Enzimologia Clínica

Enzimologia
Conceito Função
→ Aplicação da ciência das enzimas ao diagnóstico, → Autorreplicar
prognóstico, acompanhamento e cura de doenças
→ Catalisar reações químicas, eficiente e seletivo

• Enzimas
→ Musculares
→ Cardiovasculares
→ Hepáticas
→ Pancreáticas
→ Ósseas
→ Renais
Propriedades
→ Sítios ativos
Catalisadores proteicos → Tecidos (intracelular)
→ Eficiência catalítica
→ Especificidade
Lesão celular →  Permeabilidade celular → Plasma
→ Regulação
Enzimologia
Histórico
1700: Reconhecimento da catálise biológica, estudos sobre a
digestão de carne por secreção do estômago
1850: Louis Pasteur concluiu que fermentação do açúcar em
álcool pela levedura é catalisada por “fermentos”, vitalismo
1897: Eduard Buchner removeu células de leveduras e
observou que a fermentação do açúcar em álcool funcionou
Nomenclatura
inorganico
Cofator: enzima requer um íon orgânico adicional
Coenzima: enzima requer uma molécula orgânica adicional
Grupo prostético: cofator ou coenzima covalentemente
ligada a enzima
Apoenzima: enzima inativa sem o cofator/coenzima
Holoenzima: enzima ativa com o cofator/coenzima

→ Frederick W. Kühne: Enzimas

1926: James Summer fez o isolamento e a cristalização de

urease, verificou que enzimas são proteínas
→ Sufixo “ase” adicionado ao nome do substrato da reação
ou à descrição da ação realizada
Enzimologia
Nome Sistemático
Enzimologia
Nome Sistemático
Enzimas
Funcionamento Equação de Michaelis-Menten
→ A atividade enzimática é definida com o sendo a → 1913, modelo que explica as características das reações
capacidade de uma enzima de transformar um substrato catalisadas por enzimas
em um determinado tempo e não ser consumida neste
→ Descreve como a velocidade da reação varia com [S]
processo
k1
k2
k -1

km: característico da enzima e do substrato

Energia ativação (EA):  energia de T* e A
Velocidade de reação (VR): quantidade/
tempo em que A é convertido em B
→ Quanto < EA > VR
específico, reflete a afinidade da enzima
por esse substrato
km = [S] quando a Vo = ½ Vmax
km alto:  afinidade enzima e substrato
km baixo:  afinidade enzima e substrato

Enzimas: rota alternativa de reação

Primeira ordem: [S] << km: Vo  [S]
EA VR, sem alterar o equilíbrio
Ordem zero: [S] >> km: Vo = Vmax e ind. [S]
Enzimas
Determinação da Atividade Enzimática
• Comissão de Enzimas da União Internacional de Bioquímica (UIB)
Unidade Internacional (UI): a quantidade de enzima que catalisa a transformação de um micromol de substrato ou a formação
de um micromol de produto, por minuto e por litro de material biológico, nas condições padrão recomendadas

1 Unidade Internacional (U) = 1 micromol/minuto/litro = mol/min/L

• IUPAC e IUB
Velocidade da Reação Enzimática
Fatores que Afetam a Velocidade de Reação Enzimática
→ Toda enzima é proteína: ação depende da integridade de sua conformação proteica nativa

[Substrato] [Enzima]
→ [S] ideal = 10 vezes o valor de km → A concentração da enzima está diretamente ligada a
velocidade da reação
Um valor de 10 vezes o
valor de Km é
geralmente considerado
a concentração ideal de
substrato para reações
enzimáticas pois
fornece uma
concentração
suficientemente alta
para saturar a enzima,
mas não tão alta que a
velocidade da reação se
torne limitada por fatores
físicos, como a difusão
do substrato até o sítio
ativo da enzima e a
difusão do produto para
fora do local da reação.
Velocidade da Reação Enzimática
Fatores que Afetam a Velocidade de Reação Enzimática
→ Toda enzima é proteína: ação depende da integridade de sua conformação proteica nativa

Temperatura pH
→ Para a formação do complexo enzima-substrato, é → Complexo enzima-substrato por ligação iônica
necessária uma quantidade de energia em forma de calor
→ [H+] = propicia dissociação
Velocidade da Reação Enzimática
Fatores que Afetam a Velocidade de Reação Enzimática
→ Toda enzima é proteína: ação depende da integridade de sua conformação proteica nativa

Concentração e Natureza do Tampão Presença de Efetores

→ Reações em meio tamponado → Substâncias químicas que alteram a velocidade da reação

Aumeta ou diminui a
catalisada por enzima velo da reação
enzimática

→ Impedir as variações de pH
→ Interagem com a enzima ligando-se ao seu sítio alostérico
ou sítio modulador
→ Conservar o pH ótimo

Ativadores: Cl- (AMS)

→ Tampão Tris
→ Oxirreduções
→ Estabilizar coenzima Inibidores: EDTA (PAL) inibidor porque se liga a íons metálicos, especialmente o cálcio,
magnésio, manganês e ferro, que são necessários para a atividade de
muitas enzimas.
→ Inibir crescimento bacteriano
o EDTA pode ser usado como um inibidor da enzima fosfatase alcalina
(PAL), que é uma enzima que requer íons de zinco para sua atividade
catalítica. Quando o EDTA se liga ao zinco, a PAL perde sua atividade
e é inibida.
Velocidade da Reação Enzimática
Fatores que Afetam a Velocidade de Reação Enzimática
→ Toda enzima é proteína: ação depende da integridade de sua conformação proteica nativa

Tempo de Reação Concentração da Coenzima

→ Manutenção da velocidade de reação
→ Limitado a um consumo de 10% do substrato

→ A velocidade de uma reação enzimática pode decrescer

devido a um tempo de reação prolongado

→ Pode ocorrer:
→ Inversão da reação devido ao acúmulo do produto
→ Inativação da enzima
→ Formação de substâncias inibidoras
→ Esgotamento do substrato
Determinação Enzimática – Erros
Coleta da Amostra

Anticoagulante Hemólise Estase venosa Coagulação Lipemia

Conservação da Amostra

4°C Rapidez Não congelar Estabilidade Proteólise

Medida da Atividade

Tempo, pH, °C [E], [S], reagente Pipetagem Limpeza vidraria Espectrofotômetro

Determinação Enzimática – Enzimas
Estabilidade das Enzimas
Determinações Enzimáticas – Métodos
Metodologias Empregadas Para Determinação das Atividades Enzimáticas
• Analisam o consumo do substrato
→ Dosagem: amilase - Método de Caraway

• Analisam o produto formado (corado)

→ Dosagem: fosfatase alcalina - Método do Paranitrofenol

• Analisam o produto formado (transformado corado)

→ Dosagem: fosfatase alcalina - Método de Roy

• Analisam a A da coenzima da reação enzimática

→ Dosagem: desidrogenase láctica (LDH) - Método do UV
Enzimas Circulantes – Origem
Origem das Enzimas Circulantes
Plasma Específicas: síntese no fígado, liberadas para circulação (função)
→ Colinesterase (CHE)

Plasma Inespecíficas: sintetizadas por diferentes células (função)

→ AST, ALT, GLDH, CK

Uniloculares: ocupam uma posição dentro da célula

→ GLDH – 100% mitocondrial

Biloculares: ocupam duas posições dentro das células

→ AST – 60% citoplasmática e 40% mitocondrial

• Caracterização do tipo de lesão celular

Lesão aguda: enzimas de membrana celular

→ ALT, PAL

Lesão crônica: enzima de organelas

→ AST, GLDH
Enzimas Circulantes
Liberação Celular das Enzimas – Hipótese de Friedel Difusão das Enzimas – Compartimento Sanguíneo
Célula normal → Bomba ATP normal → Vcelular normal → Determinações enzimáticas repetidas: evolução da lesão
 ATP intracelular → Alteração da bomba →  Ca2+/Vcelular
Ca2+ → Ativa filamento intracelular → Poros na membrana
Enzimas citoplasmáticas atravessam poros → REVERSÍVEL

Privação total ATP → Perda da integridade da membrana

IRREVERSÍVEL → MORTE CELULAR → Liberação de enzimas