Bioquímica I

Enzimas
Catálise biológica → início séc. XIX
digestão da carne: estômago
digestão do amido: saliva

1850
Louis Pasteur - concluiu que a fermentação do açúcar em
álcool pela levedura era catalisada por “fermentos” os
quais seriam inseparáveis das células vivas.

Eduard Buchner (1897)

extratos de levedo podiam fermentar o açúcar até álcool;
enzimas funcionavam mesmo quando removidas da célula
viva.
James Sumner (1926)
Isolou e cristalizou a urease;
Cristais eram de proteínas;
Postulou que “todas as enzimas são proteínas”.

John Northrop (década 30)

Cristalizou a pepsina e a tripsina bovinas;

Década de 50 – séc. XX
75 enzimas → isoladas e cristalizadas;
Ficou evidenciado caráter proteico .

Atualmente - Mais de 2000 enzimas são conhecidas.

Definição:
Catalisadores biológicos;
Longas cadeias de pequenas moléculas chamadas aminoácidos.

Função:
Viabilizar a atividade das células, quebrando moléculas ou
juntando-as para formar novos compostos.

Com exceção de um pequeno grupo de moléculas de RNA com

propriedades catalíticas, chamadas de RIBOZIMAS, todas as enzimas
são PROTEÍNAS.
ENZIMAS – CARACTERÍSTICAS GERAIS

•Apresentam alto grau de especificidade;

•São produtos naturais biológicos;

•São altamente eficientes, acelerando a velocidade das reações;

•São econômicas, reduzindo a energia de ativação;

• Precisam de condições favoráveis de pH, temperatura, polaridade do solvente e força

iônica.

5
ENZIMAS – ESTRUTURA

Estrutura Holoenzima
Enzimática

Proteína Cofator

Ribozimas
Apoenzima ou Pode ser:
Apoproteína • íon inorgânico
• molécula orgânica
RNA
Coenzima

Se covalente

Grupo Prostético

6
As coenzimas agem como carreadores
transitórios de grupos funcionais específicos.
Parte da coenzima que não é
sintetizada pelo organismo

Diferentemente do substrato, é
reciclada em reações subsequentes.
ENZIMAS – NOMENCLATURA
Século XIX - poucas enzimas identificadas

Adição do sufixo ”ASE” ao nome do substrato:

* gorduras (lipo - grego) – LIPASE

* amido (amylon - grego) – AMILASE

Se o substrato for ligação peptídica:

* Tripsina e pepsina – PEPTIDASE

10
Enzimas – nomenclatura
Existem 3 métodos para nomenclatura enzimática:

• Nome Recomendado: Mais curto e utilizado no dia a dia de quem trabalha com enzimas. Usa o
sufixo "ase" para caracterizar a enzima. Ex: Urease, Hexoquinase, Peptidase, etc.

• Nome Sistemático: Mais complexo, dá informações precisas sobre a função metabólica da enzima.
Ex: ATP-Glicose-Fosfo-Transferase

• Nome Usual : Consagrado pelo uso. Ex: Tripsina, Pepsina.

Classificação internacional das enzimas:

Hexocinase
Glicose + ATP Glicose-6-fosfato + ADP + H+

ATP:glicose-fosfotransferase (E.C. 2.7.1.1.)

Classe
(transferase)
Glicose como aceptor do
Subclasse
Grupo OH como grupo fosforil
(fosfotransferase)
aceptor
❖ Enzimas:

Fonte: Smith, C.; Marks, A. D.; Lieberman, M. Bioquímica médica básica de Marks. 2 ed. Porto Alegre : Artmed, 2007.
Sítio ativo:

• Fenda tridimensional

• Ocupa uma parte pequena da enzima

• É um microambiente especial

Aldolase
❖ Sítio ativo:
• Substratos se ligam por atrações Isocitrato desidrogenase
fracas
• Especificidade depende do arranjo
de átomos no sítio ativo
 Energia de ligação

Restrição de mobilidade do substrato

Dessolvatação
Ajuste induzido
❖ Fatores que interferem da atividade enzimática:

☛ pH: ionização dos aminoácidos

-COO
-
-NH3+

-COOH -COO
-
-NH +
3 -NH2
Efeito da temperatura na atividade das enzimas

Quanto maior a temperatura, mais moléculas atingem o estado de transição

Desnaturação

Contudo, altas temperaturas também

desnaturam as proteínas.
 A energia de ativação é necessária para
Reação não catalisada se chegar ao estado de transição e a
T1<T2 reação ocorrer.

Enzimas não alteram o estado de

equilíbrio

Abaixam a energia de ativação;

Keq não é afetada pela enzima.

Não apresenta efeito termodinâmico

Reação catalisada global
Energia de ativação menor G não é afetada pela enzima.
Mais moléculas atingem o estado de transição
O catalisador aumenta a velocidade da reação ao diminuir a energia de ativação, o valor de ∆G não se altera.

Um valor de ∆G negativo indica que um processo é espontâneo, mas não indica a velocidade na qual ocorre.
Acoplamento de reações
 *A atividade enzimática é a taxa de formação de produto no
tempo. Ela deve se basear em medida de velocidade inicial
(v0) da reação.

*A unidade internacional utilizada se chama U (unidade de

atividade enzimática).
Parte linear da curva catalisada por
enzima está relacionada a *1 U = 1 µmol de formação de produto por minuto. Pode ser
velocidade inicial (v0) da reação. dividido pelo volume da amostra (U/L)
Minutes
Isso se converte no parâmetro de
atividade enzimática. *Eventualmente pode ser apresentada em outras unidades.

0.7 *Portanto, é somente uma variação da unidade para medida

de velocidade da reação (mol.L-1s-1).
concentração de produto

0.6
Amostra 1
*A medida de v0 NÃO é feita no equilíbrio.
(Absorbância)

0.5
Amostra 2
0.4

0.3

0.2

0.1

0
0 5 10 15 20 25 30

Minutos de reação
 • Parte linear da curva catalisada por enzima está
relacionada a velocidade inicial (v0) da reação.

• Isso se converte no parâmetro de atividade enzimática.

Minutes

0.7
concentração de produto

0.6
Amostra 1
(Absorbância)

0.5
Amostra 2
0.4

0.3

0.2

0.1

0
0 5 10 15 20 25 30

Minutos de reação
 Ao ser clivado, o substrato gera dois
produtos, sendo um deles com cor.
Portanto, a sua concentração pode ser
determinada ao se medir a absorbância.

Ao determinar a concentração do
+ produto, é possível medir sua
variação no tempo, determinando a
velocidade inicial (v0) da reação.
Produtos
Substrato sintético
(simula uma molécula Na prática, é mais fácil medir a formação de produto no tempo, do que o consumo de substrato.
natural, mas é menor e
possui um cromóforo)
Velocidade inicial V0, linear.
Importante para comparações de velocidade.
Se fizéssemos a comparação fora da região
linear, a reação catalisada enzimaticamente e
não-catalisada, em determinado momento,
poderiam aparentar ter a mesma velocidade!

Velocidade não-inicial, não

é mais linear.
É mais difícil e ineficiente
comparar velocidades. Quando na verdade, a diferença é muito grande na
velocidade, por isso o conceito de velocidade inicial é
importante.

A velocidade é proporcional à concentração de substrato, portanto ela varia ao longo da reação.

 Estado estacionário
medida de V0
[S] – assume-se que é constante frente a
sua pequena variação e alta concentração.
E = enzima livre
[S] >>> [E].
ES = complexo enzima-substrato
S = substrato
P = produto [ES] e logo [E] são constantes, v1 = v-1 + v2

k1 > k -1 >>> k2, portanto, a etapa limitante

do processo é determinada por k2.

v 0= v2 = k2[ES]

Baixa [P] ao longo do estado estacionário

faz com que a reação reversa não ocorra.
Muito rápido
 Efeito da concentração de substrato na formação do complexo ES.

Lembrando que a velocidade da reação vai ser proporcional à

Estado Estado quantidade de complexo ES formado. v0 = k2[ES]
estacionário estacionário

V0I < V0II < V0III

*Portanto, v0 pode variar de acordo com a concentração do

substrato [S].

*É maior conforme [S] aumenta, pois mais complexo ES se

forma (mesmo com [E] constante).

*Logo, haverá uma v0 maior que todas as outras a partir de uma

determinada [S], chamada de velocidade máxima (vmax), na
qual toda [E] está na forma [ES].
 1 2
1. Ao se aumentar [S], para uma [E]
constante, v0 aumenta até atingir vmax.

2. v0 é diretamente proporcional à
concentração de enzima [E].

3. Em diferentes [E], o vmax será relativo.

Cada ponto de [S] equivale a uma situação de
saturação da enzima, e formação de ES
mostrada no slide anterior, no qual foi feita uma
medida de velocidade inicial da reação.
3
 k2

k2

KM não muda para a mesma enzima, pois é a relação

Um alto KM indica que relativamente “desfaz mais ES” do
entre constantes!
que se forma, ou “forma pouco ES”.

Um baixo KM indica que relativamente “desfaz menos ES”

do que se forma, ou quer dizer que “forma mais ES”.

Portanto, ao se comparar o KM para diferentes enzimas

que catalisam a mesma reação, pode-se correlacionar que
baixo KM indica maior “afinidade” da enzima pelo
substrato. Indica que a enzima tem mais propensão a
formar ES.
KM não muda para a mesma enzima, pois é a relação
entre constantes!

Não importa [E], KM não muda, diferentemente de Vmax que

aumenta conforme se aumenta a concentração de enzima [E].

KM igual para diferentes [E].

 Para se comparar a eficiência catalítica de duas enzimas, faz-se uma razão
entre kcat / KM

k2 = kcat
v2 = kcat [ES]

turnover number (s-1)= kcat

é a mesma relação com o valor de k explicado no
início da aula para reação de primeira ordem.
Quanto maior, maior será o número de ciclos por
segundo que a enzima realiza.
 Estado estacionário
medida de V0
E = enzima livre
ES = complexo enzima-substrato
S = substrato
P = produto

[E] = [Etotal] – [ES]

A equação de Michaelis-Menten
A equação de Michaelis-Menten

Numericamente, a [S] na qual v0 é

metade de vmax é igual ao valor de KM
 Plote de Lineweaver-Burk
Usa-se os inversos de v0 e [S] para que a curva adquira
aspecto linear. Assim, é possível se obter uma valor
aproximado de vmax e KM.
Inibidores Irreversíveis
Inibidores Reversíveis

Competitivo
Não-competitivo
Como compete pelo sítio ativo, é necessário maior
[S] para se atingir vmax/2, assim como vmax.
Atinge-se o mesmo vmax, mas KM muda.
Inibidores Reversíveis

Competitivo
Não-competitivo

KM não muda, mas não se atinge o mesmo vmax

Na prática é como se [E] fosse menor, pois o inibidor

inativa a enzima temporariamente, mas não se liga no
sítio ativo.
Inibidores podem ser usados como medicamentos, defesa,
regulação, etc.
Enzimas alostéricas apresentam estrutura quartenária no geral.

Os efetuadores alostéricos se ligam em região fora do sítio ativo (sítio alostérico). Mudanças conformacionais facilitam
(efetuador positivo) ou dificultam (efetuador negativo) a catálise.

Ao se desligar o efetuador alostérico

negativo a proteína fica mais ativa. É
comum o efetuador ser um produto
final de uma via metabólica, portanto,
regulando por retroalimentação
negativa a via.

Eventualmente, uma mesma enzima

pode ter tanto efetuadores positivos
como negativos.
Enzimas alostéricas apresentam estrutura quartenária no geral.

Os efetuadores alostéricos se ligam em região fora do sítio ativo (sítio alostérico). Mudanças conformacionais facilitam
(efetuador positivo) ou dificultam (efetuador negativo) a catálise.
Substância F: retroalimentação negativa (efetuador
alostérico negativo) na reação catalisada por B na via 1

Substância F: retroalimentação positiva (efetuador

alostérico positivo) na reação catalisada por A na via 2.
Quinase (ou cinase) é uma enzima que
adiciona um fosfato a uma outra proteína.
Fosfatase é uma enzima que remove um
grupo fosfato de uma outra proteína.

Um grupo fosfato adicionado pode ativar

a enzima “A”, ou inativar a enzima “B”. Ou
seja, varia para cada enzima.
No metabolismo
• No metabolismo a maioria das enzimas funciona nos dois
sentidos.

• Neste caso, existem ambos substratos e produtos na célula

✿ Enzimas no sangue
※ Níveis elevados. Exercem papel funcional no
plasma. Ex.: Trombina, lipase lipoproteica.

※ Níveis baixos. Não exercem papel

funcional no plasma. Ex.: Lactato
desidrogenase.

Enzimologia clínica
✿ Enzimologia clínica

Normal: baixos níveis

Lesão: níveis elevados

Fonte: Gaw, A. et al. Bioquímica Clínica. 5 ed. Rio de Janeiro : Elsevier, 2015.
✿ Interpretação dos resultados

※ Método Analítico

• Sensibilidade: quantidade mínima de um composto ou substância que o

método consegue detectar.

• Especificidade: representa o quanto do método é bom para distinguir o

composto analisado dos potenciais interferentes.

Fonte: Gaw, A. et al. Bioquímica Clínica. 5 ed. Rio de Janeiro : Elsevier, 2015.
✿ Interpretação dos resultados
※ Exame do paciente
• Sensibilidade: medida de incidência de resultados positivos de exames em pessoas
reconhecidamente com a doença. Alta sensibilidade = poucos falso negativos.

• Especificidade: medida de incidência de resultados negativos de exames em pessoas

reconhecidamente sem a doença. Alta especificidade = poucos falso positivos.

Fonte: Gaw, A. et al. Bioquímica Clínica. 5 ed. Rio de Janeiro : Elsevier, 2015.
✿ Interpretação dos resultados
※ Exame do paciente
• Sensibilidade: medida de incidência de resultados positivos de exames em pessoas
reconhecidamente com a doença. Alta sensibilidade = poucos falso negativos.

• Especificidade: medida de incidência de resultados negativos de exames em pessoas

reconhecidamente sem a doença. Alta especificidade = poucos falso positivos.

Fonte: Gaw, A. et al. Bioquímica Clínica. 5 ed. Rio de Janeiro : Elsevier, 2015.
 ✿ Enzimologia clínica
• Diagnóstico / diagnóstico diferencial
• Resposta à drogas
※ Vantagens • Prognóstico
• Detecção adiantada da doença
• Estimativa do curso de tempo

• Proporção das
enzimas
• Falta de especificidade tecidual liberadas
• Isoformas
※ Desvantagens
• Tempo de aumento após lesão
• Tempo de depuração
Principais enzimas de valor diagnóstico
Nome EC Sigla
Amilase 3.2.1.1 Amy
Aldolase 4.1.2.13 ALD
Alanina aminitransferase ALT
2.6.1.2
Transaminase glutâmico-pirúvica TGP
Aspartato aminotransferase AST
2.6.1.1
Transaminase glutâmico-oxalacética TGO
Colinesterase 3.1.1.8 ChE
Creatina quinase CK
2.7.3.2
Creatinafosfoquinase CPK
Lactato desidrogenase LDH
1.1.1.27
Desidrogenase láctica LD
Fosfatase ácida 3.1.3.2 ACP
Fosfatase alcalina 3.1.3.1 ALP
γ-Glutamiltransferase GGT
2.3.2.2
γ-Glutamil transpeptidase GGTP
5’Nucleotidase 3.1.3.5 5-NT, NTP
Lipase 3.1.1.3 Lip
Marcadores de lesão hepática

• Alanina aminotransferase (ALT)

• Aspartato aminotransferase (AST)
※ Enzimáticos
• Fosfatase alcalina (ALP)
• γ-Glutamil transferase (GGT)

• Albumina
• γ-Globulinas
• α1-Antitripsina
※ Não enzimáticos • α-Fetoproteína
• Ceruloplasmina
• Transferrina
• Bilirrubina
Aminotransferases (AST e ALT)
Citosol – MM 98.000 Fígado
AST: Aspartato aminotransferase Mitosol – MM 90.400 (m-AST) Coração
Macro-AST (ligada a IgG) Músculo esquelético

AST
Aspartato + α-cetoglutarato Glutamato + Oxaloacetato

Basicamente citosol Fígado

ALT: Alanina aminotransferase

ALT
Alanina + α-cetoglutarato Glutamato + Piruvato
✿ Localização das enzimas hepáticas

MCPHERSON, R. A.; PINCUS, M. R. Diagnósticos clínicos e tratamento por métodos laboratoriais de Henry. 21 ed. São Paulo: Manole, 2012.
Aminotransferases (AST e ALT)
※ Desordens hepáticas Hepatite

 ALT é mais sensível nas

doenças agudas e obstrutivas

 AST é mais sensível nas

doenças crônicas e infiltrativas

✓ Hepatite

ALT AST AST/ALT < 1

A relação AST/ALT reflete o grau de lesão hepática

✿ Marcadores de lesão cardíaca

• Creatina quinase total (CK)

• Creatina quinase fração MB (CK-MB)
※ Enzimáticos
• Aspartato aminotransferase (AST)
• Lactato desidrogenase (LDH)

• Troponina T e I
※ Não enzimáticos
• Mioglobina
✿ Creatina quinase (CK)
CK
Creatina + ATP Creatina-Fosfato + ADP
✿ Creatina quinase (CK) CK-MM CK-MB CK-BB

• Localização celular: citosol

• Dímero (subunidades B e M)

CK-MM CK-MB CK-BB

Músculo Coração Cérebro

Tsung, 1976.
✿ Creatina quinase (CK)
※ Fisiológico: exercício físico
※ Patológico: IAM

24h

• Infarto do Miocárdio (> 5% CK-total)

• Trauma Muscular (< 5% CK-total)
✿ Aspartato aminotransferase (AST) no infarto
Fígado
Coração
※ Distribuição tecidual Músculo esquelético
Rins
Pâncreas

Hepatite Infarto do miocárdio

✿ Infarto do miocárdio
✿ Infarto do miocárdio: marcadores não enzimáticos
✿ Marcadores de lesão pancreática
※ Amilase: hidrólise de ligações glicosídicas α(1-4)

※ Lipase: hidrólise de triacilgliceróis

Explicar a importância de se usar a razão de atividade enzimática AST/ALT na hepatite e infarto do
miocárdio.