” CTP CTP
o acesso aos sítios ativos nas
subunidades catalíticas.

inativa
 Como são controladas as enzimas in vivo, além de alterações na
disponibilidade de S e da própria E ?

A atividade enzimática pode ser regulada por diferentes mecanismos, que muitas
vezes atuam em conjunto na mesma enzima.

Entre estes mecanismos, destacam-se:

1. Inibidores:
• irreversíveis: não protéicos e protéicos
• reversíveis: competitivo, não competitivo ou misto, incompetitivo

2. Alosteria:
• ativadores e inibidores
• cooperatividade Agora vamos falar de:
3. Modulação covalente
• Fosforilação e defosforilação
• Ativação de zimogênios
Ao contrário da alosteria, em que os efetores ligam-se à enzima apenas por ligações
fracas, na modulação covalente a enzima é modificada covalentemente por duas
outras enzimas: uma quinase fosforila a enzima às custas de ATP, e uma
fosfatase remove o grupo fosfato da enzima fosforilada.
A modulação covalente é energéticamente cara, pois
necessita duas outras proteínas e ATP para regular
a atividade de uma enzima. Ao contrário, na alosteria
enzima
a enzima é controlada pelas concentrações relativas
de seus efetores e a afinidade da enzima por estes.
fosfato
substrato
Fosforilação - Defosforilação

fosfatase

inativa ativa
quinase
 A regulação do metabolismo intermediário, por
exemplo, síntese e degradação de lipídeos e
carboidratos envolve etapas de alosteria e
modulação covalente
Em resposta ao hormônio adrenalina ou epenifrina, há um
aumento da concentração de glicose circulante, preparando
o organismo para luta ou fuga.

Na primeira etapa dessa resposta metabólica, a adrenalina

ativa por alosteria a enzima de membrana adenilato
ciclase, formando AMP cíclico.

Numa segunda etapa de alosteria, o AMP cíclico ativa a

proteína quinase A (PKA), ligando-se à sua unidade regula-
tória e liberando a unidade catalítica ativa.

Na terceira etapa, ocorre modulação covalente em que a

PKA fosforila a fosforilase quinase, tornando-a ativa.

Na quarta etapa, também por modulação covalente, a

fosforilase quinase fosforila a glicogênio fosforilase,
ativando-a. Por fim, esta hidrolisa diretamente o glicogênio
liberando glicose-1-fosfato para a via glicolítica.
Mecanismos de regulação do metabolismo de carboidratos e lipídeos
Enzima 4
alosteria
modulação PO cAMP
covalente
4
+
transporte
Enzima 4
E
X Z
A A B C D
Enzima 1 Enzima 2 Enzima 3

membrana
+ -
alosteria alosteria

Síntese RNAm Síntese

+ - ribossomal

indutor repressor

Em vias metabólicas reguladas por alosteria, uma enzima inicial da rota é

controlada por um dos produtos finais da mesma.
 Como são controladas as enzimas in vivo, além de alterações na
disponibilidade de S e da própria E ?

A atividade enzimática pode ser regulada por diferentes mecanismos, que muitas
vezes atuam em conjunto na mesma enzima.

Entre estes mecanismos, destacam-se:

1. Inibidores:
• irreversíveis: não protéicos e protéicos
• reversíveis: competitivo, não competitivo ou misto, incompetitivo

2. Alosteria:
• ativadores e inibidores
• cooperatividade Agora vamos falar de:
3. Modulação covalente
• Fosforilação e defosforilação
• Ativação de zimogênios
Ativação de zimogênios é um caso específico de modulação
covalente exclusivo de alguns tipos de enzimas proteolíticas.

• zimogênios: as proteases são sintetizadas numa forma inativa por estar em

uma conformação desfavorável, com bloqueio ou desalinhamento dos
resíduos do sítio catalítico.
• conformação desfavorável resulta de porções adicionais da cadeia poli-
peptídica, que devem ser retirados para que a proteína assuma a forma ativa.
• podem acontecer duas situações, combinadas ou não:
- zimogênio tem uma extensão N-terminal (pro-segmento) que precisa
ser retirada. Pro-segmentos podem ter de 2 a 150 resíduos a.a.
- zimogênio tem cadeia polipeptídica única, que precisa ser clivada
(proteólise limitada) para formar duas ou mais subunidades.
• conversão do zimogênio à protease ativa pode resultar da ação proteolítica
de outra protease, ou de alteração do pH ou temperatura do meio, ou ainda, da
adsorção do zimogênio à uma superfície negativa. Esses eventos determinam
mudança conformacional e/ou auto-hidrólise pela própria protease.
• ativação é irreversível, e porisso, energeticamente cara para o organismo.
 A enzima digestiva quimotripsina é sintetizada como quimotripsinogênio, com um
cadeia única, impossibilitando a montagem do sítio ativo, formado pela His57, Asp102 e
Ser195 (em rosa). No intestino, o quimotripsinogênio é clivado pela tripsina em dois pontos,
retirando dois dipeptídeos. A quimotripsina ativa possue três subunidades, cadeias A, B e
C, unidas por 5 pontes S-S.

A Quimotripsina é formada por dois domínios, com 6

folhas β antiparalelas (vermelho) cada.
O sítio ativo contendo a tríade catalítica (Ser195,
Asp102, His57, as cadeias laterais estão destacadas)
localiza-se entre os dois domínios. As pontes S-S
aparecem em violeta.
Linhas pontilhadas indicam os resíduos 14-15 e 147-
quimotripsinogênio quimotripsina
148 presentes no precursor inativo,
As aspártico-proteases gástricas, como a
pepsina, são sintetizadas como zimogênios

Em verde está representado o prosegmento

com 43 aminoácidos, que bloqueia o acesso
ao sítio ativo.

Inicialmente, o pepsinogênio é ativado pela

exposição ao HCl, com uma mudança
conformacional que permite que algumas
moléculas hidrolisem o pro-segmento,
tornando-as ativas.

Em seguida, a pepsina formada faz a

proteólise limitada de mais moléculas de
pepsinogênio.

Em rosa está representado as regiões da

molécula que se reorganizam com a retirada
do pro-segmento.
pro-segmento
 VIA INTRÍNSECA
A Coagulação Sanguinea é
PK HMWK
resultado da ativação de
VIA EXTRÍNSECA uma cascata de zimogênios
XIIa
XII Superfície- IX de serino-proteinases.
XI XIa Lesão
Superfície
-
IXa
vascular
A cascata pode ser iniciada
IX IXa
VIIa VII independentemente através do
VIIIa
Fator tissular fator XII (via intrínseca) ou do
fator VII (via extrínseca).
X X
Ambas as rotas convergem
Xa para uma via comum, com a
V
Va
Va
ativação do fator Xa. Este, em
Protrombina (II) Trombina (IIa) presença de fator Va, converte
protrombina em trombina.
VIA COMUM Fibrina (Ia) O fibrinogênio é clivado
Fibrinogênio (I)
formando fibrina por ação da
XIIIa Trombina.

Coágulo de
fibrina Zimogênios
Serino-proteinases
Uroquinase
Fatores não enzimáticos
tPA
FIBRINÓLISE
Plasmina
Plasminogênio
 Para mais informações, visite as páginas abaixo:

http://www.brenda.uni-koeln.de/

http://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/CSA/

http://merops.sanger.ac.uk/cgi-bin/merops.cgi?id=index;action=clanid