Provas antigas

sábado, 18 de novembro de 2023 10:40

PROVA 2 DE ENGENHARIA ENZIMÁTICA – 2017

Quais são os principais métodos de imobilização de enzimas? Explique o método da ligação
covalente. Em qual (is) modelo (s) de biorreator (es) poderia ser empregado?
Analisar os gráficos e fazer comentários sobre a enzima. (o título do artigo é esse: New insights
into the effectiveness of alpha-amylase enzyme presentation on the Bacillus subtilis spore surface
by adsorption and covalent immobilization, e tem as explicações nele : ) )

Sobre os fenômenos de partição, explicar o que acontece com o pH e Km.

Cálculo da eficiência da imobilização, igual o feito no relatório!
Questão parecida com a 6 da lista. Dava a concentração inicial que era 15 micromol, o km era 2
micromol, a taxa de conversão era 99%, o diâmetro era 2mm, a vmáx era 1.5x10^-2 e o Dac 7x10
^-10, o F era 18m^3 queria saber o volume.

1. Métodos de imobilização de enzima

Existem várias maneiras distintas de imibilizarmos enzimas, a escolha do método deve ser feita pensando na enzima de interesse, o
processo em que será aplicada, e também o custo versus produtividade da mesma. Sendo assim, os métodos estudados em aula foram os
seguintes:

Resposta do GTP --> Ler slides e verificar

a) As fitases desempenham um papel crucial na indústria, especialmente na área de

alimentos e rações. Sua principal aplicação é a hidrólise do ácido fítico, um antinutriente
presente em grãos e sementes, liberando fosfato inorgânico e melhorando a
disponibilidade de minerais. Isso é particularmente relevante na formulação de rações
para animais, onde a suplementação de fósforo é essencial. Além disso, as fitases são
empregadas na indústria de alimentos para aumentar a biodisponibilidade de minerais
Falando especificamente sobre cada um deles: em produtos como pães, cereais e produtos derivados de soja.
b) As enzimas do grupo das proteases catalisam reações de hidrólise de ligações
2. Envolvimento ou Encapsulação peptídicas em proteínas. As principais reações envolvem a quebra de ligações entre
a. Princípio: diferença de tamanho entre molécula do catalizador e soluto; aminoácidos, resultando na fragmentação de proteínas em peptídeos menores. Essa
b. Enzima com mobilidade mantida: sem ligações físicas ou químicas; ação catalítica é fundamental em processos biológicos e industriais, como na produção
c. Usada em substratos de BAIXA MASSA MOLECULAR; de alimentos, detergentes e na indústria farmacêutica.
d. Gel: retenção da enzima na cápsula; c) As enzimas do grupo das proteases têm diversas aplicações industriais, sendo
e. Problemas: amplamente utilizadas na indústria alimentícia para melhorar a textura, sabor e
estabilidade de alimentos processados. Além disso, são empregadas na produção de
i. Perda da enzima pelos poros do gel;
detergentes para remoção de manchas proteicas e na indústria farmacêutica para a
ii. Difícil acesso ao substrato; síntese de medicamentos. Em processos biotecnológicos, as proteases são utilizadas
iii. Perda de atividade devido à formação de radicais livres na polimerização para a produção de peptídeos e aminoácidos de alto valor.
f. Como é feita? d) As amilases são enzimas que desempenham um papel essencial na degradação de
amido em açúcares simples, como maltose e glicose. Encontradas em diversos
organismos, desde bactérias até humanos, as amilases desempenham um papel
fundamental na digestão de carboidratos. Na indústria, as amilases são amplamente
utilizadas em processos como a produção de xaropes de glicose, fabricação de cerveja,
panificação e na indústria têxtil para a remoção de gomas e impurezas em fibras
naturais. Sua versatilidade torna as amilases uma classe importante de enzimas em
várias aplicações industriais.

3. Confinamento
a. Utilização de Fibras
i. Dissolução de um polímero em solvente orgânico imiscível em água;
ii. Emulsificação em solvente orgânico com solução aquosa e a enzima;
iii. Polímero com microgotas contendo a enzima.
4. Imobilização dentro de um suporte
a. Microcápsulas
i. Membranas poliméricas semipermeáveis;
ii. Substrato de baixo massa molecular;
iii. Talvez inative durante a imobilização;
iv. Possíveis inibidores de produtos e substrato no interior da matriz.

Página 1 de P2
 iv. Possíveis inibidores de produtos e substrato no interior da matriz.
v. Exemplo: lipossomos, pois contém um centro aquoso e uma parte lipídica - enzima é protegida de inibidores

1. Adsorção
a. Mais antiga e mais simples
b. Princípio: Forças de Van der Waals;
c. Vantagens: baixo custo, simplicidade, regeneração da enzima in situ, grande aplicabilidade;
d. Desvantagens: desnaturação da enzima, influência dos fatores ambientais;
e. Adsorventes: carvão ativo, argila, colágeno, vidro, terra diatomácea, hidroxiapatita.
2. Ligação iônica
a. Princípio: atração da enzima a íons do suporte;
b. Possível a liberação da enzima, mas pouca mudança conformacional;
c. Material: resinas iônicas e catiônicas;
3. Ligação metálica ou quelação
a. Princípio: Ativação do suporte com metais de transição;
b. Baixa estabilidade para substrato de alto peso molecular;
c. Simples, mas a enzima pode liberar por causa das iterações fracas;
4. Ligação covalente
a. Vantagem: pesquisada e difundida; escolha de condições de imobilização é mais difícil; ligação forte --> enzima bem estável;
ativação do grupo ligante no suporte;
b. Desvantagem: modificações da enzima; longa preparação; reações complexas; alto investimento; purificação prévia.
5. Reticulação
a. Princípio: agente reticulante e formação de cristais insolúveis com alta estabilidade;
b. Enzimas livres de suportes
c. Diferentes estratégias: cristalização, agregação, secagem por atomização, reticulação direta
6. Multipontual
a. Princípio: várias ligações covalentes entre enzima e suporte;
b. Enzima resistente a mudanças conformacionais;
c. Suportes porosos.

2. Quais os biorreatores que poderiam ser utilizados para imobilização de enzimas?

Para a escolha de biorreatores precisamos considerar alguns pontos, como:

--> Enzima a ser usada; Natureza do substrato; pH e Temperatura; cinética; Superfície catalítica por volume do reator; Transferência de
massa; Facilidade de substituição do catalisador e sua regeneração; Construção do biorreator e custo.

Sendo assim, temos três frentes de escolha:

Ressalto ainda que o modelo mais usado continua sendo o CSTR.

3. Analisar os gráficos e fazer comentários sobre a enzima. (o título do artigo é esse: New insights into the effectiveness of alpha-amylase
enzyme presentation on the Bacillus subtilis spore surface by adsorption and covalent immobilization, e tem as explicações nele : ) )

Página 2 de P2
Primeiro, vamos observar a enzima livre - cor amarela, representada pelo triângulo.

Conforme destacado no gráfico, é fácil observar que a Temperatura para a qual a enzima atinge atividade máxima é de de 60°C ( Atividade de
aproximadamente 500 Umg). Em questão do pH, a atividade máxima foi atingida (800 Umg) em pH 6 - apesar de ser apresentar um pico em pH
5, não seria tão interessante assim trabalhar nesse pH, pois qualquer mudança ínfima de pH alteraria, e muito, a atividade da enzima. Em Ph 6 o
processo seria melhor controlado.

Entretanto, observa-se perfis diferentes na enzima imobilizada - inclusive perfis diferentes dependendo da maneira com a qual a enzima foi
imobilizada. Sendo assim as observações que podem ser feitas são:

• O efeito da temperatura (variando de 30 a 90 °C) na atividade relativa das enzimas livres e imobilizadas foi determinado em pH 6 para as
enzimas livres e pH 8 para as enzimas imobilizadas;
• Comparando os perfis de temperatura e pH, a imobilização por ligação covalente se destaca;
• Os resultados mostraram que as enzimas imobilizadas por ligação covalente foram mais estáveis em temperaturas mais elevadas;
• A temperatura ótima de reação passou de 60 °C para a enzima livre para 80 °C para a enzima imobilizada, sugerindo uma estabilidade
térmica marginalmente melhor da enzima imobilizada - Isso pode ser resultado de mudanças nas propriedades físicas e químicas da
enzima imobilizada;
• A formação de múltiplas ligações covalentes entre a enzima e o suporte mostrou-se redutora da flexibilidade conformacional e das
vibrações térmicas, prevenindo, em última instância, o desdobramento e desnaturação da molécula proteica. Esses resultados
demonstram o papel positivo dos suportes na proteção da atividade da alfa-amilase em temperaturas mais elevadas.

4. Sobre os fenômenos de partição, explicar o que acontece com o pH e Km.

Se tratando de enzimas imobilizadas, as moléculas de enzima não são idênticas. Algumas podem sofrer distorções na sua estrutura
tridimensional provocadas pelas ligações covalentes com o suporte. O sítio catalítico pode estar menos ou mais acessível a depender da
orientação relativa na qual a enzima se ligou ao suporte. Esse fenômeno será mais ou menos importante a depender do tamanho do
substrato.

Além disso, podem ocorrer gradientes de concentração, pH e temperatura, que chamamos de FENÔMENOS DE PARTIÇÃO - e possuem
grande importância ao determinarmos a imobilização de enzimas.

O fenômeno de partição das enzimas ocorre quando o suporte utilizado apresenta carga. Isso provoca diferenças
de concentração entre as espécies carregadas tanto no microambiente quanto no macroambiente. O coeficiente de
partição (K) é definido como a razão entre a concentração no microambiente e a concentração no macroambiente,
expresso por K = [A] microambiente / [A] macroambiente.

O deslocamento do perfil atividade-pH da enzima imobilizada é caracterizado pelo coeficiente de partição KA, onde
KA = Am/AM. Aqui, Am representa a concentração da molécula A no nível do suporte (microambiente da enzima) e
AM representa a concentração da molécula A na massa da solução (macroambiente).

Para um suporte carregado com cargas negativas, a partição de prótons é expressa por KH+ = Hm+/HM+, onde
Hm+ é a concentração de prótons no microambiente e HM+ é a concentração de prótons no macroambiente. A
partição de prótons resulta em um gradiente de pH entre o suporte e a massa da solução.

Assim, quando Hm+ > HM+, temos pHm < pHM. Isso implica que a mesma enzima imobilizada apresenta um pH
ótimo mais baixo do que sob a forma livre. O valor ótimo de pH será atingido no microambiente da enzima, para um
valor mais elevado no macroambiente. Esse fenômeno destaca a influência da partição na atividade da enzima
imobilizada e ressalta a importância das condições locais para otimizar seu desempenho em diferentes ambientes.

5. Cálculo da eficiência da imobilização, igual o feito no relatório!

Sobre o método:
A imobilização no interior de membranas ou micro cápsulas há a retenção da enzima no interior de uma matriz polimérica insolúvel ao
meio reacional. Assim, devido ao processo de confinamento, a enzima permanece dentro da estrutura polimérica tridimensional sem que
haja sua difusão para fora do polímero. O tamanho dos poros da matriz deve ser tal que permita a passagem dos substratos e dos
produtos resultantes da reação, mas não da enzima. Um inconveniente que pode ser encontrado neste método é a perda da atividade
devido à formação de radicais livres durante o processo de imobilização. Outros problemas freqüentes são a alteração das propriedades
da enzima e as limitações difusionais. O procedimento da imobilização consiste na mistura do biocatalizador com o material precursor da
matriz ou gel hidrofílico, na qual ocorre subsequente geleificação. Polímeros naturais, agar, carragena, alginato e pectina são alguns dos
materiais que podem ser utilizados neste método.

Cálculo:

1. Dados base para o cálculo:

Branco do espectro:
Branco da enzima:
T = 10 min

Nos valores de absorbância, diminuir o branco do espectro e o branco da enzima.

--> Nesses cálculos aqui, vou assumir que na tabela já está o valor correto

2. Calculamos a atividade da enzima

a. Calcular a curva padrão de maltose Y = 34,254 X + 0,0066, onde Y é a concentração de maltose (μmol/mL) e X é a absorbância para
calcular a concentração de maltose nos ensaios.

Ensaio 1
Enzima livre: Y = 34,254*0,102 + 0,0066, Y = 3,504588 μmol/mL
Enzima imobilizada: Y = 34,254*0,078 + 0,0066, Y = 2,681532 μmol/mL

Página 3 de P2
 Enzima imobilizada: Y = 34,254*0,078 + 0,0066, Y = 2,681532 μmol/mL

Ensaio 2
Enzima livre: Y = 34,254*0,094 + 0,0066, Y = 3,230236 μmol/mL
Enzima imobilizada: Y = 34,254*0,089 + 0,0066, Y = 2,270004 μmol/mL

b. Agora, assumindo que o Fator de diluição

FD = 1000 (A enzima foi diluída em 1/1000)

c. Por fim, calculamos a atividade da enzima nos 4 ensaios. Ensaio 1

Enzima livre: Atividade = (3,50*1000*2)/10 = 700,9176 U/mL
Enzima imobilizada: Atividade = (2,68*1000*2)/10 = 536,3064 U/mL

Ensaio 2
Enzima livre: Atividade = (3,23*1000*2)/10 = 646 646,0472 U/mL
Enzima imobilizada: Atividade = (2,270004*1000*2)/10 = 454,0008 U/mL

d. Por fim, calculamos a eficiência da enzima

Ensaio 1
Eficiência E = 100*(536,3064/700,9176) = 76,5149%

Ensaio
Eficiência E = 100*(454,0008/646,0472) = 70,2736

Média --> (76,5149 + 70,2736)/2 = 73,3943%

3. Questão parecida com a 6 da lista. Dava a concentração inicial que era 15 micromol, o km era 2 micromol, a taxa de conversão era 99%, o
diâmetro era 2mm, a vmáx era 1.5x10^-2 e o Dac 7x10^-10, o F era 18m^3 queria saber o volume.
---> Nem tem 6 na lista

Página 4 de P2
Página 5 de P2