Enzimas Cap 06 - Sa Pereira P

6 IMOBILIZAÇÃO DE ENZIMAS E
SUA ESTABILIZAÇÃO
Heizir Ferreira de Castro, Gisella Maria Zanin,
Flávio Faria de Moraes, Paula Sá-Pereira
SUMÁRIO
As vantagens das enzimas imobilizadas, em relação às solúveis, surgem de sua maior esta-
bilidade e facilidade de separação do meio de reação, o que acarreta economia significati-
va no custo global do processo, desde que o procedimento de imobilização não seja mui-
to dispendioso, haja boa recuperação da atividade enzimática e que a meia-vida operacio-
nal da enzima imobilizada seja suficientemente longa. Os métodos de imobilização vari-
am da simples ligação por adsorção física em suportes diversos até a encapsulação em ma-
trizes de sol-gel e granulação. Durante o uso das enzimas imobilizadas, efeitos de transfe-
rência de massa podem ocasionar gradientes adversos de substratos ou de pH, que po-
dem reduzir a velocidade de reação e o rendimento em produto. Impurezas presentes no
meio podem ocluir a enzima imobilizada e também reduzir a velocidade de reação e o
rendimento em produto. A perda de atividade biocatalítica durante o processo de imobi-
lização deve ser reduzida para compensar o custo extra da imobilização, o suporte poroso
deve ser apropriado para facilitar a transferência de reagentes e produtos, e a purificação
exaustiva da solução de substrato deve ocorrer para obter-se uma longa vida operacional.
Este capítulo conceitua inicialmente os diversos termos relacionados com a técnica
de imobilização, fornece uma classificação dos métodos e destaca ainda as vantagens e li-
mitações do uso de enzimas. Na seqüência, apresenta os métodos de imobilização de en-
zimas, correlacionando-os com os tipos de suportes mais comumente utilizados. Aborda a
interação enzima-suporte com base nos fatores que interferem no comportamento da en-
zima imobilizada;. discute a aplicação de enzimas imobilizadas em meio orgânico, bem
como, a influência de aditivos como agentes estabilizantes da atividade catalítica da enzi-
ma imobilizada, e, finalmente, enfoca o tema das aplicações das enzimas imobilizadas.
123
1ª prova
124 ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUÇÃO, APLICAÇÕES E MERCADO
IMOBILIZAÇÃO DE ENZIMAS – UMA PERSPECTIVA HISTÓRICA

A imobilização de enzimas começou a ser estudada no início do século passado, ao se
observar que o carvão ativo, ao qual havia sido adicionada uma preparação biológica
com atividade invertásica, mantinha a capacidade de hidrolisar sacarose mesmo após
ser lavado (NELSON e GRIFFIN, 1916). Após esta observação inicial da imobilização de
enzimas em suportes insolúveis, o assunto só foi novamente retomado após a Segunda
Guerra Mundial. Em 1948, o bioquímico americano James Batcheller Sumner
(1887-1955), ganhador do Prêmio Nobel de Química, em 1946, pelo isolamento e cris-
talização da enzima urease e pela identificação da sua natureza protéica, reportou sua
imobilização. Na continuação dos estudos, pesquisadores alemães, em 1954, demons-
traram que polímeros sintéticos, resinas diazotadas de poliaminoestireno, poderiam
ser usados para imobilizar proteínas com atividade biológica. Eles usaram as enzimas
pepsina, diastase, ribonuclease e carboxipeptidase (CHIBATA, 1978).
Outros trabalhos subseqüentes incluíram a imobilização da catalase por ligação iô-
nica em DEAE-celulose, da tripsina, da papaína, da amilase e da ribonuclease em gel de
poliacrilamida, e a demonstração do método de ligações cruzadas, utilizando-se carbo-
xipeptidase com glutaraldeído. A microencapsulação da carbono-anidrase foi descrita
em 1964 e a preparação de lipossomas contendo glicoamilase em 1971, sendo que estas
duas últimas preparações foram usadas com fins terapêuticos. A partir de 1960, houve
um aumento significativo no número de publicações sobre imobilização de enzimas,
tendo em vista as potenciais vantagens econômicas e operacionais que a técnica oferece
para a tecnologia enzimática. Estes esforços resultaram no desenvolvimento, em 1969,
por Chibata e colaboradores da companhia japonesa Tanabe Seiyaku Co., de um pro-
cesso para a produção de L-aminoácidos, a partir de misturas racêmicas, usando L-ami-
noacilase imobilizada em DEAE-Sephadex. Quase simultaneamente foi colocado em
operação, nos EUA, o processo de produção de xaropes de frutose a partir de amido de
milho, utilizando glicose-isomerase imobilizada (CHIBATA, 1978).
Até os meados da década de 1960, a maior parte dos trabalhos com enzimas imobi-
lizadas era realizada por pesquisadores de áreas básicas, que perceberam que estes siste-
mas poderiam ser utilizados como catalisadores industriais altamente específicos e efici-
entes. Neste período, passou-se também a buscar suportes com boa resistência química
e mecânica, de modo a prolongar o uso do biocatalisador. Foram estudados métodos
diferentes de imobilização (combinação de métodos), e observou-se que as proprieda-
des catalíticas de uma mesma enzima poderiam ser alteradas em função do método de
imobilização utilizado e do suporte empregado. E finalmente, tiveram início os estudos
da aplicação de enzimas imobilizadas em biorreatores contínuos (leito fixo e reatores
agitados). Isto marca o inicio da contribuição dos engenheiros químicos para o projeto
de biorreatores (VIETH, 1994).
A importância de processos industriais com enzimas imobilizadas motivou a orga-
nização, em 1971, da primeira Conferência em Engenharia Enzimática, realizada em
Henniker. Nela estabeleceu-se o uso do termo enzima imobilizada, empregado por Kat-
chalski–Katzir, para os biocatalisadores ligados a suportes insolúveis ou confinados a es-
1ª prova
CAPÍTULO 6 ¡ IMOBILIZAÇÃO DE ENZIMAS E SUA ESTABILIZAÇÃO 125
paços físicos definidos, em contraposição ao uso de enzimas “fixadas” ou “insolubiliza-

das” ou “ligadas em matrizes”. Em 1985, houve um outro avanço significativo com o de-
senvolvimento em escala industrial de um processo em reator de membrana para a pro-
dução de aminoácidos a partir de cetoácidos, com duas enzimas imobilizadas e envol-
vendo a regeneração do co-fator. O processo, que foi desenvolvido por pesquisadores
da Wandrey e Kula, na Alemanha, foi empregado em escala industrial naquele país pela
companhia Degussa (HARTMEIER, 1988).
O advento das enzimas imobilizadas abriu novos e promissores campos de atuação.
Como exemplos, os eletrodos enzimáticos que proporcionam um número muito maior
de análises em curtos espaços de tempo, característica esta muito valiosa para a moder-
na industria biotecnológica, e a reutilização da enzima por tempos prolongados de
processo, implicando numa grande redução de custos.
ENZIMAS IMOBILIZADAS
As enzimas têm, intrinsecamente, excelentes propriedades como a atividade, a seletivi-
dade e a especificidade. Estas características permitem o desenho de processos de sínte-
se de produtos muito complexos em condições ecossustentadas. Mas apesar do elevado
potencial de aplicação das enzimas, devido à pressão dos consumidores, elas têm de ser
otimizadas, de modo a cumprirem suas funções biológicas com eficácia e eficiência. A
catálise de reações em processos metabólicos complexos pode ser regulada em vários
níveis. E assim, algumas delas passam a ter as características adequadas para serem
integradas em processos industriais.
Enzimas na sua forma nativa (enzimas livres) têm sido usadas por séculos na indús-
tria de alimentos e mais recentemente nas indústrias farmacêuticas e químicas. Sua es-
trutura e modo de ação vêm sendo gradativamente elucidados por métodos experi-
mentais bem estabelecidos, como as técnicas clássicas de raios X e avançadas de resso-
nância magnética nuclear (RMN). Modernas metodologias de engenharia genética
possibilitaram a produção de enzimas em grande escala ou a modificação de sua estru-
tura primária, alterando, portanto algumas de suas características físico-químicas e bio-
lógicas (MA et alii, 2003). De igual significância são as recentes técnicas de evolução di-
recionada, que permitem, via modificação do DNA, a preparação de enzimas especial-
mente dirigidas para uma determinada finalidade, isto é, enzimas que atuam em valores
extremos de pH e temperatura, bem como em presença de meios não convencionais
(solventes orgânicos, fase gasosa, CO2 supercrítico) (POWELL et alii, 2001).
O valor de venda de enzimas para o uso em indústrias de alimentos, detergentes e
especialidades químicas, que perfazia um total de aproximadamente US$ 700 milhões
em 1992 (KATCHALSKI-KATZIR e KRAEMER, 2000), aumentou para US$ 2 bilhões
em 2004 (RAJAN, 2004). De acordo com as projeções, o crescimento no mercado de en-
zimas é de aproximadamente 4-5% ao ano, acompanhado pela redução de preço, de-
corrente do grande número de empresas que comercializam enzimas com preços mais
competitivos (RAJAN, 2004).
1ª prova
De particular interesse é o aumento do uso de enzimas imobilizadas, fisicamente

confinadas ou localizadas numa certa região do espaço com retenção de sua atividade
catalítica, podendo ser usada repetidamente e continuamente (WINGARD JR., 1972).
Nesta técnica, a enzima fica retida no interior (poros) ou na superfície de um material
que é utilizado como suporte. O complexo enzima–suporte mantém as características
físicas do suporte e, ao mesmo tempo, retém a atividade biológica da enzima na forma
solúvel. O termo “enzima imobilizada” inclui:
1. A modificação das enzimas de forma a torná-las insolúveis em água.
2. A utilização de enzimas na forma solúvel em reatores equipados com membra-
nas de ultrafiltração, que permitem o escoamento dos produtos da reação, mas
retêm a enzima no interior do reator.
3. A restrição da mobilidade da enzima pela ligação a outra molécula, que torna o
sistema insolúvel no meio de reação (ZANIN e MORAES, 2004). O sistema imo-
bilizado permite a condução de reações em reatores contínuos, com fácil sepa-
ração de catalisador–produto, e o aumento da produtividade do processo
(massa de substrato/massa de biocatalisador).
Classificação das Enzimas Imobilizadas

Na literatura especializada encontram-se diversas formas de classificação dos biocatali-
sadores imobilizados, todos em concordância com a definição apresentada. Zaborski
(1973, 1976) propôs uma classificação que leva em consideração – o tipo de interação
responsável pela imobilização - , que pode ser conseguida por meios químicos (com for-
mação de, no mínimo, uma ligação covalente entre os resíduos terminais de uma enzi-
ma e um grupo funcional do suporte, ou entre duas ou mais moléculas de enzima) ou
por meios físicos, que não envolvem ligações químicas, porém somente forças físicas
(adsorção, interações eletrostáticas e outras) como também, a encapsulação ou micro-
encapsulação em matrizes poliméricas; – a natureza dos suportes – que podem ser poro-
sos ou não-porosos, orgânicos ou inorgânicos (VIETH, 1994; ZANIN e MORAES,
2004). Do ponto de vista prático, o método de classificação não altera o sistema obtido,
uma vez que as técnicas mais utilizadas para a preparação dos biocatalisadores de
aplicação comercial envolvem uma combinação de métodos básicos.
A classificação dos métodos de imobilização de enzimas, mais aceita na literatura,
foi proposta por Kennedy e Roig (1995), que considera a combinação da natureza da
interação responsável pela imobilização e o tipo de suporte utilizado. Assim:
a) Ligação em suportes – modificação da enzima, por meio de técnicas apropria-
das, para torná-las imóveis no meio de reação () e cross-linking- ligação cruzada
intermolecular ou reticulação.
b) Enzimas solúveis sem derivatização- enzimas solúveis, utilizadas em reatores
equipados com membranas semipermeáveis de ultrafiltração e fibras ocas que
retêm a enzima no interior do reator.
1ª prova
c) Enzimas solúveis com derivatização- enzimas cuja mobilidade foi restringida

pela ligação com outra macromolécula, porém permanecendo o complexo
solúvel em água.
Outra forma sugerida na literatura para classificar as enzimas imobilizadas leva em
consideração a necessidade da presença, ou não, de co-fatores para a melhor atuação
da enzima. De um modo geral, as enzimas que não requerem co-fatores, ou aquelas cu-
jos co-fatores estão ligados como um grupo prostético à apoenzima, são fáceis de imobi-
lizar. Por outro lado, o processo de imobilização torna-se complexo, se a coenzima deve
ser regenerada pela ação de uma segunda enzima, ou nos sistemas multienzimáticos
que requerem a dissociação da coenzima. Portanto, de acordo com a complexidade da
imobilização, pode-se ter os seguintes grupos:
I) Enzima sem co-fator.
II) Enzima com grupo prostético.
III) Enzima com dissociação de coenzima.
IV) Sistema multienzimático com dissociação de coenzima.
De maneira global, pode-se afirmar que os processos de imobilização desenvolvi-
dos e descritos na literatura, até aproximadamente 1980, são todos pertencentes aos
grupos (I) e (II), isto é, de primeira geração. A partir desse período, a ênfase maior tem
sido para os sistemas de segunda geração, ou seja, sistemas multienzimáticos com
coenzimas e regeneração de co-fatores (HARTMEIER, 1988).
Métodos de imobilização de enzimas

O objetivo deste tópico é apresentar, em linhas gerais, uma introdução às principais téc-
nicas disponíveis para a preparação de enzimas imobilizadas. Para mais detalhes, reco-
menda-se a consulta de literatura especializada.
Existem basicamente duas formas de reter uma enzima no interior dos biorreato-
res: a imobilização de enzima no interior de um suporte (encapsulação e retenção por
meio de membranas); e, a imobilização na superfície de um suporte (ligação covalente
e não-covalente). Estes métodos são bem revisados e discutidos na literatura
(MESSING, 1975; MOSBACH, 1976; TREVAN, 1980; ROSEVEAR et alii, 1987;
HARTMEIER, 1988; GEMEINER, 1992; ZANIN e MORAES, 2004). Para os vários méto-
dos disponíveis no que respeita à estabilização de enzimas imobilizadas, duas vertentes
têm de ser consideradas, a estabilidade no armazenamento e a estabilidade operacio-
nal. A estabilidade no armazenamento, ou tempo de meia-vida, refere-se à capacidade
de uma enzima manter a sua capacidade catalítica durante o período entre a produção
e o seu uso. A estabilidade operacional descreve a manutenção da atividade catalítica da
enzima durante a reação. A estabilidade operacional pode ser ainda avaliada na ausên-
cia ou presença do substrato (LEMOS et alii, 2001; SÁ-PEREIRA et alii, 2003, 2004;
CHANIOTAKIS, 2004).
1ª prova
Suportes para a imobilização de enzimas

As propriedades das preparações de enzimas imobilizadas são influenciadas pelas pro-
priedades da enzima e do material do suporte (TISCHER e KASCHE, 1999). A intera-
ção entre esses dois componentes proporciona um derivado imobilizado com proprie-
dades químicas, bioquímicas, mecânicas e cinéticas específicas (figura 6.1).
Enzima Suporte
Propriedades Propriedades
Bioquímicas Bioquímicas
Tipo de reação Propriedades

e Cinética Mecânicas
Métodos Efeitos de Estabilidade

de imobilização trasferência operacional
de massa
Desempenho
Consumo de enzima (U/kg de produto)
Produtividade (kg produto/U)
Figura 6.1 Interação entre suporte e enzima.
Dentre os vários parâmetros que devem ser considerados os mais importantes são
apresentados na tabela 6.1, os quais incluem pH, temperatura, força iônica, pressão,
agitação, liberação de co-fatores e do substrato com a remoção dos produtos. Estes fato-
res influem no desempenho do suporte, na conformação da enzima, na velocidade de
transferência de massa e de reação intrínseca, e, portanto, afetam o comportamento da
enzima imobilizada.
1ª prova
Tabela 6.1 Fatores que influenciam o desempenho de um sistema de enzima imobilizada
Enzima Propriedades Bioquímicas: Massa molecular, grupos funcionais da

superfície protéica, pureza (funções de inativação ou proteção das
impurezas)
Parâmetros Cinéticos: Atividade específica, perfil de pH e temperatura,
parâmetros cinéticos para a ativação e inibição, estabilidade térmica, pH,
solventes, contaminantes e impurezas
Suporte Características Químicas: Composição e base química, grupos

funcionais, estabilidade química, contribuições da superfície do suporte,
tais como: os micro-efeitos (pH, carga da superfície, natureza hidrofóbica e
hidrofílica, efeito redutor e a presença de íons metálicos)
Características Mecânicas: Diâmetro do poro, comportamento de
compressão, tamanho da partícula; área superficial; volume acessível da
matriz, resistência à compactação em operações em altas vazões para
reatores de leito fixo; abrasão para reatores agitados e velocidade de
sedimentação para leitos fluidizados.
Características Morfológicas: Suportes não-porosos (baixa área
superficial), porosos (grande área superficial), estrutura de gel
Enzima Imobilizada Método de Imobilização: Fixação de proteína, eficiência da enzima ativa,

parâmetros cinéticos intrínsecos
Efeitos de transferência de massa: Partição (diferente concentração do
soluto dentro e fora das partículas do catalisador), difusão interna (poros) e
externa
Estabilidade: operacional (expressa em tempo de meia-vida sob
condições operacionais), estabilidade de estocagem
Desempenho: Produtividade (produto formado por unidade de atividade
ou massa de enzima), consumo de enzima (e.g. unidades por kg de
produto)
Fonte: Tischer e Kasche (1999).
De todos os fatores anteriormente citados, com exceção da enzima, a maior contri-

buição para o bom desempenho da enzima imobilizada é dada pelo suporte. Se, de um
lado um suporte criteriosamente selecionado pode aumentar o tempo de meia-vida da
enzima imobilizada, de outro uma escolha errada pode afetar adversamente não só o
tempo de meia-vida, mas o desempenho global do sistema. Na seleção de um suporte
para uma determinada aplicação, devem ser analisadas suas propriedades físicas e quí-
micas, bem como as relativas à possibilidade de regeneração do material.
¡ Características morfológicas: para possibilitar a imobilização de quantidades signifi-
cativas de enzima, o suporte deve possuir uma área superficial superior a 10 m2.g-1, o
que equivale a se ter alta porosidade e poros de pequeno diâmetro. Naturalmente, o
diâmetro dos poros deve permitir o fácil acesso da enzima e do substrato.
1ª prova
¡ Características químicas: os suportes devem possuir grupos químicos que po-

dem ser ativados ou modificados de modo a permitir a ligação da enzima em con-
dições que não a desnaturem.
¡ Natureza hidrofílica: nos critérios de seleção do suporte de imobilização, deve
ser levada em conta a sua afinidade pela água, porque a água do meio se particio-
na entre a matriz de imobilização, a enzima e o meio de reação, afetando o seu
microambiente. São desejáveis suportes com características hidrofílicas de modo
a se obter uma boa difusividade do substrato, além de permitir a estabilização da
enzima. Suportes hidrofóbicos diminuem a estabilidade e a atividade da enzima
imobilizada por um mecanismo semelhante à desnaturação das enzimas em sol-
ventes orgânicos.
¡ Insolubilidade: esta característica é essencial, não somente para prevenir a libe-
ração da enzima do suporte, mas principalmente para evitar a contaminação do
produto, pelo suporte dissolvido e pela enzima. Em alguns casos, principalmen-
te quando o produto desejado é um alimento ou um fármaco, há a necessidade
de estabilização da superfície do suporte, de modo a se evitar a liberação de íons
tóxicos ou a formação de particulados finos. Estas situações são encontradas
quando se utilizam pós de metais magnéticos ou sílica de porosidade controlada.
Os pós liberam íons tóxicos e, portanto, devem ser recobertos com albumina. A
sílica de porosidade controlada, por sua vez, se dissolve lentamente com o uso
prolongado e o recobrimento da superfície com zircônia é recomendável de
modo a estabilizar a superfície antes da derivatização (MESSING, 1978).
¡ Estabilização química, mecânica e térmica: já existem várias estratégias de estabili-
zação enzimática, tais como a interação seletiva não covalente com polieletrólitos,
baseadas em cargas de superfície (entrapment): uso de sais, polieletrólitos ou es-
paços confinados, cujas características físicas e químicas podem ser controladas di-
retamente na reação de catálise. Este controle baseia-se em múltiplas interações iô-
nicas ou armadilhas físicas e na imobilização covalente de enzimas a outras proteí-
nas ou superfícies sólidas, através de formação de ligações covalentes (intra e in-
ter-enzimáticas), polimerização enzimática, ligação covalente com outras proteí-
nas, imobilização em superfícies sólidas, estabilização da nanoconcavidade enzi-
mática usando a mutagênese dirigida com alterações em locais específicos, au-
mento da lipofilia do centro activo e/ou remoção de grupos reativos.
O suporte deve ser quimicamente resistente nas condições de ativação, durante o
processo de imobilização e nas condições em que se processa a reação. A resistência me-
cânica deve permitir o uso de filtração, centrifugação e agitação, pois o processo de imo-
bilização e o uso repetido e contínuo, algumas vezes, requerem o emprego dessas ope-
rações. A estabilidade térmica é outra característica importante. Suportes com grande
coeficiente de expansão podem sofrer distorção ou destruir o sítio ativo da enzima sob
expansão ou contração, quando submetido a variações de temperatura. Estas situações
podem ocorrer quando se utiliza a imobilização em várias temperaturas, ou quando a
1ª prova
enzima imobilizada é levada da situação de estocagem (normalmente em baixas

temperaturas) diretamente às condições operacionais, ou vice versa.
¡ Estabilidade ao escoamento: partículas esféricas, rígidas e de tamanho unifor-
me, normalmente, são mais apropriadas para a utilização em reatores contínuos,
por produzirem pequenas variações de pressão e possuírem boas características
de escoamento do fluido intersticial. Uma estrutura rígida de poros (matriz rígi-
da) protege a enzima de situações de escoamento turbulento.
¡ Resistência ao ataque microbiológico: o suporte deve ser resistente à degrada-
ção por microrganismos, de modo a evitar a liberação da enzima para a solução.
¡ Regenerabilidade: as leis ambientais sobre a poluição e o esgotamento das reservas
naturais tornaram a regeneração e o reciclo necessidades prementes nos processos
em larga escala.Por isto, tanto a possibilidade de regeneração como a reutilização da
matriz devem ser consideradas na avaliação econômica do sistema com enzima imobi-
lizada.Quanto à composição química os suportes são classificados em orgânicos (natu-
rais e sintéticos) e inorgânicos (minerais e fabricados). Como exemplo de suportes or-
gânicos naturais podem ser citados os polissacarídeos (celulose, ágar, quitina, quitosa-
na, amido, entre outros) e as proteínas (colágeno, albumina, gelatina, glúten, seda,
entre outras). Dentre os sintéticos encontram-se o poliestireno, os poliacrilatos, os po-
livinílicos, o nailon, entre outros.Os suportes inorgânicos minerais mais utilizados são:
areia, bentonita, horneblenda e pedra-pomes. Dentre os fabricados pode-se citar: vi-
dro, cerâmica e sílica de porosidade controlada, aluminossilicatos, óxido de ferro, óxi-
do de níquel, aços inoxidáveis, entre outros. Os suportes mais amplamente estudados
e utilizados são os derivados de polissacarídeos, especialmente os extraídos de algas,
como: agarose, alginato e K-carragenina. A celulose e seus derivados têm boas propri-
edades para a imobilização de enzimas. Outro suporte que apresenta boas característi-
cas para a imobilização de enzimas é o carvão ativo, que pode ser obtido pela desidra-
tação e carbonização, seguida de ativação, de materiais como casca de coco, madeira,
carvão, coque, ossos animais e lignina (MESSING, 1978).
Um suporte que tem merecido a atenção dos pesquisadores é a sílica xerogel obti-
da pela técnica sol-gel, que envolve a hidrólise e condensação de Si(OR)2 em presença
de um trialcoxissilano (PIERRE, 2004; KANDIMALLA et alii, 2006). Na funcionalização
obtém-se um material do tipo xSiO2.SiO3/2 – (CH2)n-L, onde é possível controlar a den-
sidade do ligante (L) ancorado à superfície da sílica. Essa técnica tem sido utilizada,
principalmente, para a imobilização da enzima lipase por apresentar boa retenção de
atividade (REETZ et alii, 1996; SOARES et alii, 2004, 2005, 2006).
Os suportes inorgânicos são mais apropriados para uso industrial por apresentarem
elevada resistência mecânica, boa estabilidade térmica, resistência a solventes orgânicos e
ao ataque por microrganismos. Eles são de fácil regeneração por pirólise e apresentam
boa rigidez da matriz, sendo estáveis em uma ampla faixa de pressões, temperaturas e pH.
Entretanto, a maioria das enzimas imobilizadas comercializadas é obtida com matrizes or-
gânicas devido, provavelmente, à variedade de grupos funcionais reativos que podem ser
introduzidos nesses suportes.
1ª prova
Os processos de imobilização de mais de uma enzima em um mesmo suporte têm

se destacado porque constituem sistemas interessantes para o estudo e compreensão da
forma como ocorrem as reações nos seres vivos, onde as enzimas agem de forma se-
qüencial. Embora os suportes e as técnicas de imobilização sejam as mesmas emprega-
das nos processos com uma única enzima, são parâmetros importantes nos processos
multienzimáticos: a razão molar entre as enzimas e entre estas e o suporte, a resistência
difusional no reator e a conversão em produto final (VIETH, 1994).
Na seleção do suporte para a imobilização da enzima, os fatores de maior peso são
as suas propriedades físicas, químicas e mecânicas. Idealmente um suporte deve ser qui-
micamente inerte, ter grande área superficial (>10 m2/g), ter resistência mecânica ele-
vada e baixo custo de produção. Infelizmente, a combinação destas qualidades nem
sempre é possível e um compromisso deve ser encontrado. Do exposto, pode-se inferir
que não se conhece um suporte ideal e universal para a imobilização de enzimas, e este
talvez nunca seja encontrado, devido à diversidade dos sistemas enzimáticos. Isto signifi-
ca que é necessário avaliar criteriosamente todos os aspectos envolvidos e, então,
decidir qual é o suporte mais apropriado para a aplicação desejada.
Na otimização de um tipo de suporte para uma aplicação específica é importante
conhecer a natureza catalítica da enzima, e e o tipo de reator que será utilizado.
Imobilização no Interior de um Suporte

Este método está fundamentado na diferença de tamanho entre as moléculas do catali-
sador e do soluto, e aqui duas aproximações têm sido adotadas: a formação de uma es-
trutura porosa na presença da enzima, envolvendo-a em uma estrutura tridimensional,
ou a retenção do biocatalisador por uma membrana porosa. Em ambos os casos a enzi-
ma tem sua mobilidade mantida, pois não são envolvidas ligações físicas ou químicas en-
tre a enzima e o suporte. Conseqüentemente, somente substratos de baixo peso mole-
cular podem ser empregados com este tipo de enzima imobilizada. Este método inclui a
encapsulação em gel e em fibras e a microencapsulação, como mostrado na figura 6.2
(ROSEVEAR et alii, 1987).
O método de encapsulação em gel envolve a retenção da enzima no interior de
uma matriz polimérica insolúvel no meio de reação. A maior parte dos métodos base-
ia-se na mistura do biocatalisador com um fluido precursor do gel e subseqüente gelifi-
cação por polimerização ou precipitação, ficando a enzima distribuída no interior da
matriz. As matrizes preferidas são normalmente as do tipo hidrogel, que podem ser
obtidas nas mais variadas formas.
A preparação de enzimas imobilizadas no interior de fibras pode ser realizada pela
dissolução de um polímero, como o acetato de celulose, em um solvente orgânico imiscí-
vel em água seguida da emulfisicação da solução formada com a solução aquosa que con-
tém a enzima. Em seguida estruda-se a emulsão em um líquido coagulante (tolueno ou
éter de petróleo) que precipita o polímero na forma de filamentos. No interior do polí-
mero são retidas as microgotas contendo a enzima (FERNANDES e CABRAL, 2006).
1ª prova
Enzimas insolúveis Enzimas solúveis
Encapsulamento Ligação sem derivação com derivação
em gel em fibras microencapsulação ligação simples reticulação
adsorção ligação iônica quelação ligação covalente
Figura 6.2 Classificação dos métodos de imobilização.
As principais vantagens da encapsulação de enzimas incluem a grande área super-

ficial para contato entre o substrato e a enzima no interior de um volume relativamente
pequeno, e a possibilidade de imobilização simultânea de diferentes enzimas em uma
única etapa. Como principais desvantagens, têm-se:
a) A restrição de que os biocatalisadores somente podem ser utilizados com subs-

tratos de baixo peso molecular.
b) A possível inativação da enzima durante o procedimento de imobilização.
c) A alta concentração de enzima necessária para garantir a encapsulação.
d) Os possíveis efeitos de inibição por produtos ou substrato no interior da matriz
porosa. O laboratório de investigação japonês Toyota Center R&D Labs desen-
volveu uma nova estratégia de estabilização de enzimas, com aplicação na indús-
tria de automóveis, por imobilização em suportes com mesoporos, o FSM-16
(Folded Sheet Mesoporous Material), que apresenta resultados surpreendentes.
1ª prova
A atividade enzimática e a termoestabilidade em solventes orgânicos foi significa-

tivamente aumentada porque o poro do FSM-16 corresponde ao tamanho mole-
cular da enzima (LI e TAKAHASHI, 2000; TAKAHASHI e MIYZAKI, 2000).
Imobilização sobre um Suporte

A enzima pode ser permanentemente fixada na superfície de um suporte por meio de
interações como a adsorção física, a ligação iônica, as ligações covalentes e a ligação a
um metal (quelação), como mostrado na figura 6.2. O método de imobilização por ad-
sorção física é a técnica mais antiga de produção de enzimas imobilizadas, assim como, a
mais simples. Consiste em se colocar em contato a solução da enzima em água com o su-
porte (superfície adsorvente), em determinadas condições de pH, temperatura e agita-
ção. Após a imobilização o suporte é lavado para remoção das moléculas de enzima que
não foram adsorvidas (MESSING, 1978).
O princípio envolvido nesse tipo de método é a atração da enzima pela superfície do
suporte por meio das forças de Van der Waals, que são fracas, o que permite a desadsor-
ção da enzima durante a utilização. Para minimizar este problema é recomendável lavar a
enzima imobilizada com solução de substrato nas mesmas condições de pH e temperatu-
ra empregados no meio de reação. O processo de adsorção não é específico e algumas ve-
zes pode provocar a inativação parcial ou total da enzima. Neste caso, somente suportes
com alta afinidade pela enzima podem causar a menor desnaturação da enzima.
Os suportes mais utilizados são: alumina, carvão ativo, argila, colágeno, vidro, terra
diatomácea e hidroxiapatita (MESSING, 1978).
O método de imobilização por ligação iônica baseia-se na atração da enzima pelo
suporte sólido que contém íons residuais. A principal diferença entre a adsorção física e
a ligação iônica é a energia da ligação envolvida entre a enzima e o suporte, as intera-
ções íon–íon são mais fortes do que as forças de Van der Waals, porém mais fraca que a
ligação covalente (FERNANDES e CABRAL, 2006). A preparação do derivado imobili-
zado é feita da mesma forma que no processo de adsorção física, isto é, coloca-se em
contato a solução enzimática com o suporte. Também, neste caso, pode ocorrer a libe-
ração da enzima pelo suporte, o que contamina o produto final e reduz a atividade espe-
cífica do biocatalisador. Dado o caráter iônico da ligação e as condições amenas de imo-
bilização, ocorre pouca mudança conformacional na enzima, o que conduz à obtenção
de derivados imobilizados com altas atividades enzimáticas.
Enzimas imobilizadas ativas podem ser obtidas utilizando-se a técnica da ativação
da superfície do suporte com metais de transição (ligação com metais ou quelação), for-
mando ao final, um quelato entre a enzima e a superfície ativa do suporte. Os principais
sais de metais utilizados para o processo de ativação são: TiCl3, TiCl4, Ti2(SO4)3, FeCl3,
FeCl2, FeSO4, ZnCl4, SnCl2, SnCl4 e VCl3 (Zanin e Moraes, 2004). Esta técnica tem sido
utilizada para ativar tanto materiais orgânicos (papel de filtro, quitina, quitosana, ácido
algínico), e inorgânicos (Celite, vidro, sílica de porosidade controlada, horneblenda, lã
de vidro e alumina, entre outros). Embora a preparação de enzimas imobilizadas por
este método seja bastante simples, estando envolvidas somente duas etapas (ativação do
1ª prova
suporte e imobilização da enzima), a estabilidade operacional obtida, quando se traba-

lha com substratos de alta massa molecular, é baixa, devido aos metais envolvidos. Tam-
bém foram observados casos em que houve dessorção da enzima, que resulta da fraca
interação entre a enzima e o metal (suporte ativado). Por este motivo alguns autores
consideram este método como de quelação (ligação covalente parcial) e outros, como
de adsorção.Os métodos de adsorção, ligação iônica e ligação metálica são de fácil apli-
cação, entretanto eles não são muito utilizados em processos em grande escala, devido
às forças de ligação fracas, o que possibilita a perda da enzima do suporte. O método da
ligação covalente baseia-se na formação de uma ligação forte entre a enzima e o supor-
te. Este método de imobilização é o mais difundido e o mais estudado. A seleção das
condições de imobilização é mais difícil do que nos outros métodos. O método é,
freqüentemente, mais complexo e utiliza condições menos brandas do que os demais.
Como a ligação formada é forte, a enzima imobilizada obtida por este método é estável,
isto é, não se solta do suporte em presença do substrato ou de soluções de alta
concentração iônica.
A ativação do grupo ligante é freqüentemente realizada no suporte a fim de redu-
zir o risco de diminuição da atividade catalítica da enzima. As reações de ativação do su-
porte podem ser por: diazotização, formação de ligação amida, alquilação e arilação,
formação de base de Schiff, reação de Ugi, reações de amidinação, troca do dissulfe-
to-tiol, interações enzima-mercúrio e ligação induzida por radiação (KENNEDY e
WHITE, 1985; HARTMEIER, 1988; FERNANDES e CABRAL, 2006).
Os materiais inorgânicos mais comumente utilizados na imobilização de enzimas são:
cerâmica, vidro, sílica e metais. Muitos métodos de ligação covalente de enzimas em supor-
tes inorgânicos envolvem a utilização de derivados de silano contendo um grupo orgânico
funcional (método de silanização). Às vezes, os suportes silanizados podem reagir direta-
mente com as enzimas, mas na maior parte dos casos, estes grupos funcionais devem ser
modificados para produzir intermediários reativos. O reagente mais utilizado é o glutaral-
deído, devido à simplicidade do método e obtenção de preparações enzimáticas ativas e es-
táveis (WEETALL, 1975, 1976; ZANIN e MORAES, 2004; FERNANDES e CABRAL, 2006).
Para conseguir preparações com alta atividade, algumas vezes, são utilizadas técni-
cas que procuram evitara inativação dos resíduos de aminoácidos do centro ativo da en-
zima. Dentre estas se pode citar: a ligação covalente da enzima na presença de um inibi-
dor competitivo ou do substrato, a ligação reversível de um complexo enzima-inibidor,
a modificação química de uma enzima solúvel, induzindo a ligação com o suporte pelos
novos grupos introduzidos, e a ligação multipontual da enzima ao suporte.
Os suportes orgânicos não necessitam da etapa de silanização, uma vez que dis-
põem de grupos funcionais capazes de promover a ligação enzima-suporte. Porém, as
enzimas imobilizadas são mais ativas e estáveis quando se introduz um espaçador entre a
enzima e o suporte. Como espaçador pode-se empregar a hexametilenodiamina
(HEMDA), que tem a função de aumentar a mobilidade da enzima.
Amiloglicosidase, lipase e ciclodextrina-glicosil-transferase, dentre outras enzi-
mas, têm sido imobilizadas em quitina e quitosana, obtendo-se boa recuperação de ati-
1ª prova
vidade em relação à enzima solúvel (BON et alii, 1984; ZANIN et alii, 1998; PEREIRA et
alii, 2001; SOBRAL et alii, 2003a,b; GOMES et alii, 2004).
Uma enzima insolúvel pode ser obtida pela formação de ligações cruzadas inter-
moleculares (reticulação ou cross-linking) entre moléculas da enzima sem a presença
de um suporte sólido. Sempre que possível, deve-se escolher um reagente que promova
a ligação entre grupos não envolvidos na catálise e que esteja em concentração suficien-
te para a completa imobilização com retenção da atividade. O glutaraldeído tem sido o
reagente bifuncional mais amplamente utilizado (FERNANDES e CABRAL, 2006).
Em algumas situações, quando se deseja obter enzimas imobilizadas com maior ati-
vidade, ou aumentar a resistência mecânica dos suportes, é recomendável a utilização
de uma combinação de métodos para a imobilização de enzimas. Por exemplo, pode-se
melhorar a estabilidade da enzima imobilizada por adsorção promovendo-se uma
ligação cruzada entre as moléculas da enzima com o glutaraldeído.
Imobilização Multipontual
A imobilização multipontual de uma enzima consiste na formação de várias ligações cova-
lentes entre uma molécula de enzima e vários grupos ativos do suporte. Para se obter deriva-
do estável pela técnica de imobilização multipontual, deve-se selecionar um suporte morfo-
logicamente apropriado. Suportes porosos, cuja estrutura interna tem grande área superfi-
cial, como por exemplo, sílica, alumina e géis de agarose, promovem congruência geomé-
trica entre a enzima e o suporte, aumentando a rigidez de uma pequena parte da área su-
perficial da enzima (10 a 20%), que é transladada para toda a estrutura terciária, devido às
fortes interações entre todas as partes da molécula de proteína (GUISÁN et alii, 1991).
A ligação da enzima ao suporte dá-se entre grupos amino da enzima e grupos aldeí-
do alifáticos pequenos do suporte. Géis glioxil-agarose (Ag-O-CH2-CHO) possibilitam
multiinteração enzima-suporte intensa, sem distorção da estrutura da enzima, devido à
ausência de impedimentos estéricos para a reação química amina-aldeído, estabilidade
dos grupos aldeídos e reversibilidade de cada ligação unipontual amina-aldeído.
Com o uso do sistema insolubilização-estabilização de enzimas proposto por Guisán
(1988) e controle das variáveis que definem a intensidade das multiinterações enzima
(amino) suporte (aldeído), a saber, a densidade superficial dos grupos aldeído no gel ati-
vado, o tempo de contato enzima insolubilizada-suporte ativado, a temperatura e o pH, é
possível preparar derivados mais ativos e mais estáveis com, por exemplo, penicilina G-aci-
lase (BLANCO e GUISÁN, 1989), quimotripsina (GUISÁN et alii, 1991), esterase termo-
fílica (FERNADEZ-LAFUENTE et alii, 1995), carboxipeptidase A (PEDROCHE et alii,
2002), alcalase (TARDIOLI et alii, 2003b) e lipase (PALOMO et alii, 2005).
A tabela 6.2 mostra a atividade recuperada e o fator de estabilidade de diversas en-
zimas imobilizadas em gel glioxil-agarose (MATEO et alii, 2005). A atividade recupera-
da variou de 60 a 100% e a estabilização, de acordo com o tempo de meia vida do bioca-
talisador, em muitos casos foi 1.000 a 10.000 vezes mais alta do que a conseguida para a
enzima imobilizada unipontualmente.
1ª prova
Tabela 6.2 Atividade recuperada e fator de estabilidade para diversas enzimas imobilizadas
multipontualmente em glioxil-agarose
Enzima Atividade Recuperada (%) Fator de Estabilidade
Tripsina 75 10.000a
Quimotripsina 70 60.000a
Penicilina G acilase (E. coli) 70 8.000a
Lipase (C. rugosa) 50 150a
Lipase (B. thermocatenulatus) 75 500a
Esterase (B. stearothermophilus) 70 1000a
Termolisina (B. thermoproteolyticus) 100 100a
Glutamato racemase 70 1000a
Alcalase 54 500
Uroquinase 80 10
a: comparada com enzimas imobilizadas unipontualmente.
Fonte: Mateo et alii (2005).
Imobilização pela tecnologia de granulação

Um novo método, já patenteado, de imobilização baseia-se na interação entre a enzima
e um ligador líquido que são vaporizados por atomização sobre um suporte de sílica, cu-
jas partículas têm diâmetros inferiores a 100 mm – o mesmo que um grão de areia. Du-
rante a granulação, as partículas de sílica aglomeram-se e transformam-se em partículas
porosas de maiores dimensões, com a enzima distribuída uniformemente sobre toda a
área da superfície da sílica. O diâmetro médio das partículas é de cerca de 600 mm e a
área da superfície é de cerca de 50 m2 por grama. Isto cria uma grande área de contato
entre o substrato e a enzima. Muito embora os granulados de sílica sejam porosos, eles
são mecanicamente estáveis (NOVOZYMES, 2002).
Imobilização de Enzimas em Meio Orgânico e na Presença de

Aditivos
As moléculas de água, que estão ao redor da enzima em meio aquoso, têm papel im-
portante na estabilidade protéica devido, principalmente, às interações hidrofóbicas,
além das forças de van der Waals, pontes salinas e pontes de hidrogênio. Desta forma,
pequenas variações no meio reacional, tais como: temperatura, pH, força iônica entre
outras, podem induzir modificações estruturais na enzima desativando-a (YAMANE
et alii, 1990). Esta desnaturação decorre da exposição da parte hidrofóbica da enzima
à água, o que promove um aumento do nível de hidratação da enzima. Assim, não é
surpresa que a manipulação da natureza do meio e da quantidade de água ao redor da
enzima tenha um profundo efeito sobre a estabilidade. A remoção da água da superfí-
cie da enzima conduz à reorganização das moléculas de água, devido ao aumento do
1ª prova
número de ligações hidrogênio intramoleculares, o que contribui para a estabilização

e o aumento da rigidez da enzima. Este efeito pode ser alcançado pelo uso de aditivos
hidrofílicos, como os polióis e polissacarídeos, como mostra na figura 6.3 a e b. Esses
aditivos agem como reguladores da estrutura da enzima em meio aquoso (YAMANE
et alii, 1990).
As principais desvantagens, associadas ao uso de solventes orgânicos como meios
de bioconversão, são o aumento das limitações difusionais à transferência de massa de
substratos e produtos, uma vez que se introduz mais uma fase (orgânica) além da fase
aquosa (e de uma fase sólida se a enzima estiver imobilizada), e a toxicidade do solvente
orgânico para a enzima.
Por outro lado, quando a água é substituída por um solvente orgânico, alterações
na conformação nativa da enzima podem ocorrer, tanto na estrutura terciária como
nas mais proeminentes estruturas secundárias (a-hélice e a conformação b), acarre-
tando, desta maneira, a sua desestabilização. Com o objetivo de assegurar uma confor-
mação enzimática cataliticamente ativa em meio orgânico, a molécula de enzima deve
ter uma camada de hidratação definida (FABER, 1997), que reduz o contato do sol-
vente com a superfície da proteína e contribui para o aumento de sua flexibilidade in-
terna.
a)
Água
Enzima
b)
Polióis
Água
Enzima Enzima
Figura 6.3a Desnaturação da enzima em solução aquosa. (b) Efeito de polióis na estabilização das
enzimas.
1ª prova
Outra maneira de proteger a configuração nativa da enzima é a insolubilização em

suportes sólidos (MATTIASON e ADLERCREUTZ, 1991). Uma grande variedade de
materiais naturais e sintéticos, orgânicos ou inorgânicos, com diferentes tamanhos, for-
mas e densidades, foram estudados para a imobilização de enzimas para uso em solven-
tes orgânicos (BALCÃO et alii, 1996; VILLENEUVE et alii, 2000). No caso particular da
enzima lipase, estudos comparativos mostram diferenças acentuadas no desempenho
da mesma fonte de lipase imobilizada em diferentes suportes (tabela 6.3) e evidencia-
ram que, apesar das várias experiências reportadas na literatura, a imobilização de lipa-
ses ainda é um desafio complexo, uma vez que a extensão da imobilização depende da
estrutura da enzima, do método de imobilização e do tipo de suporte (RESLOW et alii,
1988; BALCÃO et alii, 1996; VILLENEUVE et alii, 2000). Em muitos casos, suportes que
proporcionam uma elevada atividade e estabilidade da enzima mostram sérias limita-
ções de resistência mecânica e à pressão, que os tornam inviáveis para a utilização em
alguns tipos de biorreatores (ISON et alii, 1994).
Tabela 6.3 Propriedades catalíticas da lipase microbiana de Candida rugosa imobilizada em

diferentes suportes
Característica STY-DVB Quitosana Quitina SPC Celulignina Sílica xerogel

Método de
Adsorção Ligação covalente Encapsulação
imobilização
Rendimento de 42 17 26 18 64 32
imobilização (%)
Atividade da 110 51 60 51 193 129
enzima (U/mg)
pH ótimo 7,5 6,0 7,5 7,5 8,0 7,5
Temperatura 50 45 45 50 40 55
ótima (°C)
Inativação Nd 0,63 1,07 0,26 0,79 0,19
térmica a 50°C
(h-1)
Estabilidade
operacional
Hidrólise nd 5,0 3,3 21 3,5 65
(t1/2 a 37°C, h)
Esterificação 620 83 426 32 302 135
(t1/2 a 37°C, h)
Referência Oliveira et Pereira et Gomes et Soares et Gomes et Soares et alii,
alii, 2000 alii, 2001 alii, 2004 alii, 1999 alii, 2005, 2004, 2005,
2006 2006
STY-DVB: copolímero de estireno-divinilbenzeno; SPC: sílica de porosidade controlada; nd: não determinado.
Sílica xerogel obtida pela técnica sol-gel empregando tetraetil ortosilicato (TEOS) como precursor.
1ª prova
O aumento da estabilidade é observado em algumas preparações de lipases quan-

do imobilizadas, possivelmente devido à capacidade do suporte em reter a quantidade
correta de água para manter ativa a enzima sem aumentar a flexibilidade que proporci-
ona a desnaturação. Gray et alii (1990) estudaram a imobilização da lipase de Candida
rugosa em vários suportes e encontraram atividades, em muitos casos, muito superiores
as observadas na enzima livre. A atividade da lipase imobilizada especialmente em su-
portes hidrofóbicos, como o polietileno, foi superior à da enzima livre. Isto foi explica-
do pelo efeito de orientação promovido pela estrutura do suporte, que provavelmente
forneceu à enzima uma melhor exposição ao substrato (BALCÃO et alii, 1996).
Dentre os métodos de imobilização, a adsorção física é talvez o procedimento de
imobilização mais simples e de menor custo. A especificidade do substrato permanece
inalterada, existindo ainda a possibilidade de regeneração do suporte. A adsorção da li-
pase pode ser efetuada em meio aquoso ou por imersão do suporte em ácidos graxos ou
óleo antes de sua exposição à solução da enzima livre. Geralmente adotam-se procedi-
mentos experimentais semelhantes na adsorção física da lipase em suportes hidrofóbi-
cos ou hidrofílicos. Pequenas variações incluem a suspensão do suporte na forma de pó
em uma mistura água/álcool desgaseificada, lavagem com água e tampão em uma colu-
na empacotada e finalmente percolação da solução de lipase através de uma coluna
(BALCÃO et alii, 1996).
No procedimento de ligação cruzada, as moléculas de lipase são quimicamente liga-
das umas às outras, por meio de vários reagentes bifuncionais. Um procedimento comum
consiste de uma etapa preliminar que envolve a imobilização da enzima em uma resina de
troca iônica (Dowex ou Amberlite), para obter alta “carga” da enzima, seguida por uma ou
mais etapas, nas quais formam-se as ligações covalentes. Essas etapas incluem o contato da
resina pré-tratada com glutaraldeído, dissolvido em um tampão adequado, para formar
uma base de Schiff (produto da reação com os grupos amino), seguido do tratamento com
uma solução de sulfito de hidrogênio para reduzir o excesso de glutaraldeído e da base, ou
alternativamente, seguido pela lavagem com uma solução de fosfato tamponada. A imobili-
zação de lipase em Amberlite foi obtida pela formação de ligações cruzadas dessas resinas
adsorvidas pela enzima com (HEMDA) e glutaraldeído (VILLENEUVE et alii, 2000).
Embora seja extensa a literatura referente à imobilização de lipases, são poucos os
dados relativos à estabilidade operacional desses derivados. Isto pode estar associado à
baixa estabilidade operacional das lipases imobilizadas, que atinge, em alguns traba-
lhos, cerca de 50 a 70% de redução em menos de cinco bateladas consecutivas
(BALCÃO et alii, 1996).
Para superar essas limitações, diversas tentativas têm sido descritas na literatura.
Controle das condições em que se efetua a imobilização, por exemplo, na presença de
aditivos, solventes orgânicos ou substrato, podem geralmente conduzir a preparações
mais estáveis (VILLENEUVE et alii, 2000).
Segundo Rocha et alii (1998), existem diversas formas de aumentar a atividade li-
política do sistema imobilizado, inclusive o uso de aditivo. A maior parte dos estudos en-
volve a imobilização simultânea do aditivo em processo de adsorção simples (ou por po-
cesso parcialmente modificado por precipitação da enzima, por evaporação da água ou
por liofilização). Alguns efeitos são atribuídos a esta nova técnica:
1ª prova
a) Proteção da inativação da enzima durante a etapa de imobilização (WEHTJE et

alii, 1993; TRIANTAFYLLOU et alii, 1995).
b) Retenção da camada de água ao redor do biocatalisador (TRIANTAFYLLOU et
alii, 1995).
c) Efeitos dispersantes das moléculas da enzima e facilitadores de transporte de
massa, quando aditivos são usados como matrizes de imobilização. Às vezes, o
papel destes aditivos (proteínas, sacarídeos, polióis e sais) pode ser desempe-
nhado pelas impurezas inativas incluídas na solução enzimática bruta. O aditivo
pode estar presente ou ausente no meio durante a reação. O contato do aditivo
com o suporte e com a enzima pode apresentar comportamento antagônico,
isto é, a interação do sistema (aditivo+suporte+enzima) pode ser suficiente, ou
também pode apresentar efeito negativo na reação de síntese ou resistência na
transferência de massa. A influência do aditivo na atividade enzimática ainda
não é totalmente compreendida (ROCHA et alii, 1998).
A seleção do aditivo adequado é função do tipo de enzima e do método de imobiliza-
ção utilizado. No caso específico das lipases, que exigem uma interface água-solvente, para
sua total atividade catalítica, o uso de aditivos macromoleculares mostra efeitos estabilizan-
tes significativos na atividade da enzima, por meio do revestimento da interface, impedindo
desta forma, alterações da estrutura protéica. Segundo Bosley (1991), caseína, gelatina, al-
bumina de ovo e albumina bovina são aditivos eficientes para a imobilização de lipases em
vários suportes. Resultados semelhantes foram descritos por Reetz et alii (1996). É também
recomendado o uso de outros tipos de aditivos macromoleculares, como por exemplo, po-
lietilenoglicol (PEG) e polivinilálcool (PVA). Em ambos os artigos, o uso de aditivos de bai-
xa massa molecular (sorbitol, glicerol e triglicerídeos) foi descartado.
Outro parâmetro que interfere na eficiência de um determinado aditivo é sua for-
ma de adição no procedimento de imobilização, isto é, em que etapa esta adição é mais
indicada e qual a quantidade de aditivo necessária para promover um grau satisfatório
de estabilização.
Com relação ao primeiro fator, o estudo detalhado realizado por Wehje et alii
(1993) sugere que a adição de aditivos deve ser efetuada antes da adição da enzima ou
simultaneamente com a enzima. A adição de aditivos após a imobilização da enzima no
suporte não mostrou nenhum efeito benéfico. Quanto à quantidade de aditivo, os auto-
res também recomendam uma avaliação experimental em função do tipo de aditivo
usado, tendo em vista, que o efeito do aditivo depende do seu tamanho molecular. Esse
fato é exemplificado na tabela 6.4 que reúne dados de atividade hidrolítica e de recupe-
ração da lipase de Candida rugosa, após imobilização em sílica de porosidade controla-
da, na ausência e presença de diversos agentes estabilizantes.
1ª prova
Tabela 6.4 Rendimento de imobilização da lipase de Candida rugosa em sílica de porosidade

controlada na presença de diferentes aditivos
Aditivo Atividade lipolítica Recuperação de enzima (%)

U/mg
Controle 58 19
Lecitina 50 17
Albumina 78 26
Ciclodextrina 36 12
Polietilenoglicol (MM 10000) 42 14
Polietilenoglicol (MM 1500) 104 35
Fonte: Soares et alii, 2001.
Ressaltamos que há extensa literatura disponível para o aprofundamento do estu-

do do uso de enzimas em meios orgânicos, assim como sobre a imobilizaçãona presença
ou ausência de aditivos (REETZ et alii, 1996; GONÇALVES et alii, 1999; PEREIRA et
alii, 2001; SOARES et alii, 2001, 2003).
VANTAGENS E LIMITAÇÕES DA IMOBILIZAÇÃO DE ENZIMAS

A imobilização da enzima tem um efeito benéfico na sua estabilidade, em função das inte-
rações físicas e químicas entre o suporte e as moléculas da enzima. A imobilização, tam-
bém auxilia a dispersão homogênea da enzima no meio, essencial, para a condução de re-
ações enzimáticas (DE CASTRO e ANDERSON, 1995; VILLENEUVE et alii, 2000).
Do ponto de vista comercial, as principais vantagens da utilização de enzimas imobi-
lizadas, em relação às enzimas solúveis são, praticamente, as relativas à catálise heterogê-
nea. São vantagens:
a) Aproveitar a atividade catalítica por um maior período de tempo, uma vez que a
enzima não deve ser desnaturada ao final do processo em batelada.
b) Operar de forma contínua possibilita o melhor controle das variáveis do proces-
so, pois o biocatalisador é retido no interior do biorreator e o substrato passa
pelo leito catalítico em escoamento contínuo, ou, então, transfere-se o biocata-
lisador para novas bateladas que contêm uma solução de substrato novo
(processo em bateladas repetidas).
c) Facilitar a separação do catalisador e do produto da reação, já que a enzima
imobilizada, não é solúvel no meiode reação, é retida no interior do biorreator,
e o substrato não convertido e o produto são retirados sem contaminação do
biocatalisador.
d) Reduzir o volume de reação, porque a enzima imobilizada e retida no biorrea-
tor permite alta concentração enzimática em menor volume de reator, isto é,
alta atividade por unidade de volume, muito superior a que se seria obtida com
1ª prova
a enzima livre. Isto conduz a uma alta produtividade volumétrica (kg) por volu-
me de reator (m3) e por hora. Além disto, como o substrato e produto são ex-
postos a condições de reação mais brandas por um menor tempo de reação, im-
pede-se a ocorrência de reações indesejáveis e a contaminação do meio de
reação.
e) Alterar, em alguns casos, as propriedades catalíticas da enzima em relação a sua
forma solúvel, como por exemplo, conferir-lhe maior estabilidade ao pH e à
temperatura, reduzir os efeitos de inibição pelo substrato e produto que são
removidos continuamente do biorreator.
f) Facilitar a interrupção da reação, quando se atinge um determinado grau de con-
versão, pela remoção do biocatalisador, se a operação está sendo realizada em ba-
telada, ou pelo ajuste do tempo de residência, se é utilizado um reator contínuo
(MESSING, 1975; ROSEVEAR et alii, 1987; HARTMEIER, 1988; TISCHER e
WEDEKIND, 1999).
O sucesso da tecnologia de imobilização mostra que, de modo geral, as vantagens
superam as limitações. Porém, alguns fatores devem ser apontados, não como desvanta-
gens do processo, mas sim como pontos a serem evitados. Dentre estes fatores podem
ser citados (ROSEVEAR et alii, 1987):
Perda da atividade durante o processo de imobilização

A estabilidade termodinâmica e cinética das enzimas e as diferenças nas sequências de
aminoácidos e respectivas estruturas tridimensionais, entre as enzimas intrinsecamente
termoestáveis e as termolábeis, justificam a sua performance e o seu elevadíssimo inte-
resse industrial. Vários são os exemplos de tentativas bem sucedidas de aumentar a esta-
bilidade das proteínas modificadas por metodologias de design específico (na molécula
de DNA ou na própria enzima) ou por evolução dirigida. A relação que existe entre ter-
moestabilidade elevada das enzimas isoladas de hipertermófilos e a sua baixa actividade
específica continua a ser um entrave ao aparecimento mais frequente de novas enzimas
no mercado, das quais se exige o binômio elevada termoestabilidade -alta atividade ca-
talítica. Nem todas as enzimas de hipertermófilos têm nível de termoestabilidade sufici-
ente para manter suas estruturas e funções fisiológicas quando sujeitas a altas tempera-
turas. Assim, são necessários fatores extrínsecos como chaperoninas moleculares e
solutos compatíveis, os osmólitos (STERNER e LIEBL, 2001).
A imobilização da enzima envolve o manuseio do biocatalisador (enzima–supor-
te), o que adiciona custos ao processo e invariavelmente resulta em inativação parcial da
enzima. Para melhor aproveitamento da técnica, recomenda-se utilizar elevadas con-
centrações de enzima em relação ao suporte. Como os métodos de imobilização, de
modo geral, envolvem interações fracas (forças de VAN DER WAALS), ou fortes (liga-
ção covalente), entre a frágil estrutura da enzima e o suporte, ocorre invariavelmente al-
teração da estrutura tridimensional da proteína, resultando em menor atividade. Além
disso, também podem ocorrer alterações de orientação e acesso do substrato ao sítio ati-
1ª prova
vo, reduzindo a atividade da enzima, ou ainda levando à redução aparente da especifici-

dade ao substrato. Isto poderia ser vantajoso porque diminui os efeitos de inibição pelo
substrato. Porém, como a maior parte dos processos enzimáticos envolve a transforma-
ção de macromoléculas, a redução da especificidade é uma desvantagem. Para se supe-
rar esse problema, busca-se a proteção do sítio ativo da enzima durante o processo de
imobilização, o que pode ser conseguido empregando-se altas concentrações de
substrato ou um inibidor de sítio ativo. Nestes casos, as substâncias protetoras devem
poder ser facilmente removidas ao final do processo de imobilização.
Efeitos difusionais (transferência de massa)

A enzima, com sua mobilidade restringida pelo fato de estar ligada a um suporte, perde
parte da acessibilidade ao substrato, o que leva à aparente redução da atividade, neste
caso provocada por restrições difusionais, ou seja, limitações do acesso do substrato ao
sítio ativo devido à presença da matriz sólida. Pode, também, ocorrer acúmulo de pro-
duto na proximidade do sítio ativo, o que pode afetar a cinética da reação, pela redução
da velocidade de reação, ou alterar o pH no microambiente da enzima. Estes efeitos de-
vem ser evitados ou diminuídos pela escolha criteriosa do suporte, ou pelas condições
de operação do biorreator. De um modo geral, pequenas partículas de suporte redu-
zem a resistência à difusão intrapartícula, enquanto altas vazões de fluido (vazões) redu-
zem os efeitos difusionais interpartículas. Estes dois fatores, são, normalmente, incom-
patíveis (partículas pequenas promovem uma alta queda de pressão ao longo do leito,
reduzindo a vazão de fluido), portanto, a aplicação específica determinará o grau de
compromisso desejável entre estes fatores.
Características físicas do biocatalisador e do fluido

Normalmente as enzimas imobilizadas devem ser utilizadas quando o substrato é solú-
vel. Quando as enzimas estão retidas no interior de matrizes porosas, os poros devem fa-
cilitar o livre acesso do substrato e reter ao mesmo tempo a molécula de enzima no seu
interior.
Estabilidade do biocatalisador
O custo da imobilização deve ser compensado pela longa vida do biocatalisador. O su-
porte deve manter suas propriedades físicas (resistência mecânica e ao ataque por rea-
gentes químicos) durante o tempo de meia-vida estimado. Normalmente, os substratos
utilizados nas reações enzimáticas contêm substâncias em suspensão, lipídios, que po-
dem se adsorver ao suporte e bloquear os poros, diminuindo a acessibilidade do subs-
trato à enzima e promovendo uma redução aparente do tempo de meia-vida da enzima
imobilizada. Neste caso, as soluções de substrato devem ser purificadas antes da
alimentação do biorreator.
1ª prova
APLICAÇÕES DAS ENZIMAS IMOBILIZADAS

As enzimas imobilizadas têm uma série de características especiais que tornam suas apli-
cações mais promissoras em relação às enzimas solúveis. Existem, na literatura, muitos
trabalhos e livros que apresentam e discutem o uso das enzimas imobilizadas nos cam-
pos industrial, analítico, médico, química fina, entre outros (tabela 6.1) (CHIBATA,
1978; CHEETHAM, 1985; ROSEVEAR et alii, 1987; TANAKA et alii, 1993; VELIK e
MCLEAN, 1994; CABRAL et alii, 1994; FERNANDES e CABRAL, 2006).
Dentre as aplicações de enzimas imobilizadas em larga escala, e que são considera-
das um sucesso, pode-se citar: a produção de xaropes de glicose e frutose a partir de ami-
do de milho; a produção do ácido 6-amino penicilínico (CABRAL et alii, 1994), penici-
lina semi-sentitética, com a enzima penicilina-G ou L-acilase, cuja produção mundial é
da ordem de 5 x 103 ton/ano; a produção de acrilamida empregando células imobiliza-
das; a produção de aspartame com a termolisina imobilizada; e a hidrólise da lactose
presente no soro de queijo.
A tabela 6.5 apresenta as principais aplicações comerciais das enzimas imobiliza-
das. O uso uso em escala industrial de enzimas imobilizadas incluem atualmente a pro-
dução de milhões de toneladas de xaropes de frutose (HFCS) em biorreatores que ope-
ram por 1 000 a 2 000 horas seguidas com um rendimento de 2 000 a 4 000 kg/kg de en-
zima. Milhares de toneladas desta enzima imobilizada são produzidas por quase uma
dezena de empresas espalhadas pelo mundo. Segue-se a essa enzima, considerando a
importância industrial, a penicilina-acilase usada para a produção do ácido 6-aminope-
nicilânico (6APA), precursor de mais de 15 penicilinas semi-sintéticas disponíveis no
mercado. Nesta tecnologia os biorreatores operam 2 000 a 4 000 horas seguidas com
rendimentos de 1 000 a 2 000 kg/kg de enzima. Aproximadamente 3 500 toneladas de
6APA são produzidas anualmente, sendo utilizadas 30 toneladas de preparação
enzimática.
De importância industrial equivalente são as enzimas imobilizadas usadas para a
produção de vários L-aminoácidos (como a L-alanina, a L-isoleucina, a L-metionina, a
L-fenilalanina, o L-triptofano e a L-valina usados para aumentar o valor nutricional dos
alimentos) e para a hidrólise de lactose. Os sistemas de enzimas imobilizadas têm tam-
bém espaço definido em metodologias analíticas, porque são usados na confecção de
biossensores (BON e PEREIRA, 1999). Os biossensores enzimáticos tornam-se cada vez
mais úteis em aplicações analíticas, devido à possibilidade de se combinar a seletividade
e sensibilidade da enzima com a simplicidade dos transdutores eletroquímicos
(FERRAZ et alii, 2006). Hoje em dia o mercado dos biossensores é dominado pelos bi-
ossensores de glicose, eletrodos enzimáticos produzidos em massa para um diagnóstico
rápido dos níveis de glicose sanguínea para diabéticos (NEWMAN e SETFORD, 2006).
As etapas fundamentais no desenvolvimento de um biossensor são a imobilização e esta-
bilização das enzimas ou outras proteínas sobre a superfície da matriz (KLIBANOV,
1979). Materiais que possam permitir a imobilização de espécies mediadoras e molécu-
las biológicas são de grande potencial para o desenvolvimento de sensores e biossenso-
res. Como citado, dentre os materiais inorgânicos, a sílica-gel tem um grande potencial
1ª prova
de aplicação em eletroquímica, entretanto essa é uma área de pesquisa relativamente

recente e que tende a crescer, como descreve Walcarius (1998) em sua recente revisão
sobre o uso de materiais à base de sílica nos estudos sobre eletrodos modificados e dire-
cionados para aplicações eletroanalíticas (GUPTA e CHAUDHURY, 2007).
Tabela 6.5 Exemplos de aplicações comerciais de enzimas imobilizadas
Enzima Substrato Produto

Glicose isomerase (5.3.1.5 ) Glicose Xarope de frutose
b-galactosidase (5.3.1.5) Lactose Glicose e galactose (leite livre de
lactose)
Lipase ( 3.1.1.3) Triglicerídeos Análogos de manteiga de cacau
Nitrila hidratase (4.2.1.84) Acrilonitrila Acrilamida
Amilocilase (3.5.1.14) D,L Aminoácidos L-amino ácidos (alanina,
isoleucina, metionina,
fenilalanina, triptofano e valina
Rafinase (3.2.1.22) Rafinose Soluções de galactose e
sacarose
Invertase (3.2.1.26) Sacarose Glicose/frutose mistura (açúcar
invertido)
Aspartame amônia liase (4.3.1.1) Amônia e ácido fumárico L-acido aspártico (usado na
síntese do aspartame)
Termolisina (3.4.24.27) Peptídeos Aspartame
Glicoamilase (3.2.1.3) Amido D- glicose
Papaína (3.4.22.2) Proteínas Remoção do “chill haze” em
cervejas
Penicilina amidase (3.5.1.11) Penicilina G e V Ácido 6-aminopenicilânico
(precursor das penicilinas
semi-sintéticas)
b-tirosinase Pirocatenol Ácido L-DOPA
As aplicações mais recentes de biocatalisadores imobilizados incluem a produção

de substâncias de alto valor agregado por bioconversão regioespecífica ou estereoespe-
cífica. São exemplos, o tratamento seletivo de poluentes específicos, para resolver pro-
blemas ambientais, a análise contínua com alta sensibilidade e especificidade de com-
postos de interesse, a conversão de energia em sistemas biológicos e, finalmente, em
medicina, a confecção de órgãos artificiais e a formulação de fármacos à base de
enzimas (BON e PEREIRA JR., 1999).
1ª prova
PERSPECTIVAS
Embora seja grande o número de trabalhos publicados no campo da imobilização de
enzimas os processos que as utilizam em escala industrial são poucos e isto se deve prin-
cipalmente aos seguintes fatores: o suporte e os reagentes para a imobilização são caros;
a ainda baixa eficiência dos métodos de imobilização; a relativamente baixa estabilida-
de operacional da enzima imobilizada; o fato de os equipamentos requeridos para a
operação contínua serem, via de regra, mais sofisticados e pouco versáteis; a pequena
demanda dos produtos, que, normalmente, não incentiva a produção em larga escala; e
a baixa eficiência das enzimas imobilizadas para produtos de alto peso molecular.
Para viabilizar a aplicação industrial, é necessário otimizar os seguintes parâme-
tros: custo de imobilização, retenção da atividade enzimática, estabilidade da enzima à
temperatura e ao pH, a estabilidade operacional e projeto do biorreator; além da
obtenção de suportes mais resistentes e baratos.
A tecnologia de imobilização reune os conhecimentos da química, da bioquímica,
da biologia molecular e celular aos da engenharia, buscando sempre se ampliar as apli-
cações das enzimas na conversão de matérias-primas, normalmente de baixo custo, em
produtos de maior valor agregado. Dessa forma, a imobilização de enzimas é realizada
não só com o propósito de atender aplicações puramente científicas, onde são utiliza-
das como modelos para estudar a relação entre a atividade catalítica e a estrutura protéi-
ca, mas principalmente visando o uso comercial em processos contínuos.
As estratégias de posicionamento da indústria de enzimas imobilizadas dependem
diretamente do avanço de investigação em áreas relacionadas com a estabilização enzi-
mática, entre elas aa investigação do uso de proteínas de proteção, como as chaperoni-
nas (MOSKOVITZ e SREBNIK, 2005). Outras estratégias têm sido abordadas com êxito
como a aplicação de modelos de inativação, a modificação química e a estabilização
com aditivos e solutos compatíveis (O’FAGAIN, 2003; SÁ-PEREIRA et alii, 2004). A área
que mais se destaca é a engenharia de proteínas que tem contribuído decisivamente
para o desenvolvimento de novos processos de estabilização enzimática.
REFERÊNCIAS
BALCÃO, V. M.; PAIVA, A. L.; MALCATA, F. X. Bioreactors with lipases: state of the art. Enzyme Microb
Technol, 18:392-416, 1996.
BLANCO, R. M. e GUISÁN, J. M. Stabilization of enzymes by multipoint covalent attachment to agarose-al-
dehyde gels. Borohydride reduction of trypsin-agarose derivatives. Enzyme Microb Technol,
11:360-366, 1989.
BOM, E. P. S. e PEREIRA Jr., N. (ed.). Tecnologia Enzimática. Editado pelo ENZITEC, 113 p., 1999.
BON, E. P. S. et alii. Immobilization of glucoamylase on chitin. In: Biotechnology and Bioengineering
Symposium, n. 14:485-492, 1984.
BOSLEY, J. A. Supported enzymes. Patent Application EQP 4241130 A1, 1991.
CABRAL, et alii. Applied Biocatalysis. Chur, Harwood Academic Publishers, 1994.
CHANIOTAKIS, N. A. A. Enzyme stabilization strategies based on electrolytes and polyelectrolytes for bio-
sensor applications. Anal Bioanal Chem, 378:89-95, 2004.
1ª prova
CHEETHAM, P. S. J. Principles of industrial enzymology basis of utilization of soluble and immobilized

enzymes in industrial processes. In: CHICHESTER. (ed.). Handbook of enzyme biotechnology. 2nd.
John Wiley & Sons, 1985.
CHIBATA, I. Immobilized enzymes. New York, John Wiley & Sons, 1978.
DE CASTRO, H. F. e ANDERSON, W. A. Fine chemicals by biotransformation using lipases. Química
Nova, 18:544-554, 1995.
DE OLIVEIRA, P. C.; ALVES, G. M.; DE CASTRO, H. F. Immobilisation studies and catalytic properties of
microbial lipase onto styrene-divinylbenzene copolymer. Biochem. Eng. J., 5(1):63-71, 2000.
FABER, K. Biotransformation in organic chemistry: A textbook. 3rd ed. Springer Produktions-Gesellschaft,
Berlin, 1997.
FERNANDES, P. e CABRAL, J. M. S. Biotransformation. In: Basic Biotechnology. 3rd ed. Cambridge Uni-
versity Press, Edited by Colin Ratledge, Borj Kristiansen, 577-626, 2006.
FERNANDEZ-LAFUENTE, R.; COWAN, D. A.; WOOD, N. P. Hyperstabilization of a thermophilic esterase
by multipoint covalent attachment. Enzyme Microb Technol, 17:366-372, 1995.
FERRAZ, R. M.; VERA, A.; ARÍS, A.; VILLAVERDE, A. Insertional protein engineering for analytical mole-
cular sensing. Microbial Cell Factories, 5:15, 2006.
GEMEINER, P. Enzyme engineering – Immobilized biosystems. New York, Ellis Horwood, 1992.
GOMES, F. M.; PEREIRA, F. B.; DE CASTRO, H. F. Immobilization of lipase on chitin and its use in non-
conventional biocatalysis. Biomacromol, 5(2):17-23, 2004.
GONÇALVES, A. M.; SCHUCHT, E.; MATTHIJS, G.; AIRES-BARROS, M. R.; CABRAL, J. M. S.; GIL, M. H.
Stability studies of a recombinant cutinase immobilized to dextran and derivatized silica supports.
Enzyme Microb Technol, 24:60-66, 1999.
GRAY, C. J.; NARANG, J. S.; BARKER, S. A. Immobilization of lipase from Candida cylindraceae and its use
in the synthesis of menthol esters by transesterification. Enzyme Microb Technol, 12:800-807, 1990.
GUISÁN, J. M.; BASTIDA, A.; CUESTA, C.; FERNANDEZ-LAFUENTE, R.; ROSSEL, C. M. Immobilizati-
on-stabilization of a-chymotrypsin by covalent attachment to aldeyde-agarose gels. BioTechnol. Bio-
eng, 38:1144-1152, 1991.
GUISÁN, J. M. Aldeyde-agarose gels as activated supports for immobilization-stabilization of enzymes.
Enzyme Microb Technol, 10:375-382, 1988.
GUPTA, R. e CHAUDHURY. N. K. Entrapment of biomolecules in sol–gel matrix for applications in bio-
sensor: Problems and future prospects. Biosensor Bioelectronics, doi 10.1016/j.bios.20006.12.025,
2007.
HARTMEIER, W. Immobilized Biocatalysts – An Introduction. Trad. J. Wieser, Berlin, Springer-Verlag,
1988.
HERNANDEZ, C. E. L.; LUTZ, S.; LIESE, A.; BOM, E. P. S. Activity and stability of Caldariomyces fumago
chloroperoxidase modified by reductive alkylation, amidation and cross-linking. Enzyme Microb
Technol, 37(6)582-588, 2005.
ISON, A. P.; MACRAE, A. R.; SMITH, G. J.; BOSLEY, J. Mass transfer effects in solvent-free fat interesterifi-
cation reactions: influence on catalyst design. BioTechnol. Bioeng, 43:122-130, 1994.
KANDIMALLA, V. B.; TRIPATHI, V. S.; JU, H. X. Immobilization of biomolecules in sol-gels: Biological
and analytical applications. Critl. Rev. Anal. Chem., 36:73-106, 2006.
KATCHALSKI-KATZIR, E.; KRAEMER, D. M. Eupergit C, a carrier for immobilization of enzymes of in-
dustrial potential. J. Mol. Catalys B: Enzymatic, 10:157-176, 2000.
KENNEDY, J. F. e ROIG, M. G. Principles of immobilization of enzymes. In: Handbook of enzyme biotech-
nology. 3rd ed. London, T. P. Press, 1995.
1ª prova
KENNEDY, J. F. e WHITE, C. A. Principles of immobilization of enzymes. In: Handbook of enzyme bio-

technology. 2nd ed. Chichester, John Wiley & Sons, 1985.
KLIBANOV, A. M. Enzyme stabilization by immobilization. Anal Biochem, 93(1):1-25, 1979.
LEMOS, J. L. S.; BON, E. P. S.; SANTANA, M. F. E.; PEREIRA Jr., N. Thermal stability of xylanases produ-
ced by Aspergillus awamory. Brazilian Journal of Microbiology, 31(3):3, 2000.
LI, B. e TAKAHASHI, H. New immobilization method for enzyme stabilization involving a mesoporous
material and an organic/inorganic hybrid gel. BioTechnol. Lett, 22:1953-1958, 2000.
MA, J. K. C_C.; DRAKE, P. M. W. e CHRISTOU, P The production of recombinant pharmaceutical prote-
ins in plants. Nature Rev. Genet., 4:794-805, 2003.
MATEO, C.; PALOMO, J. M.; FUENTES, M.; BETANCOR, L.; GRAZU, V.; LÓPEZ-GALLEGO, F.;
PESSELA, B. C. C.; HIDALGOM, A.; FERNÁNDEZ-LORENTE, G.; FERNÁNDEZ-LAFUENTE, R.;
GUISÁN, J. M. Glyoxyl agarose: A fully inert and hydrophilic support for immobilization and high sta-
bilization of proteins. Enzyme Microb Technol, 2:274-280, 2006.
MATTIASON, B. e ADLERCREUTZ, P. Tailoring the microenvironment of enzymes in water poor
systems. Trends. Biotechnol., 9:394-398, 1991.
MESSING, R. A. Immobilized enzymes for industrial reactors. New York, Academic Press, 1975.
MESSING, R. A. Carries for immobilized biologically active systems. In: HEIDELBERG, I. Advances in bio-
chemical engineering – immobilized enzymes. Springer-Verlag, v. 10, 1978.
MOSBACH, K. Immobilized enzymes. In: Methods in Enzymology. New York, Academic Press, v. XLIV,
1976.
MOSKOVITZ, Y. e SREBNIK, S. Mean-field model of immobilized enzymes embedded in a grafted poly-
mer layer. Biophys. J., 89(1):22-31, 2005.
NELSON, J. M. e GRIFFIN, E. G. Adsorption of invertase. J. Am Chem. Soc, 38:1109, 1916.
NEWMAN, J. D. e SETFORD, S. Enzymatic biosensors. Mol. Biotechnol., 32(3):249-268, 2006.
NOVOZYMES. Nova técnica de imobilização: um impulso para as lipases Biotime. Disponível em: www.no-
vozymes.com/library/Publications/Biotimes_Sprog/PT_bio102-fat.pdf, 2002.
O’FAGAIN, C. Enzyme stabilization – recent experimental progress. Enzyme Microb Technol, 33:137-149,
2003.
PALOMO, J. M.; ORTIZ, C.; FERNANDEZ-LORENTE, G.; FUENTES, M.; GUÍSAN, J. M.;
FERNANDEZ-LAFUENTE, R. Lipase–lipase interactions as a new tool to immobilize and modulate
the lipase properties. Enzyme Microb Technol, 36(4):447-454, 2005.
PEDROCHE, J.; YUST, M. M.; GIRON-CALLE, J.; VIOQUE, J.; ALAIZ, M.; MATEO, C.; GUISAN, J. M.;
MILLAN, F. Stabilization-immobilization of carboxypeptidase A to aldehyde-agarose gels. A practical
example in the hydrolysis of casein Enzyme Microb Technol, 31:711-718, 2002.
PEREIRA, E. B.; DE CASTRO, H. F.; DE MORAES, F. F.; ZANIN, G. M. Kinetic studies of lipase from Candi-
da rugosa. A comparative study of the free and the immobilized enzyme on porous chitosan beads.
Appl. Biochem. Biotechnol, 91-93:739-752, 2001.
PIERRE, A. C. The sol-gel encapsulation of enzymes Biocatalys. Biotransform, 22(3):145-170, 2004.
POWELL, K. A.; RAMER, S. W.; CARDAYRÉ, S. B.; STEMMER, W. P. C.; TOBIN, M. B.; LONGCHAMP, P.
F.; HUISMAN, G. W. Directed evolution and biocatalysis. Angewandte Chemie International Edition,
40(21):3948-3959, 20010,
RAJAN, M. Global market for industrial enzymes to reach $2.4 million by 2009 Business Communications
Company, Inc. RC-147U Enzymes for Industrial Applications. Disponível em: http://www.bccrese-
arch.com/editors/RC-147U.html. Acessado em 23 de Outubro de 2006, 2004.
REETZ, M. T.; ZONTA, A.; SIMPELKAMP, J. Efficient immobilization of lipases by entrapment in hydrop-
hobic sol-gel materials. BioTechnol. Bioeng, 49:527-534, 1996.
1ª prova
RESLOW, M.; ADLERCREUTZ, P.; MATTIASON, B. On the importance of the support material for bioor-
ganic synthesis – Influence of material partition between solvent, enzyme and solid support in wa-
ter-poor reaction media. Eur J. Biochem, 172: 573-578, 1988.
ROCHA, J. M. S.; GIL, M. H.; GARCIA, F. A. P. Effects of additives on the activity of a covalently immobili-
sed lipase in organic media. J. Biotechnol., 66:61-67, 1998.
ROSEVEAR, A.; KENNEDY, J. F. e CABRAL, J. M. S. Immobilized enzymes and cells. Bristol, Adam Hilger,
1987.
SÁ-PEREIRA, P.; CARVALHO, A. S. L.; COSTA-FERREIRA, M.; AIRES-BARROS, M. R. Thermostabilizati-
on of Bacillus subtillis CCMI 966 xylanases with trehalose. Study of deactivation kinetics. Enzyme Mi-
crob Technol, 34:278-282, 2004.
SÁ-PEREIRA, P.; PAVEIA, H.; COSTA-FERREIRA, M.; AIRES-BARROS, M. R. Review article: A new look at
xylanases – an overview of purification strategies. Mol. Biotechnol., 24(3):257-281, 2003.
SOARES, C. M. F.; DE CASTRO, H. F.; SANTANA, M. H. A.; ZANIN, G. M. Intensification of lipase perfor-
mance for long term operation by immobilization on controlled pore silica in the presence of polyeth-
ylene glycol. Appl. Biochem. Biotechnol, 98-100:863-874, 2002.
SOARES, C. M. F.; DE CASTRO, H. F.; SANTANA, M. H. A.; ZANIN, G. M. Selection of stabilizing additive
for lipase immobilization on controlled pore silica by factorial design. Appl. Biochem. Biotechnol,
91-93:703-718, 2001.
SOARES, C. M. F.; DE CASTRO, H. F.; ITAKO, J. E.; DE MORAES, F. F.; ZANIN, G. M. Characterization of
sol-gel bioencapsulates for ester hydrolysis and synthesis. Appl. Biochem. Biotechnol,
121(124):845-860, 2005.
SOARES, C. M. F.; DOS SANTOS, A. O.; DE CASTRO, H. F.; DE MORAES, F. F.; ZANIN, G. M. Characteri-
zation of sol-gel encapsulated lipase using tetraethoxysilane as precursor. J. Mol. Catalys B: Enzym,
39:69-76, 2006.
SOARES, C. M. F.; DOS SANTOS, A. O.; OLIVO, J. E.; DE CASTRO, H. F.; DE MORAES, F. F.; ZANIN, G.
M. Influence of the alkyl-substituted silane precursor on sol-gel encapsulated lipase activity. J. Mol. Ca-
talys B: Enzym, 29:69-79, 2004.
SOARES, C. M. F.; SANTANA, M. H. A.; ZANIN, G. M.; DE CASTRO, H. F. Covalent coupling method for
lipase immobilization on controlled pore silica in the presence of non-enzymatic proteins. BioTech-
nol. Progress, 19(3):803-807, 2003.
SOBRAL, K. A.; RODRIGUES, R. O.; OLIVEIRA, R. D.; OLIVO, J. E.; DE MORAES, F. F.; ZANIN, G. M.
Immobilization of cyclodextrin glycosyltransferase from Bacillus firmus in commercial chitosan. J.
Inclus Phenom Macroc Chem, 44:383-386, 2003a.
SOBRAL, K. A.; RODRIGUES, R. O.; OLIVEIRA, R. D.; OLIVO, J. E.; DE MORAES, F. F.; ZANIN, G. M.
Evaluation of supports and methods for the immobilization of the enzyme cyclodextringlycosyltrans-
ferase. Appl. Biochem. Biotechnol, 102-104:809-819, 2003b.
TAKAHASHI, H. e MIYZAKI, C. Super Enzyme –Enzyme Stabilization in Mesoporous Materials. R&D Revi-
ew Toyota CRDL, 35(4), 2000.
TANAKA, A.; TOSA, T.; KOBAYASHI, T. Industrial application of immobilized biocatalysts. New York,
Marcel Dekker, 1993.
TARDIOLI, P. W.; PEDROCHE, J.; GIORDANO, R. L.; FERNANDEZ-LAFUENTE, R.; GUISÁN, J. M.
Hydrolysis of proteins by immobilized-stabilized alcalaseÒ-glyoxyl agarose. BioTechnol. Progress,
19:352-360, 2003b.
TISCHER, W. e WEDEKIND, F. Immobilized Enzymes: Methods and Applications Topics in Current Bio-
chemistry In: Biocatalysis – from Discovery to application, ISSN 0340-1022 (Print), 1436-5049 (Onli-
ne), 200: 95-126, 1999.
1ª prova
TISHER, W. e KASCHE, V. Immobilized enzymes: crystals or carriers. Trends. Biotechnol., 17:326-335,

1999.
TREVAN, M. D. Immobilized enzymes. An introduction and applications in biotechnology. New York,
TRIANTAFYLLOU, A. O.; WEHTJE, E.; ADLERCREUTZ, P.; MATTIASON, B. Effects of sorbitol addition
on the action of free and immobilized hydrolytic enzymes in organic media. BioTechnol. Bioeng,
45:406-414, 1995.
VELIK, I. A. e McLEAN, R. J. C. Immobilized biosystems –Theory and practical applications. London, Blac-
kie Academic & Professional, 1994.
VIETH, W. R. Bioprocess Engineering – Kinetic, mass transport, reactors and gene expression. New York,
VILLENEUVE, P.; MUDERHWA, J. M.; GRAILLE, J.; HAAS, M. J. Customizing lipases for biocatalysis: A
survey of chemical, physical and molecular biological approaches. J. Mol. Catalys B: Enzym, 9:113-148,
2000.
WALCARIUS, A. Analytical applications of sílica-modified electrodes -–A comprehensive review. Electroa-
nalysis, 10(18):1217-1235, 1998.
WEETALL, H. H. Immobilization by covalent attachment and by entrapment. In: Immobilized enzymes
for industrial reactors. New York, Academic Press, 1975.
WEETALL, H. H. Covalent coupling methods for inorganic support materials. In: Immobilized enzymes -
Methods in enzymology. New York, Academic Press v. XLIV, 1976.
WEHTJE, E.; ADLERCREUTZ, P.; MATTIASSON, B. Improved activity retention of enzymes deposited on
solid supports. BioTechnol. Bioeng, 41:171-178, 1993.
WINGARD Jr., L. B. Enzyme Engineering. New York, Interscience Publishers, 1972.
YAMANE, T.; ICHIRYU, T.; NAGATA, T.; UENO, A.; SHIMIZU, S. Intramolecular esterification by lipase
powder in micro-aqueous benzene: factors affecting activity of pure enzymes. BioTechnol. Bioeng,
36:1063-1069, 1990.
ZABORSKY, O. R. Immobilized Enzymes. CRC Press, Cleveland, 1973.
ZABORSKY, O. R. Immobilized Enzymes – Miscellaneous methods and general classification. In: Immobi-
lized enzymes – Methods in Enzymology.New York, Academic Press, v. XLIV, 1976.
ZANIN, G. M. e DE MORAES, F. F. Thermal stability and energy of deactivation of free and immobilized
amyloglucosidase in the saccharification of cassava starch. Appl. Biochem. Biotechnol, 70-72:383-394,
1998.
ZANIN, G. M. e MORAES, F. F. Enzimas como Agentes Biotecnológicos. SAIAD, S.; PIETRO, R. C. L. R.
(ed.). Legis Summa, Ribeirão Preto, Cap.4, p. 35-85, 2004.
1ª prova
1ª prova

Enzimas Cap 06 - Sa Pereira P

Enviado por

Dados do documento

Direitos autorais

Formatos disponíveis

Compartilhar este documento

Compartilhar ou incorporar documento

Opções de compartilhamento

Você considera este documento útil?

Este conteúdo é inapropriado?

Direitos autorais:

Formatos disponíveis

Enzimas Cap 06 - Sa Pereira P

Enviado por

Direitos autorais:

Formatos disponíveis

6 IMOBILIZAÇÃO DE ENZIMAS E

IMOBILIZAÇÃO DE ENZIMAS – UMA PERSPECTIVA HISTÓRICA

paços físicos definidos, em contraposição ao uso de enzimas “fixadas” ou “insolubiliza-

De particular interesse é o aumento do uso de enzimas imobilizadas, fisicamente

Classificação das Enzimas Imobilizadas

c) Enzimas solúveis com derivatização- enzimas cuja mobilidade foi restringida

Métodos de imobilização de enzimas

Suportes para a imobilização de enzimas

Tipo de reação Propriedades

Métodos Efeitos de Estabilidade

Figura 6.1 Interação entre suporte e enzima.

Tabela 6.1 Fatores que influenciam o desempenho de um sistema de enzima imobilizada

Enzima Propriedades Bioquímicas: Massa molecular, grupos funcionais da

Suporte Características Químicas: Composição e base química, grupos

Enzima Imobilizada Método de Imobilização: Fixação de proteína, eficiência da enzima ativa,

Fonte: Tischer e Kasche (1999).

De todos os fatores anteriormente citados, com exceção da enzima, a maior contri-

¡ Características químicas: os suportes devem possuir grupos químicos que po-

enzima imobilizada é levada da situação de estocagem (normalmente em baixas

Os processos de imobilização de mais de uma enzima em um mesmo suporte têm

Imobilização no Interior de um Suporte

Enzimas insolúveis Enzimas solúveis

Encapsulamento Ligação sem derivação com derivação

em gel em fibras microencapsulação ligação simples reticulação

adsorção ligação iônica quelação ligação covalente

Figura 6.2 Classificação dos métodos de imobilização.

As principais vantagens da encapsulação de enzimas incluem a grande área super-

a) A restrição de que os biocatalisadores somente podem ser utilizados com subs-

A atividade enzimática e a termoestabilidade em solventes orgânicos foi significa-

Imobilização sobre um Suporte

suporte e imobilização da enzima), a estabilidade operacional obtida, quando se traba-

Enzima Atividade Recuperada (%) Fator de Estabilidade

Imobilização pela tecnologia de granulação

Imobilização de Enzimas em Meio Orgânico e na Presença de

número de ligações hidrogênio intramoleculares, o que contribui para a estabilização

Outra maneira de proteger a configuração nativa da enzima é a insolubilização em

Tabela 6.3 Propriedades catalíticas da lipase microbiana de Candida rugosa imobilizada em

Característica STY-DVB Quitosana Quitina SPC Celulignina Sílica xerogel

O aumento da estabilidade é observado em algumas preparações de lipases quan-

a) Proteção da inativação da enzima durante a etapa de imobilização (WEHTJE et

Tabela 6.4 Rendimento de imobilização da lipase de Candida rugosa em sílica de porosidade

Aditivo Atividade lipolítica Recuperação de enzima (%)

Fonte: Soares et alii, 2001.

Ressaltamos que há extensa literatura disponível para o aprofundamento do estu-

VANTAGENS E LIMITAÇÕES DA IMOBILIZAÇÃO DE ENZIMAS

Perda da atividade durante o processo de imobilização

vo, reduzindo a atividade da enzima, ou ainda levando à redução aparente da especifici-

Efeitos difusionais (transferência de massa)

Características físicas do biocatalisador e do fluido

APLICAÇÕES DAS ENZIMAS IMOBILIZADAS

de aplicação em eletroquímica, entretanto essa é uma área de pesquisa relativamente

Tabela 6.5 Exemplos de aplicações comerciais de enzimas imobilizadas

Enzima Substrato Produto

As aplicações mais recentes de biocatalisadores imobilizados incluem a produção

CHEETHAM, P. S. J. Principles of industrial enzymology basis of utilization of soluble and immobilized

KENNEDY, J. F. e WHITE, C. A. Principles of immobilization of enzymes. In: Handbook of enzyme bio-

TISHER, W. e KASCHE, V. Immobilized enzymes: crystals or carriers. Trends. Biotechnol., 17:326-335,

Você também pode gostar