aula4_enzimas_ep2017

Disciplina de Engenharia de Proteínas
Curso de Ciências Biológicas
Aula 4: Enzimas – Cinética

e Regulação
Prof. Marcos Túlio de Oliveira

mtoliveira@fcav.unesp.br
Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias de Jaboticabal

Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”
Enzimas
GRANDE maioria formada por proteínas
(algumas enzimas são formadas por RNA)
Enzimas
GRANDE maioria formada por proteínas
(algumas enzimas são formadas por RNA)
Função:
CATALIZADORES de reações químicas

(aceleração das reações químicas,
especificidade pelo substrato,
funcionam em diversas condições de temperatura e pH)
Enzimas
+ +
Enzimas
apoenzima holoenzima
metal
Parte Não
proteica .
(cofator)
coenzima
Enzima
holozima
Apoenzima
parte proteica
Coenzimas participam do ciclo catalítico das enzimas recebendo ou fornecendo grupos
químicos para a reação
Enzimas
Enzimas – Classificação
Transferência de elétrons
Normalmente se adiciona o sufixo ase 1. Óxido-redutases
Se uma molécula se
( Reações de óxido-
ao nome do substrato ou à atividade reduz, há outra que se
redução).
oxida.
realizada:
•grupos aldeído
2. Transferases
•gupos acila
(Transferência de grupos
Urease – hidrolisa a uréia funcionais)
•grupos glucosil
•grupos fosfatos (quinases)
DNA-polimerase – polimeriza DNA
•Transformam polímeros em monômeros.
Atuam sobre:
Agora…. 3. Hidrolases •Ligações éster
Nomenclatura oficial das enzimas é (Reações de hidrólise) •Ligações glicosídicas
•Ligações peptídicas
dada pela Enzyme Comission da •Ligações C-N
International Union for Biochemistry
4. Liases •Entre C e C
and Molecular Biology (IUBMB) : (Adição a ligações •Entre C e O
duplas) •Entre C e N
Exemplo... ATPase: EC 3.6.1.3

- é uma hidrolase.........................3 5. Isomerases
(Reações de
- atua num anidrido......................3.6 isomerização)
- o anidrido contém fosfato..........3.6.1
6. Ligases •Entre C e O
- esse anidrido é ATP.....................3.6.1.3 (Formação de ligações •Entre C e S
covalentes com gasto de •Entre C e N
ATP) •Entre C e C
Como Enzimas Funcionam...
sítio ativo
(catalítico)
substrato
enzima
mudança de
energia durante
a reação
como a reação progride

energias de
ativação
variação de energia livre

padrão (bioquímica)
É aqui que as enzimas

agem!!!
... e não aqui!

energia de
ativação SEM
catalizador
energia de
ativação COM
catalizador
intermediários da
reação
passo limitante
da reação
Enzimas
A energia de ativação é monstruosa!!!
+ +
Compare esses números !
Velocidade na Velocidade da
ausência de enzima reação catalisada Poder
Enzima catalítico
“Reações/segundo” “Reações/segundo”
Anidrase carbônica 1.3 X 10 –1 1.0 X 106 7.7 X 106
Triosefosfato isomerase 4.3 X 10 –6 4.300 1.0 X 109
Carboxipeptidase A 3.0 X 10 –9 578 1.9X 1011
AMP nucleosidase 1.0 X 10 –11 60 6.0 X 1012
Nuclease de estafilococos 1.7 X 10 -13 95 5.6 X 1014

sítio ativo
(catalítico)
formação de substrato
ligações
covalentes
transientes
com o enzima
substrato!
Intermediário
ES
(E e S ligados
covalentemente)
sítio de ligação
sítio ativo
(catalítico) formação de
várias ligações
fracas dão
especificidade
para ES!
enzima substrato
energia de
ligação
Maior fonte
de energia
livre usada
por enzimas
para abaixar
as energias de
ativação das
reações
formação de
várias ligações
fracas dão
especificidade
para ES!
Como as Enzimas Funcionam...
Modelo Chave-Fechadura
Modelo chave-fechadura Nesse modelo,

o sítio ativo da enzima é pre-formado e
tem a forma complementar à molécula
do Substrato, de modo que outras
moléculas não teriam acesso a ela.
Modelo de encaixe induzido Nesse

Modelo de encaixe induzido modelo, o contacto com a molécula do
substrato induz mudanças
conformacio-nais na enzima, que
otimizam as intera-ções com os resíduos
do sítio ativo. Esse é o modelo aceito hoje
em dia.
Exemplo do modelo de encaixe induxido
(Carbopeptidase)
Em A: o sítio catalítico dessa enzima é formado pelos resíduos (em vermelho) de Tyr248 (acima, à
direita) e de Glu270 (centro), e um átomo de Zn2+, que está acima do Glu270.
A B
Em B: A ligação do substrato dipeptídico glicil-L-tirosina (em verde) causa uma profunda mudança
conformacional nas vizinhanças do sítio ativo da carboxipeptidase A.
substrato
estado de
transição
Cinética Enzimática
Determinar a taxa (velocidade) da reação e como esta
muda em resposta a mudanças nos parâmetros
experimentais – abordagem central para estudar o
mecanismo de reações catalisadas por enzimas.
[S] muda com o passar do tempo em uma reação
enzimática in vitro. E daí?
[S]
1 2 3 4 5 6
tempo
[S] [E]
Enzima funciona a todo vapor e a mudança na [S] é

mínima durante o estágio inicial da reação.
[S]
15 30 45 60
tempo
É por isso que a gente olha para a velocidade inicial (V0)
Praticamente linear; ou Saturação! Não adianta
seja, quanto mais adicionar substrato, a V0 não
substrato, maior a V0 muda significativamente.
[S], [S],
portanto portanto
[ES] é [E] é
favorecido favorecido
[S], [S],
portanto portanto
[ES] é [E] é
favorecido favorecido
Equação de Michaelis-Menten:
V0 = Vmax [S]
Km + [S]
V0 = Vmax [S]
Km + [S]
Km = k-1 = Kd
k1
Nesta condição, Km mede a afinidade da
enzima pelo substrato
Interação Proteína-Ligante
concentração do ligante
porcentagem dos sítios de ligação ocupados
concentração constante da proteína
kcat
descreve a taxa do passo limitante da reação
equivalente ao número de moléculas de

substrato convertidas a produto em uma
unidade de tempo em uma molécula de enzima,
quando a enzima está saturada com substrato
Número moles de S catalisado por segundo

de = moles de enzima
turnover
Eficiência catalítica
kcat/Km Parâmetro mais adequado para
comparações cinéticas
Fatores que afetam a atividade enzimática
Condições do meio que afetam estabilidade protéica
• pH
• temperatura
% atividade enzimática máxima
O pH ótimo de uma enzima reflete

variações no estado de ionização de
resíduos de aminoácidos do sítio
ativo.
pH ótimo=1,5 pH ótimo=6,8 pH ótimo=9,9

Fatores que afetam a atividade enzimática
1. Fatores que afetam a estabilidade proteica das enzimas

• Variações de pH: pH ótimo
• Variações de temperatura: temperatura ótima
Desnaturação
% atividade enzimática máxima
100- térmica da
Temperatura proteína
ótima
Pouca energia
50- para a reação
acontecer Ao contrário da curva em
forma de sino no caso da
atividade enzimática versus
pH, a enzima só está
0-
desnaturada em temperaturas
acima da temperatura ótima.
equação
y = a.x + b da reta
Inibição Enzimática
irreversível
reversível
Vmax não
muda
Km aumenta
Vmax diminui
Km diminui
Vmax diminui
Km aumenta
Enzimas Reguladoras
presentes em sistemas multienzimáticos...
+ +
Enzimas Reguladoras
geralmente possuem
subunidades múltiplas...
sítio ativo e sítio(s) regulador(es)

em subunidades separadas
Enzimas Alostéricas
formas mais ou menos

ativas são geradas por
alterações de
conformação induzidas
por um ou mais
moduladores...
formas mais ou menos ativas são

geradas por alterações de
conformação induzidas por um ou
mais moduladores...
sigmóide hiperbólica
alteração no K0.5
alteração na Vmax
Modificações Covalentes Reversíveis
Proproteínas, Proenzimas e Zimogênios
precursor inativo que precisa ser clivado para gerar a
forma ativa...
modificações irreversíveis
pró-colágeno → colágeno
fibrogênio → fibrina
protrombina → trombina
pró-insulina → insulina
quimotripsinogênio → quimotripsina
tripsinogênio → tripsina
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Próxima aula: 06/09 – Engenheirando Proteínas

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CATALIZADORES de reações químicas

Exemplo... ATPase: EC 3.6.1.3

como a reação progride

variação de energia livre

É aqui que as enzimas

... e não aqui!

A energia de ativação é monstruosa!!!

Anidrase carbônica 1.3 X 10 –1 1.0 X 106 7.7 X 106

Triosefosfato isomerase 4.3 X 10 –6 4.300 1.0 X 109

Carboxipeptidase A 3.0 X 10 –9 578 1.9X 1011

AMP nucleosidase 1.0 X 10 –11 60 6.0 X 1012

Nuclease de estafilococos 1.7 X 10 -13 95 5.6 X 1014

Modelo chave-fechadura Nesse modelo,

Modelo de encaixe induzido Nesse

Enzima funciona a todo vapor e a mudança na [S] é

descreve a taxa do passo limitante da reação

equivalente ao número de moléculas de

Número moles de S catalisado por segundo

O pH ótimo de uma enzima reflete

pH ótimo=1,5 pH ótimo=6,8 pH ótimo=9,9

1. Fatores que afetam a estabilidade proteica das enzimas

sítio ativo e sítio(s) regulador(es)

formas mais ou menos

formas mais ou menos ativas são

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