Aula Enzimas

Enzimas
Selmo
Bioquímica - Fernando Licenciatura em Química
Introdução às Enzimas - Histórico
Primeiras observações – Séc. XVIII e Início do séc. XIX

 Digestão da carne por secreções do estômago.
 Payen e Persoz - Conversão do amido em açúcar pela saliva.
1850 – Louis Pasteur

 Fermentação de açúcar em álcool por leveduras é catalisada por “fermentos”
inseparáveis da estrutura das células de leveduras vivas.
 Base para a ideia do vitalismo.
1897 – Eduard Buchner

 Extratos de leveduras podem fermentar açúcar em álcool sem a necessidade de
células vivas, provando que os “fermentos” são moléculas.
 Final da visão vitalista e intensificação das pesquisas bioquímicas.
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Introdução às Enzimas - Histórico
1898 - Friedrich Wilhelm Kühne

 Cunhou o termo Enzima para as moléculas detectadas por Buchner.
 Enzima → En = dentro; zyme = levedura.
1926 – James Summer

 Isolamento e cristalização da urease, cujos cristais eram formados por proteína.
 Postulou que toda enzima é uma proteína.
1930 – John Northrop e Moses Kunitz

 Cristalização da pepsina, tripsina e outras enzimas digestivas, cujas estruturas
eram proteicas.
1930 – J. B. S. Haldane
 Escreveu o tratado intitulado Enzymes.
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Introdução às Enzimas
Conceito de Enzimas
Enzimas são moléculas que atuam como catalisadores biológicos de
reações químicas no ambiente celular, de modo a facilitar a ocorrência de
tais reações.
Importância da catálise no ambiente celular

 Reações químicas nas células são muito lentas – moléculas biológicas são muito
estáveis nas condições celulares (pH neutro, temperaturas amenas controladas e
ambiente aquoso).
 Formação de intermediários instáveis carregados e colisão de moléculas em

orientação necessária para a ocorrência de reação entre elas são improváveis no
ambiente celular.
 Reações termodinamicamente favoráveis não ocorrem em quantidades relevantes

ou detectáveis nas condições celulares.
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Introdução às Enzimas
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Propriedades e Características das
Enzimas
1) Maioria das enzimas são proteínas globulares, de alto peso molecular,
com estrutura terciária complexa.
 Exceção: Ribozimas – moléculas de

RNA com atividade catalítica
Estrutura da enzima DNA polimerase
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Enzimas
2) Enzimas são muito maiores e mais complexas que seus substratos,
com pesos moleculares elevados e dobramentos tridimensionais complexos.
Substrato
Molécula específica sobre a qual a enzima atua para Enzima hexoquinase
catalisar determinada reação (azul) e seu substrato D-
glicose (em vermelho)
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Enzimas
3) Enzimas são altamente específicas para seus substratos e para o tipo
de reação a ser catalisada, inclusive com estereo-especificidade.
Sítio ativo ou Sítio catalítico

Região específica da estrutura enzimática onde se liga seu substrato específico e
ocorre a catálise.
Sítio ativo é delimitado por cadeias laterais de amino-

ácidos que interagem com o substrato e catalisam sua
transformação química.
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Enzimas
4) Enzimas atuam diminuindo a energia de ativação necessária para se
iniciar uma reação, acelerando sua ocorrência.
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Alguns Conceitos em Catálise
Energia de Ativação
Quantidade de energia (em calorias ou Joules) necessária para se levar 1 mol de
uma substância ao estado de transição.
 Constitui a barreira energética da reação, ou seja, a quantidade de energia que
separa produtos de reagentes.
 Energia de ativação garante estabilidade molecular, evitando reações inadequadas.
Estado de transição ou Complexo ativado

Forma ativada de uma molécula, em que a mesma já atingiu o ápice energético
para sofrer uma reação (venceu a barreira energética).
 Forma intermediária entre reagentes e produtos.
 Forma altamente energética e instável.
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Enzimas
4) Enzimas atuam diminuindo a energia de ativação necessária para se
iniciar uma reação, acelerando sua ocorrência.
Catalisador diminui a barreira energética, criando um percurso alternativo para
formação do estado de transição.
Estado de transição
Reação não
catalisada
Energia
de
ativação
Energia
Substrato (S) Reação

catalisada
Produto (P)
Progresso da reação
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Enzimas
5) Eficiência catalítica das enzimas é superior à dos catalisadores químicos.
Enzimas podem acelerar reações até 1014 vezes contra 102 – 103 vezes dos
catalisadores inorgânicos.
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Enzimas
6) Enzimas aumentam a velocidade de ocorrência de uma reação, sem
alterar o seu equilíbrio e sem serem consumidas durante a reação.
Velocidade na ausência de Velocidade da reação
Enzima enzima catalisada
Reações/segundo Reações/segundo
Anidrase carbônica 1.3 X 10 –1 1.0 X 106

Triosefosfato isomerase 4.3 X 10 –6 4.300
Carboxipeptidase A 3.0 X 10 –9 578
AMP nucleosidase 1.0 X 10 –11 60
Nuclease de estafilococos 1.7 X 10 -13 95
7) Enzimas são necessárias em concentrações muito menores que seus

substratos, já que não são consumidas durante a catálise.
8) Enzimas atuam no ambiente aquoso celular e em condições amenas de

temperatura e pH (maioria).
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Nomenclatura Enzimática
Nome usual
 Nomes atribuídos sem regras sistematizadas e consagrados pelo uso.
 Exs: Tripsina, pepsina e ptialina.
Nome recomendado
 Nome do substrato ou de uma ação da enzima seguido do sufixo “ase”.
 Exs: lactase, amilase, DNA polimerase, fosfatase.
Nome sistemático
 Nome recomendado pela International Union of Biochemistry and Molecular
Biology (IUBMB).
 Fornece informações mais precisas sobre a função metabólica da enzima.
 Ex: ATP-Glicose-Fosfo-transferase.
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Nomenclatura Enzimática
Nome recomendado Creatinaquinase
Nome sistemático ATP: creatina fosfotransferase
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Classificação Enzimática
Transferência de elétrons
1. Óxido-redutases
Se uma molécula se
Classificação Internacional de ( Reações de óxido-
reduz, há outra que se
redução).
Enzimas - IUBMB oxida.
• Grupos aldeído
6 Classes de Enzimas, de acordo 2. Transferases
• Grupos acila
(Transferência de grupos
com o tipo de reação catalisada e • Grupos glucosil
funcionais)
• Grupos fosfatos (quinases)
o substrato envolvido
Transformam polímeros em monômeros.
Atuam sobre:
3. Hidrolases • Ligações éster
Nomenclatura oficial das enzimas é (Reações de hidrólise) • Ligações glicosídicas
dada pela Enzyme Comission (EC) da • Ligações peptídicas
• Ligações C-N
IUBMB
• Entre C e C
4. Liases
• Entre C e O
(Adição a ligações duplas)
Ex: ATPase (Adenosinatrifosfatase) • Entre C e N
EC 3.6.1.3
- É uma hidrolase.........................3 5. Isomerases

(Reações de isomerização)
- Atua num anidrido......................3.6
- Anidrido contém fosfato.............3.6.1
6. Ligases • Entre C e O
- Anidrido é ATP............................3.6.1.3 (Formação de laços • Entre C e S
covalentes com gasto de • Entre C e N
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Bioquímica - Fernando ATP) • Entre C e C
1) Óxido-redutases
 Catalisam reações de oxidação-redução ou transferência de elétrons.
Ex: Desidrogenases e Oxidases.
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2) Transferases
 Catalisam a transferência de grupos funcionais como amina, fosfato, acil ou
carboxil de uma molécula para outra. Ex: Quinases e Transaminases.
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3) Hidrolases
 Catalisam reações de hidrólise de ligações covalentes, transformando polímeros
em monômeros. Ex: Peptidases e Nucleases.
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4) Liases
 Catalisam a adição ou a remoção de moléculas de água, amônia e gás carbônico
a outras moléculas, quebrando ou formando ligações duplas. Ex: Descarboxilases.
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5) Isomerases
 Catalisam reações de interconversão entre isômeros geométricos e ópticos.
Ex: Epimerases.
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6) Ligases
 Catalisam reações de formação de novas moléculas a partir da ligação covalente
entre duas moléculas mais simples, com gasto de energia. Ex: Sintetases.
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Princípio do Funcionamento Enzimático
Importância da Energia de Ativação

 Permitir o alinhamento favorável de grupos reagentes.
 Formar cargas instáveis transitórias nos reagentes.
 Rearranjar ligações químicas.
 Permitir outras transformações dos reagentes necessárias à ocorrência da reação.
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Papel das Enzimas na Redução da Energia de Ativação

A) Reações transitórias entre substrato(s) e grupos funcionais da enzima
 Facilita o rearranjo de ligações covalentes do substrato durante a reação.
 Podem ocorrer interações covalentes transitórias entre S e E, ou a transferência
de grupos da E para o S e vice-versa, facilitando a reação.
B) Interações fracas não-covalentes entre enzima e substrato

 Energia de ligação liberada por interações não-covalentes é a fonte de energia
para a redução da energia de ativação.
 Fixação do substrato no sítio ativo da enzima, facilitando o contato adequado.
 Orientação correta do substrato num arranjo apropriado para a reação.
 Aumento da reatividade do substrato por lhe conferir carga ou polaridade.
 Aumento da instabilidade do substrato (deformação), pressionando quebra de
ligações.
 Dessolvatação do substrato, pressionando quebra de ligações.
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Grupo reativo Intermediário

Enzimas
no sítio ativo covalente
Quimotripsina
Elastase
Esterases
Trombina
Tripsina
Papaína
Gliceraldeído-3-PO4
desidrogenase
Fosfatase alcalina
Fosfoglicomutase
Fosfoglicerato mutase
Succinil-CoA sintase
Formação de intermediários
Aldolase covalentes entre grupos
Descarboxilases
funcionais da enzima e do
Enzimas dependentes
substrato
de piridoxal fosfato
Papel das Enzimas na Redução da Energia de Ativação
Formação de interações fracas entre

grupos funcionais da enzima
(carboxipeptidase) e do substrato
(proteína)
Selmo
Exemplo – Mecanismo de ação da Quimotripsina (serino-protease)

Enzima interage
com substratos
aromátcos Ligação a ser hidrolisada H2O entra no sítio
ativo e forma
Tríade catalítica uma ponte de H+
Ser – His - Asp com a His-57
H2O transfere H+
para His-57 e –OH
Ser-195 transfere H+
para o substrato.
para His-57. Asp-102
estabiliza H+ na His-
57 com ligação iônica
H+ é transferido da His-
H+ é transferido da 57 de volta para Ser-
His-57 para o 195. A enzima retorna
substrato e a ao estado inicial
ligação peptídica é
clivada.
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Especificidade Enzimática
Modelo Chave e Fechadura (Emil Fischer, 1894)

Sítio ativo da enzima seria estruturalmente complementar ao substrato.
Neste modelo, o substrato se encontraria numa forma

altamente estabilizada, o que inviabilizaria a reação.
Selmo
Modelo de Ajuste (Encaixe) Induzido (Daniel Koshland, 1958)

Sítio ativo da enzima seria estruturalmente complementar ao estado de transição do
substrato.
 Neste modelo, enzima e substrato sofrem alterações conformacionais para permitir

melhor encaixe e otimizar as interações fracas entre eles.
 Substrato sofre distorção na sua conformação, tornando-se mais instável, de modo

a favorecer a reação.
Selmo
Modelo de Ajuste Induzido (Daniel Koshland, 1958)

Maior parte das interações entre enzima e substrato ocorre no estado de transição
Ajuste induzido na enzima

hexoquinase mediante ligação
da D-glicose (substrato)
Selmo
Cinética Enzimática
Cinética Enzimática estuda o mecanismo cinético da combinação entre Enzima e
Substrato, ou seja, a velocidade das reações enzimáticas.
Leonor Michaelis (1875 – 1949) Maud Menten (1879 – 1960)

Bioquímico enzimologista Pediatra
Selmo
O gráfico ilustra a variação das concentrações de E, S e P ao longo do tempo
de uma reação catalisada por enzima.
Selmo
[S] Fator-chave na velocidade das reações catalisadas por enzimas
V0 é a velocidade obtida no
primeiro minuto de reação.
Obtida a partir da [S] que

reage ou da [P] formado por
unidade de tempo (min).
Selmo
E+S ES E+P
↑ [S] ↑ [ES]
[E] desprezível
↓ [S] ↑ [E]
Velocidade máxima
da reação (Vmax)
Favorece
formação de ES
Saturação da
Aumenta enzima
velocidade da
reação
Selmo
k1 k2
E+S ES E+P
k-1
Etapa mais lenta da
reação (limitante)
Medida da tendência de
Constantes
k1, k-1 e k2 ocorrência de uma reação sob
de velocidade
determinadas condições.
↑ k2 Maior velocidade
V0 = k2 . [ES]
↓ k2 Menor velocidade
Selmo
k1 k2
E+S ES E+P
K-1
Velocidade de formação de ES Vf = k1 . ([Et] - [ES]) . [S]
Velocidade de quebra de ES Vd = k-1 . [ES] + k2 . [ES]
Hipótese do estado estacionário [ES] constante Vf = Vd
Equação de Michaelis-Menten
V0 = Vmax . [S] Vmax → Velocidade máxima da reação.
Km + [S] Km → Constante de Michaelis.
Selmo
k1 k2
E+S ES E+P
K-1
Km – Constante de Michaelis
Km corresponde à concentração do
substrato (Km = [S]), em que V0 = ½ Vmax
Tendência de quebra
de ES
Km = k-1 + k2
k1
Tendência de formação
de ES
Selmo
Indicativo do grau de afinidade da enzima pelo seu substrato
Km = k-1 + k2
k1
↓ Km ↑ Km
↓ (k-1 + k2) ou ↑ k1 ↑ (k-1 + k2) ou ↓ k1
Maior tendência de Maior tendência de

formação de ES (Vf > Vd) quebra de ES (Vd > Vf)
Alta afinidade Baixa afinidade
Selmo
Hexoquinase
Quimotripsina
Aspartato
aminotransferase
Selmo
kcat – Constante catalítica
Mede o poder catalítico de uma enzima, referindo-se a uma constante de
velocidade geral de uma reação catalisada.
Também conhecida como Número de Renovação ou Número de Turnover -

Número de moléculas de substrato convertidas em produto por unidade de tempo
por uma única molécula de enzima em condições ideais.
Vmax = kcat [Et] Equação de Michaelis-Menten
kcat = Vmax V0 = Vmax . [S]

[Et]
Km + [S]
V0 = kcat . [Et] . [S]

Km + [S]
Selmo
Constante Kcat / km – Constante de Especificidade
Mede a eficiência catalítica da enzima.
↑ kcat Alto poder catalítico Maior eficiência

↑ (kcat / Km) catalítica da
↓ km Alta afinidade enzima
↓ kcat Baixo poder catalítico Menor eficiência

↓ (kcat / Km) catalítica da
↑ km Baixa afinidade enzima
Selmo
Fatores que afetam a velocidade das
reações enzimáticas
 Concentração do Substrato - [S].
 Concentração da Enzima – [E].
 pH.
 Temperatura.
 Presença de inibidores enzimáticos.
 Presença de reguladores enzimáticos.
Selmo
1) Concentração do Substrato – [S]
Selmo
Baixa
concentração
de substrato
100% de
saturação do
sítio ativo da
enzima
Formação do Produto é proporcional à concentração do substrato

Selmo
Substrato em excesso
Selmo
Selmo
2) Concentração da Enzima – [E]
Velocidade de uma reação enzimática é diretamente proporcional à [E].
Selmo
pH
pH pode interferir no grau de
protonação e desprotonação de
resíduos de aminoácidos do sítio
ativo da enzima ou do substrato.
Interferência na ligação do
substrato à enzima ou na catálise
Variação de pH pode alterar

conformação nativa da enzima,
podendo ocorrer desnaturação da
enzima e perda de sua conformação
tridimensional em pHs extremos.
Selmo
Temperatura
100-
Temperatura Desnaturação
ótima térmica da
proteína
Pouca energia
50- para a reação
acontecer
0-
 Aumento da temperatura aumenta velocidade da reação enzimática até uma

temperatura máxima (ótima).
 Aumento da temperatura acima da temperatura ótima promove desnaturação da
enzima e perda da atividade.
Selmo
Temperatura
Selmo
Inibidores enzimáticos
A) Inibição Reversível
 Molécula inibidora se combina com a enzima por meio de interações fracas,
afetando seu funcionamento.
 Combinação da molécula inibidora com a enzima é reversível.
Selmo
Inibição Reversível – Inibidor competitivo

 Compete com o substrato pela ligação ao sítio ativo da enzima, impedindo a
ligação do substrato.
 Tem estrutura similar ao substrato e, em geral, não é catalisado pela enzima.
 Inibição pode ser revertida com aumento da concentração de substrato.
 Exemplo – Tratamento da intoxicação por metanol com a infusão de etanol.
Selmo
Inibição Reversível – Inibidor competitivo
 Ocorre aumento de Km por um fator α.

 Não há alteração de Vmax.
Selmo
Inibição Reversível – Inibidor incompetitivo

 Inibidor é análogo ao estado de transição (ES) da enzima e se liga em um sítio
diferente do sítio ativo.
Selmo
Inibição Reversível – Inibidor incompetitivo
 Não há alteração no Km.
 Ocorre diminuição de Vmax.
Selmo
Inibição Reversível – Inibidor não-competitivo ou misto

 Inibidor liga-se a um sítio da enzima diferente do sítio ativo, podendo se ligar à
enzima livre ou ao complexo ES.
 Aumento da concentração do substrato não reduz efeito inibitório.
Selmo
Inibição Reversível – Inibidor não-competitivo ou misto
 Ocorre aumento no Km.
 Ocorre diminuição de Vmax.

Selmo
B) Inibição Irreversível
 Molécula inibidora se combina com a enzima por meio de ligação covalente ou
interações fracas altamente estáveis, inutilizando a enzima.
 Inativadores suicidas – Molécula que se combina com o sítio ativo da enzima e,
ao ser catalisado por esta, gera um produto que se combina irreversivelmente com a
enzima.
 Exemplo de inibidor irreversível – Inseticidas organofosforados, que inibem a

enzima acetilcolinesterase.
Selmo
Reguladores enzimáticos
Controle alostérico
 Enzimas alostéricas possuem uma região diferente do sítio ativo para ligação de
um efetor ou modulador alostérico, que induz mudança conformacional na enzima.
 Essa mudança conformacional se propaga pela molécula da enzima e afeta o sítio
ativo, ativando-o ou inibindo-o.
Selmo
Modulador positivo (ativador) Modulador negativo (inibidor)

Regulador alostérico se liga ao Regulador alostérico se liga ao sítio
sítio alostérico da enzima e induz alostérico da enzima e induz mudança
mudança conformacional que conformacional que dificulta ou impede
facilita a ligação ao substrato e a ligação ao substrato e sua catálise
sua catálise (forma ativa) (forma inativa)
Selmo
Selmo
Controle alostérico por cooperatividade
Selmo
Controle alostérico por

retroalimentação
(Feedback)
Selmo
Regulação por modulação covalente
Selmo
Regulação por modulação covalente

 Ex: Regulação da enzima glicogênio fosforilase b por fosforilação e
desfosforilação.
Selmo
Regulação por clivagem proteolítica

 Ex: Ativação de zimogênios
Selmo

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Primeiras observações – Séc. XVIII e Início do séc. XIX

1850 – Louis Pasteur

1897 – Eduard Buchner

1898 - Friedrich Wilhelm Kühne

1926 – James Summer

1930 – John Northrop e Moses Kunitz

Importância da catálise no ambiente celular

 Formação de intermediários instáveis carregados e colisão de moléculas em

 Reações termodinamicamente favoráveis não ocorrem em quantidades relevantes

 Exceção: Ribozimas – moléculas de

Estrutura da enzima DNA polimerase

Sítio ativo ou Sítio catalítico

Sítio ativo é delimitado por cadeias laterais de amino-

Estado de transição ou Complexo ativado

Substrato (S) Reação

Anidrase carbônica 1.3 X 10 –1 1.0 X 106

7) Enzimas são necessárias em concentrações muito menores que seus

8) Enzimas atuam no ambiente aquoso celular e em condições amenas de

Nome recomendado Creatinaquinase

Nome sistemático ATP: creatina fosfotransferase

- É uma hidrolase.........................3 5. Isomerases

Importância da Energia de Ativação

Papel das Enzimas na Redução da Energia de Ativação

B) Interações fracas não-covalentes entre enzima e substrato

Grupo reativo Intermediário

Papel das Enzimas na Redução da Energia de Ativação

Formação de interações fracas entre

Exemplo – Mecanismo de ação da Quimotripsina (serino-protease)

Modelo Chave e Fechadura (Emil Fischer, 1894)

Neste modelo, o substrato se encontraria numa forma

Modelo de Ajuste (Encaixe) Induzido (Daniel Koshland, 1958)

 Neste modelo, enzima e substrato sofrem alterações conformacionais para permitir

 Substrato sofre distorção na sua conformação, tornando-se mais instável, de modo

Modelo de Ajuste Induzido (Daniel Koshland, 1958)

Ajuste induzido na enzima

Leonor Michaelis (1875 – 1949) Maud Menten (1879 – 1960)

Obtida a partir da [S] que

Velocidade de quebra de ES Vd = k-1 . [ES] + k2 . [ES]

Hipótese do estado estacionário [ES] constante Vf = Vd

V0 = Vmax . [S] Vmax → Velocidade máxima da reação.

Km + [S] Km → Constante de Michaelis.

↓ (k-1 + k2) ou ↑ k1 ↑ (k-1 + k2) ou ↓ k1

Maior tendência de Maior tendência de

Também conhecida como Número de Renovação ou Número de Turnover -

Vmax = kcat [Et] Equação de Michaelis-Menten

kcat = Vmax V0 = Vmax . [S]

V0 = kcat . [Et] . [S]

↑ kcat Alto poder catalítico Maior eficiência

↓ kcat Baixo poder catalítico Menor eficiência

 Concentração do Substrato - [S].

 Concentração da Enzima – [E].

 Presença de inibidores enzimáticos.

 Presença de reguladores enzimáticos.

Formação do Produto é proporcional à concentração do substrato

Velocidade de uma reação enzimática é diretamente proporcional à [E].

Variação de pH pode alterar

 Aumento da temperatura aumenta velocidade da reação enzimática até uma

Inibição Reversível – Inibidor competitivo

Inibição Reversível – Inibidor competitivo

 Ocorre aumento de Km por um fator α.

Inibição Reversível – Inibidor incompetitivo

Inibição Reversível – Inibidor incompetitivo

 Não há alteração no Km.