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Neves, L.C.

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3. REVISO BIBLIOGRFICA
3.1.Processos Fermentativos
Em termos gerais, a fermentao implica na utilizao de microrganismos
na transformao da matria orgnica catalisada por enzimas.
A humanidade convive com processos fermentativos desde 5.000 a.C na
sua utilizao para a obteno de vinho, queijos e outros derivados do leite.
Os egpcios j utilizavam a fermentao da cevada para a obteno de uma
espcie de cerveja e, em 4000 a .C, a levedura da cerveja j estava sendo
utilizada para a panificao. No Mxico, os astecas costumavam cultivar
algas do gnero Spirulina para consumo prprio (WARD,1991).
Hoje em dia, diversos produtos utilizados nas indstrias qumicas,
farmacuticas e de alimentos so obtidos por processos fermentativos. Estes
produtos podem ser gerados pelo metabolismo primrio (ex: Etanol) ou
secundrio (Ex: Antibiticos) do microrganismo cultivado e ao lado da
produo de biomassa, enzimas e protenas em geral, eles so os
responsveis pela evoluo tecnolgica e desenvolvimento das pesquisas na
rea (WARD,1991).
As fermentaes podem ser conduzidas por processos descontnuos,
descontnuo-alimentados ou contnuos, bem como, por variaes destes
processos. (WARD, 1991; BORZANI, 2001).
Independente do modo de operao utilizado, o desenvolvimento de
processos fermentativos para a produo de enzimas por microrganismos
tornou vivel a obteno de novos sistemas enzimticos (PARK, 1975).
Novos

processos

que

fossem

economicamente

viveis,

com

reprodutibilidade e confiabilidade, aumentariam a necessidade de controle e


melhor

acompanhamento

do

processo.

Porm,

maiores

progressos

resultariam de uma melhor compreenso da fisiologia microbiana, interaes


do microrganismo com o meio e sua habilidade em manipular fluxos
metablicos (BUCKLAND, LILLY, 1993).
Diversos so os estudos com a finalidade de aprimorar e otimizar os
processos fermentativos, objetivando a produo de enzimas (PESSOA-

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JNIOR et al., 1996; ABRAHO-NETO et al., 1996). No entanto, segundo


TONGUE, INLOES (1990), a real aplicao industrial de qualquer enzima s
vivel se as condies utilizadas no processo fermentativo forem favorveis
e se a enzima produzida em larga escala apresentar os mesmos nveis, de
atividade e produtividade obtidas em escala de bancada.
Segundo TACIRO (1992), a ampliao de escala de um processo
fermentativo, para que este se torne vivel industrialmente, dever manter as
condies do processo uniformes para qualquer volume de operao.
No entanto, de acordo com TONG & INLOES (1990), para tornar vivel
essa ampliao de escala indispensvel primeiro definir o microrganismo a
ser empregado, o meio de cultivo e as condies de agitao e aerao mais
adequadas ao processo.
3.1.1.Processo Descontnuo
Os cultivos descontnuos podem ser considerados como sendo um sistema
fechado, exceto pela aerao e controle de pH atravs da adio de cidos e
bases, que contm uma quantidade limitada de meio, e no qual o inculo
passa por um nmero de fases, o que pode ser observado pela curva de
crescimento celular. Em processos descontnuos e semi-contnuos, todo o
substrato fornecido no incio da fermentao, enquanto que nos demais
processos, o substrato adicionado ao longo do cultivo.
A principal desvantagem da fermentao descontnua, quando utilizada
para a produo de bioprodutos associados ao crescimento celular, que a
formao eficiente do produto ocorre somente durante uma parte do ciclo de
fermentao, o que promove uma produtividade menor do que a obtida por
processos que consigam prolongar este perodo.
Em cultivos descontnuos, as elevadas concentraes de acares podem
resultar numa represso chamada Efeito Crabtree, na qual as enzimas da
respirao microbiana so inibidas e a produo de etanol aumenta. Este
problema pode ser resolvido atravs do cultivo descontnuo-alimentado, onde
os nutrientes essenciais podem ser alimentados conforme a necessidade do
microrganismo durante o cultivo (WIN et al., 1995).

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A quantidade de biomassa alcanada por um processo descontnuo


depende da concentrao inicial de substrato limitante do crescimento e da
eficcia do microrganismo para converter o substrato em material celular.
Segundo WARD (1991), a funo principal de um fermentador a de
proporcionar um meio ambiente controlado que permita o crescimento
eficiente das clulas e, a conseqente, obteno do produto de interesse.
Sendo assim, na hora de decidir-se por um fermentador em escala
laboratorial ou piloto, deve-se levar em conta a futura ampliao de escala,
que por sua vez, resulta em fermentadores onde o custo e objetivos
especficos so levados em conta. Os fermentadores trabalham, na maior
parte dos processos, em condies asspticas, o que sugere a utilizao de
inculo livre de contaminantes e de um sistema de fermentao passvel de
esterilizao.
A maior parte dos processos fermentativos utiliza o reator do tipo tanque
com agitao convencional mecnica, que nada mais que um eixo vertical
contendo diversos agitadores em forma de p. O ar estril introduzido,
geralmente, pela base da dorna e atravs de dispersores distribudo por
todo o meio atravs do sistema de agitao. Portanto, a geometria dos
fermentadores deve facilitar a eficcia da troca gasosa e as caractersticas
finais deste fermentador devero levar em conta os fenmenos de transporte
existentes nos processos biolgicos.
3.1.2. Processo Descontnuo-Alimentado
O processo descontnuo alimentado vem sendo utilizado desde 1900 para
regular o crescimento de Saccharomyces cerevisiae, porm, os primeiros a
utilizarem esse termo foram YOSHIDA et al. (1973). Basicamente, o
processo descontnuo-alimentado definido como uma tcnica em
processos microbianos, onde um ou mais nutrientes so adicionados no
fermentador durante o cultivo e em que os produtos a permanecem at o
final da fermentao. Em alguns casos, todos os nutrientes so adicionados
gradualmente dorna (YAMANE et al., 1984) ou, ento, apenas os
chamados aditivos (precursores de produtos ou nutrientes de menor

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concentrao no meio) que so alimentados. A vazo de alimentao


pode ser constante ou variar com o tempo, sendo que, no caso de a vazo
de alimentao variar com o tempo, esta pode ser regulada em funo da
concentrao de substrato desejada no meio, podendo-se, inclusive, manter
a concentrao de substrato constante durante a alimentao (SENE et al.,
2000).
Existem dois sistemas bsicos de aplicao para uma fermentao
descontnuo-alimentada (Fed-Batch), que so o de volume fixo e volume
varivel. No caso de volume fixo, o substrato alimentado sem que ocorra
diluio da cultura. O volume de meio de cultura pode ser mantido constante
atravs da alimentao de substrato na forma de lquido concentrado ou
atravs de dilise. Em sistemas de volume varivel, o volume se altera de
acordo com o tempo de fermentao oportuno para o substrato alimentado.
A forma como esse volume se altera depende de fatores como as
exigncias, limitaes e dos objetivos da operao. A alimentao pode ser
efetuada atravs da adio com vazo constante, vazo crescente e vazo
decrescente, entre outros. Este processo pode ser classificado, tambm,
como fermentao decontnuo-alimentada simples ou repetida, sendo o
processo de fermentao repetida aquele onde parte do meio de cultura
removido do sistema em um certo momento da operao e mais meio
nutriente ento adicionado. A existncia de um volume reduzido no incio
do cultivo ou uma menor concentrao de nutrientes durante o enchimento,
promove o aumento na velocidade especfica de crescimento, seguido por
um decrscimo gradual onde se estabelece um estado praticamente
constante. No processo simples, um meio de crescimento complementar
adicionado durante a fermentao sem retirar-se a cultura at o fim do
cultivo. Neste processo, a durao da fermentao limitada pelo volume do
fermentador.
A fermentao descontnuo-alimentada uma tcnica de produo
situada entre a fermentao descontnua e a contnua, onde necessria
uma vazo de alimentao apropriada, com a constituio certa dos
componentes. Este tipo de fermentao oferece diversas vantagens em

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relao aos outros processos. Entre as vantagens oferecidas tem-se a


produo de elevadas concentraes de clulas devido ao extenso tempo de
trabalho (o que particularmente importante no caso de produtos
associados ao crescimento celular), o melhor controle das condies de
adio de substratos durante a fermentao (particularmente importante no
caso das concentraes de substratos especficos como, por exemplo, a
fonte de carbono), o melhor controle dos produtos obtidos ou dos efeitos da
represso catablica devido adio de substrato ser limitado apenas
quantidade necessria para a formao do produto, o modo de operao
permite dominar e controlar os desvios no crescimento do microrganismo
encontrados na fermentao descontnua, permite a reposio da gua
perdida no meio por evaporao, um modo alternativo de operao para
fermentaes que utilizem substratos txicos ou de baixa solubilidade e a
no necessidade de peas adicionais especiais como necessrio em uma
fermentao contnua.
Segundo WIN et al. (1996), a produtividade celular (PrX) alcanada no
cultivo de S.cerevisiae utilizando melao de cana-de-acar em processo
descontnuo foi de 0,31 g/L enquanto que a obtida para processo
descontnuo-alimentado

foi

de

2,33

g/L,

implicando

num

aumento

considervel da concentrao de biomassa resultante graas reduo de


provveis efeitos inibitrios que estariam presentes durante o cultivo
descontnuo.

necessrio observar-se que este tipo de fermentao

necessita de uma anlise prvia do microrganismo, do que necessrio


para o seu crescimento e conhecer-se sua fisiologia com a produtividade.
Tambm necessrio conhecer-se a tcnica de operao para o incio,
definio e desenvolvimento do processo.
O substrato , particularmente, um importante parmetro para se controlar
este tipo de fermentao devido ao fato de estar, eventualmente, associado
inibio do crescimento e ao aumento da eficincia do fluxo de carbono,
pela reduo da quantidade de produtos derivados formados e a quantidade
de dixido de carbono envolvido. Um exemplo de controle de concentrao

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de glicose encontrado na produo descontnuo-alimentada de levedura


de panificao (AIBA & NAGAI, 1976).
Segundo KAPAT et al (1998), a alimentao com galactose aps o meio
fermentado se mostrar exaurido de glicose mostrou-se a mais eficiente
estratgia de produo de Glicose-Oxidase atravs do cultivo de
Saccharomyces

cerevisiae

recombinante

em

processo

descontnuo

alimentado.
Nutrientes como metanol, etanol, cido actico e compostos aromticos
inibem o crescimento celular, mesmo em concentraes baixas, porm,
sabe-se que qualquer nutriente pode se tornar inibitrio, mesmo que
somente em concentraes muito elevadas e esse efeito inibitrio
efetivamente reduzido pelo uso do processo descontnuo alimentado,
atravs do controle das concentraes destes nutrientes (BORZANI et al.,
2001). Outro grande problema minimizado seria o da formao de produtos
metablicos txicos, que crtica em processos onde exista a necessidade
de se trabalhar com altas densidades celulares, como no caso de
fermentaes de microrganismos modificados geneticamente, onde a
concentrao celular elevada implica num aumento significativo na
produo, j que o crescimento celular em microrganismos modificados
geneticamente sempre bem menor do que o microrganismo selvagem.
Problemas de transferncia de oxignio so acentuados em fermentaes
em alta concentrao celular, de forma que a velocidade de crescimento
celular passa a ser fator determinante para a eficincia do processo, de
forma que se mantenha a mesma em nveis desejveis e tenhamos, com
isso, a diminuio na produo de produtos txicos, possibilitando que se
consiga altas concentraes celulares e, tambm, aumento na quantidade
de produto formado. No processo descontnuo alimentado no existem
problemas comuns ao processo contnuo, como os problemas de mutao,
contaminao e instabilidade do plasmdeo, de forma que o processo
descontnuo alimentado se torna muitas vezes o mais vivel para a produo
de produtos recombinantes (YOON & KANG, 1994).

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O processo descontnuo alimentado pode ser controlado no somente


pela concentrao de nutrientes no meio, mas tambm, pela variao do pH
durante a alimentao como na produo de Glicose-Oxidase (GOD) atravs
do cultivo de Saccharomyces cerevisiae recombinante (KAPAT et al., 1998).
Neste procedimento, a alimentao com galactose foi automaticamente
controlada pela variao do pH durante o cultivo de forma que seu valor no
ultrapassasse a faixa entre 5,45 e 5,55. O sistema de controle do pH
possibilitou um aumento na secreo extracelular da enzima e uma reduo
na produo de etanol, aumentando a produo de GOD.
Outra maneira de se controlar um processo fermentativo atravs da
medida on-line da concentrao de etanol, uma vez que sua produo
durante o cultivo uma das maiores razes para uma queda na
produtividade celular e do produto de interesse (WIN et al., 1995).
Para que um microrganismo tenha sua sobrevivncia garantida no meio
ambiente, ele tem que, necessariamente, ser eficiente, no desperdiando
energia. Para isso, o microrganismo possui mecanismos regulatrios no seu
metabolismo para evitar a formao de algum metablito em excesso. Uma
forma de se evitar ou contornar essa regulao atravs da utilizao de
cultivos descontnuo-alimentados. Como exemplo temos a utilizao desse
processo para contornar o efeito da represso catablica, comum quando
utilizamos Glicose como fonte de carbono. A Glicose rapidamente
metabolizvel e acaba inibindo a expresso de genes que codificam enzimas
relacionadas ao metabolismo de outras fontes de carbono. Uma maneira de
se evitar esse efeito atravs do cultivo em batelada alimentada onde se
consegue manter a concentrao de glicose no meio baixa, restringindo,
com isso, o crescimento celular e desreprimindo a biossntese de enzimas.
Segundo BORZANI (1996), todos os acares fermentveis disponveis
na dorna so completamente metabolizados uma hora aps o trmino da
fase de alimentao de um processo descontnuo-alimentado de produo
de etanol eficiente.
Outro efeito da regulao catablica que pode ser controlado pelo uso de
cultivo em batelada alimentada o que se chama de induo. A induo , ou

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desrepresso, ocorre quando na presena de algum substrato, os genes que


induzem formao de algum bioproduto (ex: enzimas) so desreprimidos,
liberando a sntese dessa enzima. Por exemplo, em processos onde o
produto obtido seja uma protena recombinante, a induo de proteases se
d quando ocorre a diminuio da concentrao de nitrognio no meio. Esta
teoria foi comprovada por YOON et al. (1994), que adicionaram extrato de
levedura como fonte de nitrognio orgnica, e evitaram a induo
(desrepresso) dos genes que induzem formao de proteases. A
formao de proteases degradaria a protena recombinante obtida no cultivo.
O processo descontnuo alimentado tambm utilizado para o estudo da
cintica de processos fermentativos, pois, possibilita a manuteno de
baixos nveis de substrato por um longo perodo de tempo, concentrao
celular constante e controlar a velocidade de crescimento em condies
transientes. Com isso, possvel estimar de forma mais favorvel os
parmetros cinticos e se obter a mxima velocidade.
A fermentao alcolica pode ser realizada em processo descontnuo,
descontnuo alimentado ou contnuo, mas, no Brasil o processo descontnuoalimentado com reciclo de clulas um dos mais empregados. A grande
vantagem e principal justificativa para seu emprego esto na possibilidade
de controlar-se a velocidade de alimentao de meio, diminuindo com isso a
inibio, causada pelas elevadas concentraes de substrato e/ou de
produto, no metabolismo celular. Vrios trabalhos mostraram um aumento
na produtividade em etanol entre 10 e 14% ao alimentarem o substrato
atravs de sistemas de adio linear decrescente (KRAUTER et al., 1987)
ou exponencial

decrescente (ECHEGARAY et al., 2000) quando

comparados com cultivos em processo descontnuo.


3.2.Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae destaca-se como a espcie mais explorada
comercialmente entre as leveduras e apresenta grande emprego em nosso
pas, notadamente, na indstria de produo de etanol.

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As leveduras e, em particular, a Saccharomyces cerevisiae, so


microrganismos aos quais ns temos algumas das mais antigas referncias
bibliogrficas. J em EXODUS 12 e 13 existem citaes sobre leveduras
(FLORES et al., 2000).
Desde a Antiguidade, Saccharomyces cerevisiae vem sendo utilizada em
processos fermentativos diversos, como na panificao, cervejaria e
fabricao de vinho e, seu uso foi possvel desde ento, devido sua
capacidade de converter rapidamente acares em etanol, cidos orgnicos
e gs carbnico (WARD, 1991).
A produo de etanol pela fermentao do caldo de cana e melao tem
dado uma grande contribuio para o programa energtico brasileiro.
O uso de Saccharomyces cerevisiae como uma fonte na obteno de
enzimas mostra-se uma alternativa vivel e bem prtica devido grande
manipulao desta cepa em plantas industriais (SILVA et al., 2001).
A primeira pesquisa voltada ao estudo das leveduras foi realizada por
Antonie van Leewhoek, que as observou primeiramente em cervejas e
vinhos. Foi somente em 1876, atravs de Pasteur, que se conseguiu
comprovar que as fermentaes do vinho e da cerveja eram causadas pelas
leveduras. A partir de ento, as leveduras e ,em particular, Saccharomyces
cerevisiae passaram a ser os microrganismos favoritos para os estudos de
biologia celular bsica, o que a tornou um ponto central na evoluo da
microbiologia, bioqumica e gentica. Existem diversas razes para isso,
como a facilidade de seu isolamento e manuteno, pouca exigncia
nutricional, bom crescimento em meios constitudos por resduos industriais,
amplo uso em processos industriais e sua reconhecida capacidade de
produzir enzimas extracitoplasmticas.
Segundo ENTIAN (1997), a Saccharomyces cerevisiae tornou-se um
microrganismo modelo em gentica e biologia molecular, culminando com o
seu completo sequenciamento.
Saccharomyces cerevisiae uma levedura ascomictica e anaerbia
facultativa. Uma levedura tpica, consta de clulas pequenas, ovais e
apresenta uma reproduo vegetativa por brotamento. O ciclo de vida de

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leveduras do tipo Saccharomyces cerevisiae inclui duas fases: haplide e


diplide. Quando clulas diplides so colocadas em um meio de
esporulao, o crescimento vegetativo se encerra e as clulas comeam a
formar esporos de forma que cada clula diplide forme um asco,
geralmente, com quatro esporos (BYERS,1981).
A levedura uma fonte biolgica para a obteno de produtos de interesse
na indstria farmacutica e de alimentos, como as enzimas invertase,
hexoquinase, glicose-6-fosfato desidrogenase, glicose-oxidase, proteases e
outras, alm da possvel utilizao de sua prpria biomassa como fonte de
protenas na alimentao animal e humana (PESSOA -JNIOR et al., 1996;
SILVA, 1998).
A

Saccharomyces

atividade

da

cerevisiae

enzima

G6PDH

adquirida
muito

comercialmente

similar

quando

apresenta

comparado

Saccharomyces cerevisiae produzido por fermentao sob condies


controladas.

Entretanto,

Saccharomyces

cerevisiae

modificada

geneticamente produziu atividade enzimtica de ,aproximadamente, 100


vezes mais que a cepa selvagem e mostrou ser o mais efetivo procedimento
para a obteno de G6PDH, alm de justificar o uso de tcnicas de biologia
molecular para a produo dessa enzima pela Saccharomyces cerevisiae
(LOJUDICE et al., 2001).
Vrios so os fatores que influenciam o cultivo de Saccharomyces
cerevisiae. O crescimento celular depende de fatores como temperatura, pH,
componentes do meio de cultura e disponibilidade de oxignio para a clula
(SILVA et al., 2001).
3.2.1.Influncia da Temperatura
Sendo as leveduras microrganismos mesfilos, em geral, as temperaturas
timas para sua utilizao em processos industriais iro se situar na faixa
entre 25 e 35o C. Para a produo de etanol, a temperatura tima obtida foi
de 30o C (WIN et al., 1995), porm, encontram-se trabalhos em que a
temperatura utilizada foi de 32o C (ECHEGARAY et al., 2000; BORZANI,
1996) ou at mesmo de 28o C (PAALME et al., 1997) o que refora a idia

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da existncia de uma faixa tima de temperatura em que se possa trabalhar


sem que a modificao no valor de temperatura dentro dessa faixa implique
em grandes perdas de produtividade. Porm, estudos feitos por FIESCHKO
& HUMPHREY (1983) mostraram que entre 23o C e 33o C o coeficiente de
manuteno de bactrias se manteve constante, porm, com o aumento da
temperatura de 33o C para 35o C, houve uma sensvel alterao no
coeficiente de manuteno celular, mesmo no tendo ocorrido grande
variao no fator de converso de substrato em clula. Isto implica que,
possivelmente, o aumento da temperatura de forma que esta saia da faixa
tima resulta em alteraes no metabolismo basal da clula.
Para a produo de cerveja podemos ter uma temperatura tima em torno
de 26o C (LIMA, 1975), enquanto que para a obteno de Glicose-Oxidase,
este valor ficou em torno de 30o (KAPAT et al., 1998) e para a obteno de
Hexoquinase a temperatura tima variou entre 35 e 40O C (ABRAHONETO et al., 1996).
Uma explicao para essa faixa de temperatura est no fato de que em
temperaturas elevadas ocorre inibio da sntese de cidos graxos e
esteris (STARR, 1962).
3.2.2.Influncia do pH
O pH , sem dvida, uma importante varivel a ser considerada em um
cultivo de microrganismos pois cada cepa utilizada ter um valor timo de
pH na qual dever ser cultivada. Uma mudana no valor intracelular do pH
seria indesejvel e por isto que os microrganismos tem uma eficiente
capacidade tamponante intracelular, capaz de manter o valor de pH sempre
timo.

Portanto,

pH

utilizado

afeta

apenas

as

enzimas

extracitoplasmticas, como a invertase, alm de promover alteraes na


estrutura da membrana celular. (ABRAHO-NETO et al., 1996; DE MORAIS,
1984).
O pH considerado timo para a produo da enzima hexoquinase foi de
4,0 e a justificativa para este valor estaria no acoplamento entre a produo

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de hexoquinase e a atividade da enzima extracelular invertase, diretamente


afetada pela variao no pH extracelular (ABRAHO-NETO et al., 1996).
Segundo SOUZA et al. (2000) e ASENJO (2000), o pH pode alterar as
cargas dos grupos qumicos localizados ao lado das cadeias de protenas
provocando uma modificao na rede de cargas de toda a estrutura da
macromolcula de forma que a enzima tenha sua capacidade cataltica
reduzida ou mesmo perdida.
Sabe-se que em ausncia de meio tamponado, o valor do pH cai
rapidamente durante as primeiras fases de fermentao e este fenmeno
pode ser tido como um reflexo da atividade da levedura, que est
absorvendo aminocidos, acumulando ons, excretando gs carbnico no
meio ou mesmo excretando ons H+ durante a gerao de ATP pela
respirao (extruso de prtons durante o transporte de eltrons pela Cadeia
de Transporte de Eltrons CTE), (DE MORAIS, 1984).
DE MORAIS (1984) comprovou que a acidificao ocorre pela extruso de
prtons para o meio extracelular, assim como, o controle dessa extruso
feito pelo valor do pH no meio externo. Como uma forma de buscar equilbrio
na relao entre a concentrao de prtons extra e intracelularmente, a
clula busca o controle do pH no ambiente extracelular atravs dessa
acidificao, o que prova a importncia do pH extracelular na gerao de
ATP que, por sua vez, est intimamente ligado ao gradiente de prtons
gerados pela diferena de concentrao extra e intracelular dos mesmos.
O pH do meio de cultivo exerce papel significante na atividade da G6PDH.
ABRAHO-NETO et al. (1997), trabalhando a 35o C e 4,0 mg O2 / L,
obtiveram maior atividade para G6PDH com um pH 4,5, sendo que um
acrscimo de 0,5 neste valor promoveu uma queda de 50% da atividade
enzimtica. Por outro lado, a modificao gentica pode alterar o valor timo
deste pH, como comprova ROSSI (2002), onde o pH 5,7 mostrou-se mais
adequado para a produo de G6PDH atravs do cultivo de Saccharomyces
cerevisiae geneticamente modificada.

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3.2.3.Influncia do Meio de Cultura


Devem ser considerados os nutrientes responsveis pelo crescimento
celular. Fontes de carbono e nitrognio so muito importantes no cultivo de
microrganismos. O modo de aplicao e seleo de fontes de carbono um
dos fatores crticos dos processos fermentativos, pois muitos compostos,
especialmente acares, podem causar intensa represso catablica da
sntese de vrias enzimas, alm da reduo na velocidade de crescimento de
determinados microrganismos (LILLY, 1979).
As grandes parcelas de microrganismos crescem bem em meios contendo
amido ou acar, uma fonte usual de nitrognio e sais para suprir a
necessidade de elementos minerais.
Os meios podem ser classificados como naturais ou sintticos. Os meios
naturais so tecidos ou sumo de plantas ou animais em seu estado nativo,
enquanto que os meios sintticos so preparados com acar puro e
compostos orgnicos e inorgnicos quimicamente puros. Nos meios
sintticos, a composio qumica qualitativa e quantitativamente bem
definida.
Os meios naturais so altamente desejados pois permitem se cultivar
microrganismos em meios obtidos a partir de fontes naturais de qualquer
parte do mundo. Tem-se, tambm, que pelo fato do meio ser, basicamente,
composto de extratos naturais, o seu custo largamente inferior ao que se
tem com o cultivo em meio sinttico. Para aumentar a produtividade, se
utilizam meios concentrados, porm, isto pode acarretar um aumento da
presso osmtica e dificuldades de aerao. As matrias-primas perfazem 60
a 80% do preo de custo em uma produo de enzimas por fermentao e,
portanto, a composio do meio deve ser definida com cuidado e trabalhos
de pesquisas so necessrios para que se viabilize a substituio de
compostos caros por outros disponveis em maior quantidade e de preo
mais baixo (GODFREY & WEST, 1986).
STEINBERG (1939)

estudando o tema concluiu que o meio sinttico

exerce um excelente papel na nutrio de microrganismos. Segundo RICCISILVA (1998), a composio do meio de cultivo exerceu grande influncia

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para a produo de hexoquinase (HK) e glicose-6-fosfato-desidrogenase


(G6PDH) em clulas de S. cerevisiae. De acordo com LIMA (1975) qualquer
composto orgnico natural ou mesmo sinttico pode ser utilizado como fonte
de carbono por microrganismos, o que permite versatilidade no estudo e
posterior emprego de diferentes meios de cultura em uma extensa srie de
transformaes teis ao homem. Para obteno do produto desejado, h
necessidade de uma seleo entre essas diversas fontes de carbono. Assim,
podem-se obter melhores condies de processo, e suprir suficientemente
as clulas para biossntese e gerao de energia (WANG et al., 1979).
Portanto, a definio da fonte de carbono e de sua concentrao um dos
fatores crticos do processo fermentativo (LILLY, 1979).
3.2.3.1.Fonte de Carbono
Segundo LUCERO et al. (2001) , Saccharomyces cerevisiae utiliza
preferencialmente acares em relao a qualquer outra fonte de carbono e
esta preferncia facilitada por diversos mecanismos que so controlados
com eficincias diferentes por todos os acares fermentescveis: induo
das protenas que favorecem a fermentao, represso das enzimas da
cadeia respiratria e do ciclo do glioxilato e inativao das enzimas chaves
da gluconeognesis.
A glicose um dos mais importantes primeiros mensageiros em clulas
de leveduras. A adio de glicose ou de um acar rapidamente
fermentescvel s clulas que cresceram em fontes no fermentescveis
(condies de desrepresso) gera sinais metablicos e dispara uma ampla
variedade de fenmenos regulatrios. O sinal produzido interage com o
produto de um gene, regulando sua transcrio por ativao de protenas
repressoras ou pela inibio de protenas ativadoras (GANCEDO,1992).
Segundo descrito por LUCERO et al. (2001), a glicose utilizada
preferencialmente pelas leveduras em relao a qualquer outro acar
presente e isto mostra o seu efeito sobre os mecanismos, que so
controlados especificamente pela glicose, atravs de uma imposio nos
mecanismos de catabolismo dos outros acares, seja pela induo de

Neves, L.C.M

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19

alguns transportadores de acares ou pela represso de transportadores e


enzimas necessrias. Trs transportadores de acares distintos foram
identificados em leveduras sendo que dois deles so especficos para o
transporte de galactose e maltose e um terceiro seria para o transporte de glicosdeos, sendo todos os trs transportadores inativados em presena de
glicose atravs de um sistema que inclui protelises e denominado de
inativao catablica.
A concentrao de glicose no meio exerce uma funo reguladora
importante no metabolismo. Por exemplo, para S. cerevisiae, a glicose no
somente uma fonte de carbono, mas tambm age como um regulador global
do mecanismo de crescimento celular (REIFENBERGER et al.,1997). O
transporte de acar pode ser uma fase limitante do catabolismo durante o
processo

fermentativo

(REIFENBERGER

et

al.,1997;

DOES

&

BISSON,1998). Um estudo de comparao da capacidade de absoro de


glicose entre diferentes leveduras sugere que o seu transporte esteja
relacionado com a habilidade fermentativa especfica de cada microrganismo
(SILVA,1998). Em presena de glicose no meio, a sntese de muitas
enzimas reprimida, particularmente, a envolvida na glicognese, ciclo do
cido tricarboxlico, cido glioxilato e catabolismo de acar fornecido ao
meio, tais como: maltose, sacarose e galactose (ENTIAN et al.,1985).
A fase germinativa da levedura Saccharomyces cerevisiae acumula dois
tipos de depsitos de glicose: o glicognio e a trealose.
O glicognio polissacardeo ramificado de elevado peso molecular.
formado pela juno da cadeia linear (1,4) glicosil com carbonos ligados
na posio (1,6).
A trealose um dissacardeo no reduzido e composto de duas
molculas de glicose ligadas na posio (1,1).
Diversos trabalhos tm ilustrado importantes variaes nos nveis desses
dois estoques de fonte de carbono durante as diversas fases do cultivo do
microrganismo.

Neves, L.C.M

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Segundo FRANOIS & PARROU (2000), possvel s clulas de


Saccharomyces cerevisiae crescer em meio contendo trealose como fonte
de carbono ocorrendo, neste caso, uma extensa fase lag devido induo
do consumo de trealose. Sabe-se, tambm, que o consumo de trealose
favorecido em meios que contenham maltose ou -metilglucosdeo e seu
consumo fortemente inibido em meios contendo glicose, galactose ou
etanol. O consumo de glicognio possvel quando temos amilase,
catalisada por - glicosidases, que produz glicose, ou por uma seqncia de
reaes envolvendo a fosforilao e produo de glicose-1-fosfato ou
glicose.
A glicose atua como um importante mecanismo regulatrio na levedura
Saccharomyces cerevisiae, a qual tem seus nveis de transcrio muito
afetados pela represso pela glicose. O sinal que inicia a represso pela
glicose ainda desconhecido, mas dados indicam que ele est localizado
sobre ou atravs dos nveis de glicose-6-fosfato, o que sugere o
envolvimento da concentrao extra ou intracelular de glicose ou o fluxo de
glicose no incio da represso.
A habilidade da glicose em reprimir a expresso de genes, atravs da
inibio da transcrio, chamada de represso catablica do carbono ou
represso por glicose. Os genes que esto sob o controle da represso por
glicose codificam enzimas que esto envolvidas na gliconeognese, ciclo de
Krebs, respirao, desenvolvimento mitocondrial e na utilizao de outras
fontes de carbono alm de glicose, frutose ou manose.
Apesar de diversas protenas e interaes entre protenas estarem
ligadas represso catablica, os sinais que iniciam a transduo que
promove a represso por glicose no tm sido bem identificados.
Segundo observado por MEIJER et al. (1998), os parmetros que esto
ligados ao caminho que promove a gerao do sinal inicial para a represso
so o aumento na concentrao (intra ou extracelular) de glicose ou o
aumento no fluxo de glicose pela membrana.

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Existem dois sistemas de captao de glicose pela Saccharomyces


cerevisiae, sendo um com baixa e outro com alta afinidade.
O sistema de captao de baixa-afinidade, independe de Hexoquinase
(primeira enzima da Via Glicoltica, responsvel pela formao de 2
molculas de ATP e Piruvato), seria aquele onde ocorre apenas uma difuso
facilitada.
O sistema de captao de alta-afinidade dependente de Hexoquinase,
das condies de cultivo e pode ser reprimido pela glicose. Este sistema de
captao reduzido na presena de elevadas concentraes de glicose e,
portanto, mostra-se mais presente quando as clulas crescem ou so
transferidas para um meio com baixa concentrao de glicose (DOES &
BISSON,1989).
Segundo RONNE (1995), os microrganismos usualmente desativam uma
srie de genes em presena de glicose e a represso por glicose durante a
Gliconeognesis envolve mais de um mecanismo, sendo o principal, a
represso promovida pelo gene MIG1.
O controle da respirao tambm pode ser promovido pelo efeito de
represso catablica sobre a expresso dos genes promotores da Via
Respiratria. A represso catablica indiretamente mediada atravs do
controle do gene HAP4, o qual reprimido pela Glicose.
A regulao da Glicose ainda pode envolver o controle da degradao do
RNAm, o qual contribui de forma significativa para a regulao da Glicose de
alguns RNAs mensageiros manifestados durante a respirao.
POSTMA et al. (1988) afirmaram que Saccharomyces cerevisiae pode
fermentar glicose ou etanol sobre condies anaerbias, onde estas so as
nicas fontes possveis de energia. J sobre condies aerbias, ocorre
preferencialmente a respirao podendo, no entanto, ocorrer fermentao
alcolica mesmo diante da presena de oxignio (aerobiose). Originalmente,
este desvio no metabolismo para a via fermentativa em condies aerbias
promovido pela represso por glicose, pois, diante da presena de elevadas
concentraes residuais de Glicose ocorreu uma diminuio progressiva na
velocidade especfica de consumo de O2 (QO2), acompanhado pela

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degradao dos componentes da Via Respiratria e represso das diversas


enzimas que atuam no Ciclo dos cidos Tricarboxlicos.
PRONK et al. (1996) define Efeito Crabtree como a fermentao alcolica
sob condies aerbias e descrito como sendo um dos fenmenos
metablicos mais importantes presentes em processos industriais de
Saccharomyces cerevisiae, especialmente os ligados produo de
biomassa.
Segundo HULL (1991), uma levedura pode ser considerada Crabtree
positiva se esta sofrer uma represso de seu metabolismo oxidativo em altas
concentraes de glicose presente no meio de cultivo.
Nesta situao temos um acmulo de biomolculas em sua forma
reduzida, especialmente o NADH gerado pela Via Glicoltica, uma vez que a
produo de NADH ser maior que a capacidade que a clula tem de
reoxid-la atravs da doao de eltrons para o O2 presente no meio, e que
constitui o aceptor final de eltrons neste caso. Com isso, a clula passa a
reoxidar o NADH atravs da reao de converso do Piruvato em Etanol.
O Efeito Pasteur tambm pode ser identificado em clulas de
Saccharomyces cerevisiae, porm, ir ocorrer somente em condies onde
o fluxo metablico da Via Glicoltica estiver bem reduzido (baixssimo
crescimento celular). caracterizado por uma supresso da capacidade
fermentativa da levedura na presena de oxignio e promove um aumento
da afinidade pelo sistema respiratrio por Piruvato, Acetaldedo e NADH em
relao Via Fermentativa (PRONK et al., 1996).
3.2.3.2. Fonte de Nitrognio
A ausncia ou limitao de fontes de nitrognio o principal fator de
influncia na inativao dos transportadores de acares devido a diversos
fatores que terminam por estimular a degradao de protenas. Ou seja, a
inativao catablica no deve ser promovida especificamente pelos
mecanismos de controle de glicose, mas pela estimulao ao mecanismo
regulador das protenas principais ligados deficincia em nitrognio. Sendo

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assim, pode-se afirmar que a presena de uma fonte de nitrognio deve


diminuir a inativao.
LUCERO et al. (2001) verificaram que em diversos casos estudados a
velocidade de inativao dos transportadores foram menores na presena
do que na ausncia de uma fonte de nitrognio. Ainda foi verificado que o
tempo de meia-vida aumenta quando existe fonte de nitrognio presente
mas o mesmo no acontece quando da presena de aminocidos no meio.
Os ons NH4+ ,presentes quando da utilizao de sulfato de amnio como
fonte de nitrognio, so considerados txicos para as clulas diante de
elevadas concentraes. Ele pode ser assimilado primeiro nos aminocidos
e depois em outras biomolculas que contm nitrognio. O ponto crtico de
entrada destes ons est ligado a dois aminocidos (Glutamato e Glutamina),
pois o grupo amino presente nos outros aminocidos geralmente derivado
do grupo amino do glutamato atravs de reaes de transaminao.
Portanto, o NH4+ assimilado pela clula atravs de uma reao de
biossntese envolvendo o glutamato e catalisada pela enzima glutamina
sintetase, que apresenta alta afinidade por NH4+. O Glutamato, por sua vez,
gerado pela reao entre -cetoglutarato e glutamina na presena de
NADPH e H+, sendo esta reao catalisada pela enzima glutamato sintase
(LEHNINGER et al., 1995).
O efeito de represso ocasionado por excesso de molculas de amnia
no meio conhecido como Efeito Amnia e foi observado com a variao
da atividade da NAD-Glutamato Desidrogenase. A maior atividade foi
observada em meios limitados em molculas de amnia.
LANG et al. (1997) verificaram que a quantidade da fonte de nitrognio
alimentada durante o cultivo interfere na produo da protena de interesse,
bem como a relao carbono-nitrognio imposta no meio de cultivo, devido
ao aumento no nmero de ons amnio e seu efeito indesejvel sobre o
metabolismo celular.
RICCI-SILVA (1998) verificou que alm das tradicionais fontes de
nitrognio, h tambm alguns aminocidos que quando adicionados ao meio

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de cultivo podem aumentar a produo de enzimas como a Hexoquinase e a


Glicose-6-Fosfato Desidrogenase.
LANG et al. (1997) utilizaram diversas fontes de aminocidos (casena,
peptona e extrato de levedura) para enriquecer o meio e observaram que em
todos os casos testados houve um aumento na produo da protena
heterloga de interesse.
As leveduras podem ter uma alterao no comportamento gerada por
desvios metablicos, que por sua vez, so promovidos por efeitos como o
Crabtree e o Pasteur. Estes mecanismos esto diretamente ligados ao
balano entre a capacidade fermentativa e respiratria da levedura.
3.2.4. Influncia da Agitao e Aerao
O estudo da agitao e aerao em processos fermentativos tambm
essencial para o desenvolvimento das melhores condies de crescimento do
microrganismo considerado. Diversos autores afirmam que os objetivos
principais das condies de agitao e aerao so a disperso das bolhas
de ar, com conseqente suprimento de oxignio aos microrganismos, a
manuteno das clulas em suspenso e o aumento da transferncia de
calor e massa no meio (AIBA et al., 1973; WANG et al., 1979; LEE, 1992).
Para microrganismos facultativos, como S. cerevisiae, o oxignio tem
crucial importncia em todo metabolismo porque ele participa da gerao de
energia atravs da cadeia de respirao dentro da mitocndria, que
fundamental para obteno de uma velocidade de crescimento especfico
significante (SILVA et al., 2001).
Mostra-se

de

fundamental

importncia

abordar

problema

da

transferncia de oxignio em processos fermentativos aerbios, que nada


mais que a dissoluo de oxignio no meio de cultura para que o
microrganismo possa exercer atividades.
Do ponto de vista bioqumico, o oxignio o ltimo elemento a aceitar
eltrons, ao final da cadeia respiratria, sendo ento reduzido gua,
permitindo que ocorra a reoxidao das coenzimas que participam das
reaes de desidrogenao (ao longo da Gliclise e Ciclo de Krebs) e, ainda,

Neves, L.C.M

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permitindo a estocagem de energia atravs da passagem das molculas de


ADP para ATP. Estas ltimas, por sua vez, iro participar necessariamente
nas reaes de snteses de molculas, para a sobrevivncia das clulas e
para o surgimento de novas clulas, no processo de proliferao da biomassa
microbiana, para as quais fundamental a introduo de energia. Assim
sendo, um cultivo que seja altamente eficiente, ocorrendo com elevadas
velocidades de crescimento celular, implica em elevadas velocidades de
consumo de substrato, a fim de que haja abundncia de eltrons
transportados na cadeia respiratria

(CTE Cadeia de Transporte de

Eltrons) e, com isso, gerar mais ATP; mas significa tambm, a necessidade
de existncia de oxignio dissolvido, a fim de que estes eltrons sejam
drenados para fora da clula ao final da cadeia.
Para que ocorra a oxidao de um mol de Glicose so necessrios seis
moles de oxignio a serem consumidos, o que torna bvio a necessidade de
se agitar e aerar um meio de cultura no caso de processos fermentativos
aerbios. Por ser muito pouco solvel em meio lquido, podendo atingir
apenas alguns miligramas por litro, em termos de concentrao de saturao,
existe a necessidade de estarmos suprindo a demanda de oxignio durante o
processo fermentativo para que as clulas encontrem a possibilidade de
converterem, de forma adequada, o substrato no produto desejado. Sendo
assim, de nada adianta dissolver centenas de gramas por litro de glicose,
alm das quantidades necessrias dos demais nutrientes, sem se imaginar
que se dever introduzir, ao longo do processo fermentativo, o oxignio
necessrio para suportar a condio de aerobiose, tendo em vista a limitada
capacidade de estocar O2 na soluo. Diante desta situao, pode-se afirmar
que a extenso de um processo descontnuo aerbio e, sua conseqente,
obteno de elevadas concentraes de bioprodutos de interesse, depende
totalmente da capacidade de se transferir oxignio para a fase lquida,
especialmente, nos instantes mais avanados do processo, onde a
concentrao celular deve ser elevada, existindo situaes onde as
condies de operao a serem empregadas sero definidas em funo da
capacidade de transferncia de oxignio. O transporte de oxignio desde a

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bolha de ar at o interior da clula afetado e controlado por uma grande


resistncia a essa transferncia de oxignio e que pode ser subdividida em
diversas resistncias especficas mostradas na Figura 3.1.
FIGURA 3.1.: Diagrama esquemtico dos passos envolvidos no transporte
do oxignio de uma bolha de ar para o interior de uma clula
microbiana (BAILEY, OLLIS,1986).

As resistncias apresentadas na Figura 3.1. podem ser conceituadas da


seguinte forma:
R1 :

Difuso do gs do interior da bolha at a interface gs-lquido

R2 :

Passagem pela interface gs-lquido

R3 :

Difuso atravs da pelcula estagnada de lquido, externa bolha

R4 :

Transporte atravs do meio lquido

R5 :

Difuso atravs da pelcula estagnada externa ao agregado celular

R6 :

Passagem pela interface pelcula estagnada-agregado celular

R7 :

Difuso no agregado celular

R8 :

Passagem pela membrana celular

R9 :

Difuso interna na clula

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Estas resistncias, por sua vez, podem ser agrupadas em trs grandes
grupos de resistncias:
1) Transferncia do oxignio da bolha para a soluo.
2) Transferncia do oxignio dissolvido atravs do meio de cultivo.
3) Utilizao do oxignio pela clula.
Considerando que ocorra simples difuso na transferncia de oxignio
dissolvido pelo meio de cultivo (devido a uma agitao adequada), o segundo
grupo de resistncia pode ser considerado desprezvel, restando somente
duas grandes resistncias interferindo no transporte da molcula de oxignio:
A transferncia da Fase Gasosa para a Fase Lquida e a prpria reao
bioqumica no interior da clula.
A demanda de oxignio no incio do processo fermentativo descontnuo
padro bastante baixa devido baixa concentrao celular. Porm, com o
crescimento celular, esta demanda aumenta com o tempo, tornando
obrigatrio o fornecimento contnuo de oxignio.
Uma clula consome mais oxignio, por unidade de tempo, quanto maior
for a velocidade de crescimento existindo um limite, ou seja, uma velocidade
dita mxima, a qual nada mais do que a capacidade mxima de sntese das
enzimas que participam do processo. Esta velocidade depende das
condies de cultivo (pH, temperatura, etc) e do meio de cultura.
ABRAHO-NETO et al., (1997) estudaram a influncia de vrios fatores
na produo de G6PDH por S. cerevisiae e verificaram que a maior atividade
da enzima ocorria com uma taxa de oxignio dissolvido de 4,0 mg ar.L-1 ,
sendo que a diminuio da atividade enzimtica observada com valores
superiores e inferiores de oxignio dissolvido tiveram como causa a reduzida
taxa de crescimento sob estas concentraes de oxignio. Essa observao
deve-se ao fato da G6PDH participar da via das pentoses, caminho pelo qual
as clulas sintetizam ribose-6-fosfato, um dos constituintes chave dos cidos
nuclicos e nucleotdeos. Dado que a demanda por cidos nuclicos durante
a fase de crescimento mximo acentuada, a atividade especfica da G6PDH
tambm aumenta. Porm, segundo OURA (1976), a contribuio do ciclo das

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pentoses no crescimento aerbio da levedura pequeno destacando-se


apenas sua funo de fornecimento de NADPH reduzido para reaes
biossintticas. Deste modo, poucas mudanas foram observadas por esse
autor na atividade da G6PDH sob diferentes regimes de aerao.
Segundo PINHEIRO et al. (1997), Saccharomyces cerevisiae cresce
melhor quando o oxignio fornecido atravs da alimentao com ar do que
quando a alimentao efetuada com oxignio puro. Oxignio puro
promoveu um aumento na produo de etanol e o crescimento celular foi
inibido tanto pelo aumento da vazo de ar como de oxignio puro.
O O2 passa a ter efeitos txicos nos microrganismos aerbios sob
presses parciais no muito maiores que no ar sobre 1 bar. Esta toxicidade
iniciada pela reduo univalente do O2, qual, conduz a danos s enzimas,
cidos nuclicos ou lipdeos. Sendo assim, temos que um fornecimento
acima do necessrio pela demanda de oxignio pode causar efeitos adversos
nas clulas de leveduras.
OURA et al. (1976) concluram que a atividade de enzimas da Via
Glicoltica, bem como a lcool desidrogenase e a piruvato descarboxilase so
afetadas pela condio de aerao imposta. A atividade da enzima lcool
desidrogenase, por exemplo, cai com o aumento da quantidade de oxignio
contido no gs fornecido, mas ocorre um aumento em sua atividade quando
temos elevadas intensidades de aerao. Para a relao entre a atividade da
enzima G6PDH e a vazo de aerao empregada, temos que poucas
mudanas so observadas na atividade da enzima sobre diferentes
condies de aerao, exceto quando se utilizam vazes que forneam
concentraes txicas de oxignio, onde a atividade enzimtica dobra.
SILVA et al. (2001) verificaram a influncia da agitao e aerao na
produo de Hexoquinase e concluram que as melhores condies de
aerao so as de vazo moderada de ar resultando em coeficiente
volumtrico de transferncia de oxignio (KLa) da ordem de 60 h-1. A enzima
teve sua formao afetada pela utilizao de vazes maiores de oxignio, o
que seria devido saturao da via respiratria pelo oxignio.

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OURA et al. (1974) concluram que a capacidade da levedura seguir um


metabolismo aerbio varia quando o cultivo efetuado sob diferentes
intensidades de aerao e a mxima atividade seguindo a via respiratria foi
observada para os crescimentos com 10% de oxignio no gs de mistura da
aerao.
Segundo SILVA et al. (2002), as melhores condies de aerao para a
produo da enzima G6PDH so obtidas diante de aeraes moderadas (1,7
vvm e 400 rpm), gerando um KL.a igual a 60 h-1. Os resultados indicaram,
tambm, que a produo desta enzima pelo microrganismo est ligada
formao de biomassa, ou seja, ao crescimento celular, que por sua vez,
definido pelas condies operacionais e do meio de cultivo.
3.2.5. Metabolismo da levedura S. cerevisiae
Segundo FLORES et al. (2000), acares so utilizados por quase todas
as leveduras conhecidas e todas tm em comum no seu metabolismo a
converso da Glicose-6-Fosfato (ou Frutose-6-Fosfato) em Piruvato atravs
de uma Via Glicoltica comum. O destino metablico do Piruvato que ser
diferenciado de acordo com a espcie de levedura e as condies de cultivo.
No caso especfico de Saccharomyces cerevisiae, a glicose e outros
acares podem causar um forte prejuzo capacidade respiratria (Efeito
Crabtree) de forma que, mesmo em presena de ar, Saccharomyces
cerevisiae fermenta em cultivos descontnuos. Desta forma temos uma
levedura Crabtree positiva. Entretanto, na maioria dos casos em condies
aerbias, o Piruvato oxidado para CO2 atravs do Ciclo dos cidos
Tricarboxlicos (TCA).
Sendo assim, temos que a Gliclise e o Ciclo dos cidos Tricarboxlicos
so as principais vias metablicas para a Saccharomyces cerevisiae e so
responsveis diretos pela produo de energia e reduo dos equivalentes
na forma de ATP, NADH e NADPH, alm da gerao de grande parte dos
compostos precursores necessrios biossntese de biomolculas.
As membranas celulares no so livremente permeveis a todos os
componentes que possam estar presentes no meio. O primeiro passo no

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30

metabolismo das hexoses o transporte de carboidratos, exceto nos casos


onde um di ou trissacardeo hidrolisado fora da clula. Este transporte
atravs da membrana conduzido por transportadores especficos
chamados permeases e para a Saccharomyces cerevisiae este transporte
consiste de uma difuso facilitada no caso de meios contendo glicose,
frutose ou manose.
O metabolismo de dissacardeos precedido pela hidrlise para outros
monmeros e dependendo da espcie de levedura e da natureza do acar
a ser metabolizado, esta hidrlise acontece fora da membrana celular, no
espao periplasmtico, ou dentro da clula atravs do transporte deste
dissacardeo. No caso de Saccharomyces cerevisiae esta hidrlise feita
em sua maior parte pela invertase extracelular repressvel pela glicose.
A hexose intracelular entra na Via Glicoltica aps uma etapa inicial de
fosforilao, onde duas hexoquinases so responsveis pela fosforilao da
glicose, frutose e manose enquanto que uma glicoquinase responsvel
pela fosforilao de glicose e manose, que so obtidos a partir da
transcrio

dos

genes

HXK1

HXK2

(Hexoquinases)

GLK1

(Glucoquinase), cuja expresso controlada pela concentrao de glicose.


As hexoquinases tambm so reprimidas pela presena de Trealose-6Fosfato, o que a transforma em uma importante ferramenta de controle da
gliclise em Saccharomyces cerevisiae. A Fosfofrutoquinase considerada
o gargalo da Via Glicoltica, pois, a superproduo de genes que codificam
a fosfofrutoquinase no aumenta a fermentao em Saccharomyces
cerevisiae.
A oxidao do Piruvato, aps a etapa final da Via Glicoltica, para CO2
ocorre atravs do Ciclo de Krebs, onde para entrar no ciclo, o Piruvato sofre
uma descarboxilao oxidativa catalisada pela Piruvato Desidrogenase, um
complexo

multienzimtico

formado

por

trs

componentes

(Piruvato

Desidrogenase, Di-hidrolipoamidoacetil transferase e di-hidrolipoamido


Desidrogenase).
As reaes catablicas geradoras de NADH ocorrem tanto no citosol como
na mitocndria e, durante a fermentao, o NADH produzido pela Via

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31

Glicoltica regenerado a NAD+ atravs da formao de Etanol enquanto


que o NADH formado por outras reaes diferentes das da Via Glicoltica
so regenerados atravs da produo de Glicerol.
Durante o crescimento em aerobiose, as enzimas NADH Desidrogenases
mitocondriais tambm participam da reoxidao em NAD+. A reoxidao do
NADH pela via respiratria a principal fonte de energia para as clulas com
um metabolismo respiratrio. Esta reoxidao est acoplada pela produo
de ATP no processo conhecido como Fosforilao Oxidativa.
A Via das Pentoses constitui uma importante rota implicada na produo
de NADPH necessrio s reaes de biossntese e de Ribose-5-Fosfato
para a sntese de cidos nuclicos e cofatores nucleotdeos. Esta Via
tambm gera Eritrose-4-Fosfato, presente como precursor na sntese de
aminocidos aromticos. A Via tem incio com duas reaes oxidativas
irreversveis e uma outra reversvel e no-oxidativa. A diviso entre a Via
Glicoltica e a Via das Pentoses ocorre no nvel da Glicose-6-Fosfato e a
concentrao da fonte de nitrognio no meio influencia na quantidade de
acar a ser direcionado a cada uma dessas Vias, sendo que, a presena de
aminocidos promove a queda na atividade da Via das Pentoses,
direcionando maior parcela dos acares para a Via Glicoltica.
Em Saccharomyces cerevisiae existem quatro genes que codificam
isoenzimas de lcool-desidrogenases, sendo que o gene ADH1 codifica a
isoenzima durante a fermentao e induzida pela glicose enquanto que o
gene ADH2 codifica a isoenzima que est ligada utilizao do etanol como
fonte de carbono, sendo esta, repressvel pela presena de glicose.
Segundo PRONK et al. (1996), nas leveduras o Piruvato um ponto
fundamental entre a dissimilao respiratria e a fermentao alcolica. A
etapa mais lenta da Via Glicoltica est ligada converso de triosesfosfatos em Piruvato. Durante o crescimento fermentativo, o Piruvato pode
ser convertido em diversos compostos, inclusive molculas de hidrognio,
CO2 e alguns metablitos orgnicos, enquanto que durante a respirao
celular, o Piruvato segue para o Ciclo dos cidos Tricarboxlicos, onde
ocorre sua completa oxidao para CO2 e H2O. Quando a clula segue um

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32

metabolismo fermentativo, os principais metablitos excretados por ela sero


o Etanol e o CO2, sendo que o Glicerol tambm pode ser encontrado, porm,
no como um produto obtido primariamente pela oxidao do acar e sim
devido a reoxidao do NADH gerado pela Via Glicoltica. Como durante o
metabolismo respiratrio, o NADH reoxidado por enzimas especficas na
mitocndria, no caso de limitao ou ausncia de oxignio, esta reoxidao
ser efetuada atravs da formao de Glicerol, funcionando, portanto, como
uma vlvula redox.
JIN et al. (1997)

avaliaram os fluxos metablicos obtidos durante a

produo de uma protena heterloga em Saccharomyces cerevisiae e


identificaram um aumento na atividade da Via das Pentoses quando de um
aumento na produo da protena heterloga e resultando tambm em um
aumento no fator de converso em ATP.
A fonte de carbono teve sua utilizao ampliada durante a fase
exponencial de crescimento da ordem de 2 e 5 vezes quando comparada,
respectivamente, com o final da fase exponencial e a fase estacionria em
presena de meio mnimo de Galactose e em cultivos descontnuos.
3.3.Enzimas
As enzimas tornaram-se importantes ferramentas prticas no s na rea
mdica, mas tambm, para a indstria qumica, no processamento de
alimentos, na agricultura e na indstria farmacutica.
Devido a essa grande expanso no uso de enzimas, nos ltimos anos
vem crescendo ainda mais o interesse na produo das mesmas. Existem
muitas aplicaes comerciais para as enzimas, entre elas a Pectinase
utilizada durante a fabricao de sucos de frutas (SANTHANAM, 1992); a
Invertase utilizada para a obteno de acar invertido (DURANTI, 1991;
KOO et al., 1998); a Xilose-redutase utilizada na produo de xilitol por
processo enzimtico (SILVA et al., 1996); a Xilanase e seu potencial de
aplicao na etapa de branqueamento na indstria de papel e celulose
(VIKARI,1991); a Hexoquinase e a Glicose-6-Fosfato Desidrogenase e suas

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aplicaes em mtodos analticos para se medir teores de glicose, frutose,


manose, ATP e creatinoquinase (ABRAHO-NETO et al., 1996; RICCISILVA, 1998; SILVA, 2000); e a Glicose-Oxidase e seu potencial de
aplicao para a obteno de cido glicnico (KAPAT et al., 1998).
A diversidade de reas de potencial de aplicao de enzimas torna
necessria a realizao de estudos que desenvolvam processos de
obteno e purificao eficientes e passveis de ampliao de escala, de
forma a tornarem-se viveis comercialmente.
O emprego de microrganismos recombinantes vem de encontro
expectativa de aumento na disponibilidade de enzimas, como a glicose-6fosfato desidrogenase, j utilizadas ou que passariam a estar disponveis com
a aplicao destas novas tcnicas de modificao gentica. A reduo de
custos de produo, tambm uma perspectiva real (BUCKLAND and
LILLY,1993).
A pesquisa sobre enzimas est ligada maior parte da histria da
bioqumica, sendo, sua atividade cataltica, descrita desde o sculo XIX,
quando tiveram incio os estudos sobre a digesto da carne por secrees
do estmago e a converso do amido em acares simples pela saliva e por
diversos extratos vegetais (LEHNINGER et al., 1998). O estudo das enzimas
apresenta grande importncia prtica, uma vez que, diversas doenas so
ocasionadas pela deficincia funcional ou mesmo pela ausncia de uma ou
mais enzimas em um indivduo. Condies anormais podem ocorrer tambm
pelo excesso da atividade de uma enzima at por serem, as enzimas, as
principais ferramentas de regulao do metabolismo.
Os microrganismos so capazes de alterar seu metabolismo em resposta
s mudanas no meio. Esta alterao obtida por mecanismos regulatrios
capazes de conferir flexibilidade ao metabolismo. Os principais mecanismos
regulatrios esto ligados sntese das enzimas, bem como, regulao
dos seus nveis de atividade (WARD, 1991).
As enzimas so protenas, constitudas por uma ou

mais cadeias

polipeptdicas, e que so capazes de catalisar de forma especfica uma dada


reao bioqumica. As enzimas apresentam quatro caractersticas principais:

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Reduzem a Ea (Energia de Ativao), levando a altas velocidades de


reao.

Apresentam elevada especificidade, ou seja, cada enzima tem uma


estrutura que permite a ela se encaixar perfeitamente a apenas um
determinado substrato de forma a promover a catlise.

So sintetizados pela prpria clula.

Tem concentrao e atividades modulveis, ou seja, podem ser


reguladas, permitindo um ajuste em diferentes condies fisiolgicas.

As enzimas so catalisadores, ou seja, aceleram a velocidade de uma


reao sem serem consumidos durante o processo. O uso crescente desses
catalisadores em aplicaes industriais deve-se em muito a essas
caractersticas especficas, bem como aos avanos das pesquisas em
gentica e na otimizao de processos fermentativos para a produo de
enzimas. Cada enzima apresenta um substrato especfico, ou seja, s ir se
ligar a um determinado reagente, de forma que sua estrutura fique tensionada
e amoldada para que se aproxime da estrutura caracterstica do estado de
transio da reao. Esse amoldamento faz com que o substrato fique mais
prximo dos grupos radicais R, no stio ativo da enzima, e que so os
responsveis pela catlise.
Cada enzima possui em sua estrutura quaternria uma regio definida por
stio ativo onde feita a ligao com o substrato. Trata-se de uma regio
pequena e bem definida formada por resduos de aminocidos que foram
trazidos mais prximos uns dos outros pelos desdobramentos da cadeia
polipeptdica que compe a estrutura terciria da enzima. atravs do stio
ativo que a enzima consegue reconhecer o seu substrato uma vez que, por
se tratar de uma cavidade com forma definida, necessrio que o substrato
tenha forma espacial adequada para alojar-se no centro ativo, alm de
grupos qumicos capazes de estabelecer ligaes precisas com os radicais
do centro ativo.

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Segundo VITOLO & ROCHA-FILHO (1998), a utilizao de enzimas em


escala industrial de fundamental importncia, devendo ser analisada, no
entanto, a relao custo/benefcio. Com relao aplicao na indstria, as
enzimas podem ser classificadas em trs grupos:

Enzimas utilizadas na produo de alimentos e ingredientes


alimentcios.

Enzimas utilizadas na produo de bebidas.

Enzimas utilizadas na produo de bens variados, como os


reagentes analticos.

A estabilidade de uma enzima afetada por duas condies do meio:


temperatura e pH. O aumento da temperatura favorece a velocidade de uma
reao, pois, proporciona uma maior energia cintica e ocasionando um
aumento no nmero de choques entre as molculas (enzima e substrato) por
unidade de tempo. Tem-se, porm, que o excesso dessa energia cintica
pode romper as estruturas tercirias e quaternrias de forma que a enzima
acaba perdendo sua atividade cataltica. (SEGEL,1979).
Segundo HALL (1996), a quantidade de calor necessrio para desnaturar
uma enzima varia de acordo com a molcula e este fenmeno depende
tambm do pH e da fora inica do meio.
O pH tambm afeta a estabilidade das enzimas de forma que estas
apresentam um valor ou uma regio de pH timo onde sua atividade ser
mxima. Isto ocorre porque as cadeias laterais de alguns aminocidos agem
como cidos ou bases fracos e realizam funes crticas no stio ativo da
enzima e esta variao no estado de ionizao uma das razes da variao
na atividade. A

mudana no pH pode eliminar uma interao inica

essencial, atravs da remoo de prtons de grupos residuais de


aminocidos, de forma a afetar a estabilidade da conformao ativa da
enzima (LEHNINGER et al., 1995).
Segundo HALL (1996), as enzimas quando submetidas a valores
extremos de pH, tanto cidos como bsicos, podem desnaturar, expondo com
isso grupamentos hidrofbicos. Esta desnaturao devido queda nas

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interaes eletrostticas e, em muitos casos, pode ocorrer inclusive uma


precipitao dessa molcula.
3.3.1. Glicose-6-Fosfato Desidrogenase
A glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PDH) a primeira enzima do
processo oxidativo da via pentose-fosfato, convertendo a Glicose-6-Fosfato
em

6-Fosfogliconato

classificada

bioquimicamente

como

uma

oxidorredutase.
A

G6PDH

vem

sendo

extensivamente

purificada

obtida,

principalmente, por leveduras, E. coli e tecidos animais. A coenzima


especfica para a reao catalisada por essa enzima o NADP+, podendo, no
caso de outros microrganismos (Leuconostoc mesenteroides, Acetobacter
suboxydans

Pseudomonas

aeruginosa)

apresentar

dois

cofatores

especficos (NAD+ e NADP+).


A G6PDH obtida a partir de Leuconostoc mesenteroides apresenta massa
molar de 104kDa e composta por dois monmeros de 55kDa. O pH timo
igual a 7,8, ponto isoeltrico em torno do pH 4,6 e coeficiente de extino
igual a 11,5 (pH 7,2). Os principais ativadores desta enzima seriam o Mg2+ e
HCO3- e os principais inibidores da sua atividade enzimtica seriam o
Piridioxal 5 Fosfato, que promove uma inibio competitiva com o
substrato (G6P) e no-competitiva com o NADP+. O on Al3+ tambm pode
ser considerado um inibidor e, esta caracterstica, devida a seus efeitos
sobre mudanas conformacionais induzidas por este on. No caso de
leveduras, sabe-se que a massa molar de uma sub unidade da enzima
equivale a 56kDa e que ela ser altamente especfica a NADP+.
O NADPH formado pela reao catalisada pela G6PDH utilizado em
diversos processos da biossntese como, por exemplo, na formao dos
cidos graxos (REILLY & ALLRED, 1995). Por formar NADPH durante a
reao catalisada por ela, a G6PDH fundamental para a manuteno
celular, j que ser responsvel diretamente pela regulao da concentrao
deste importante cofator. Por participar da Via das Pentoses, a G6PDH
tambm tem importncia reconhecida devido formao de Ribose-5-

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Fosfato, precursor necessrio na biossntese de DNA e RNA pela clula


(SEVERO,1979).
Segundo DUMITRU et al. (1995), a radiao ultravioleta e o acetato de
cobre so sistemas geradores de radicais livres e, estes radicais, reduzem a
atividade da enzima Glicose-6-Fosfato Desidrogenase em Saccharomyces
cerevisiae. A queda na atividade enzimtica est ligada ao aumento na
concentrao de produtos gerados pela peroxidao de lipdeos e a enzima
parcialmente inativada pela ao dos radicais livres apresenta um aumento
na sensibilidade ao calor de desnaturao quando comparada com a enzima
livre destes radicais.
3.4. Obteno de produtos geneticamente modificados
O desenvolvimento sustentvel tem se tornado uma prioridade na poltica
dos fabricantes mundiais. Entre as diversas tecnologias com potencial para
alcanar a meta da sustentabilidade, a biotecnologia teria um importante
lugar, especialmente nos campos de produo de alimentos, matriasprimas e energia renovveis, preveno da poluio e biorremediao
(ZECHENDORF, 1999).
A E.coli foi o primeiro microrganismo de eleio como hospedeiro para a
formao de bioprodutos a partir do desenvolvimento da tecnologia do DNA
Recombinante e, isto se deu, porque a E.coli apresentava seu sistema
gentico bem caracterizado, o que, por sua vez, facilitava a obteno de
altos nveis de expresso (YIN et al., 2000 ; WARD, 1991).
O primeiro bioproduto recombinante a conseguir liberao para a
produo foi a insulina humana obtida a partir do cultivo de cepas
recombinantes de E.coli (WARD, 1991).
A grande limitao para a obteno destes bioprodutos recombinantes
sempre esteve ligada produo em larga escala, onde manter os mesmos
nveis de produtividade obtidos em escala laboratorial eram quase
impossveis (YING-LIN et al., 2000).

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Uma desvantagem na utilizao de E.coli como um hospedeiro vantajoso


est ligado sua incapacidade de excretar protenas recombinantes e por
estas clulas conterem uma srie de endotoxinas que devero encarecer o
processo posterior de purificao.
Outro microrganismo que pode ser utilizado na obteno de bioprodutos
recombinantes o Bacillus subtilis, por no ser patgeno, poder crescer em
aerobiose, no produzir lipossacardeos e ser capaz de secretar protenas
extracelulares no meio. Uma desvantagem est no fato de terem diminudos
os nveis de expresso dos genes heterlogos neste microrganismo com
relao aos nveis de expresso alcanados pela E.coli.
As leveduras tambm so bastante empregadas, porm, apresentam
nveis de expresso menores que os da E.coli. Saccharomyces cerevisiae
tem sido modificada geneticamente mediante o emprego de tcnicas de
engenharia gentica para a obteno de produtos comerciais como o
antgeno de superfcie do vrus da Hepatite B, entre outras protenas
heterlogas (WARD, 1991; CHUNG et al, 1997).
A Glicose-Oxidase uma enzima que catalisa a oxidao de -D-Glicose
para D-Glucono--Lactona e perxido de hidrognio e encontrada
originalmente em Aspergillus niger. KAPAT et al. (1998) descrevem uma
modificao gentica em S.cerevisiae onde foi construdo um vetor contendo
um promotor GAL10, da prpria S.cerevisiae, uma seqncia de sinal de -amilase e a estrutura do gene da GOD do A .niger, alm do terminal GAL7
da levedura. A modificao gentica possibilitou a produo de GOD pelo
cultivo de S.cerevisiae recombinante em Processo Descontnuo-Alimentado.
Segundo OKENNEDY et al. (1995), a instabilidade de vetores
recombinantes em organismos comercialmente importantes representa um
obstculo significativo para a produo em larga escala de protenas atravs
de elevados nveis de expresso de seus genes heterlogos. Rearranjos
estruturais e instabilidades segregacionais podem resultar na perda do gene
de interesse. A instabilidade segregacional ir ocorrer quando o plasmdeo
no hospedeiro perde a capacidade de se transferir para as clulas-filhas.

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A perda do plasmdeo pode ocorrer pela competio entre as duas subpopulaes presentes (com e sem plasmdeo) e pode ser estimulada pela
menor velocidade de crescimento obtida pelas clulas recombinantes. A
menor velocidade de crescimento gerada pelo aumento da carga
metablica, como um resultado direto da necessidade de replicao do
plasmdeo e da expresso do gene recombinante.
O uso de S.cerevisiae como hospedeiro recombinante apresenta diversas
vantagens sobre outros microrganismos por no ser patognica, no
produzir endotoxinas, por ter sido muito estudada e ter grande aplicao em
processos industriais (KINGSMAN et al, 1987 apud CHUNG et al., 1997).
Segundo LANG et al. (1997), S.cerevisiae um hospedeiro muito atrativo
pois pode excretar protenas recombinantes para o meio sem excretar
conjuntamente protenas homlogas de forma que quase a totalidade das
protenas secretadas ser constituda pela protena de interesse, com isso,
facilitando o processo de purificao e resultando numa significativa reduo
nos custos do processo.
Uma grande variedade de trechos de genes de expresso contendo
promotores constitutivos ou induzidos tem sido definidos e construdos para
uma superproduo de protenas heterlogas em S.cerevisiae (CHUNG et
al., 1997).
As indstrias nos EUA geram mais que 300 milhes de toneladas de lixo
perigoso e 600 milhes de toneladas de lixo no perigoso por ano. A
Biotecnologia tem dado uma pequena contribuio no tratamento desse lixo,
porm apresenta um potencial ainda maior. O desenvolvimento de rvores
geneticamente modificadas para auxiliar na separao da lignina de celulose
tem economizado US$ 100 milhes/ano na produo do papel. As indstrias
qumicas esto interessadas na aplicao de biocatlise e microrganismos
modificados geneticamente para minimizar a formao de lixo txico sem
aumentar o consumo de energia. Indstrias farmacuticas e de alimentos j
aplicam em grande escala tcnicas de fermentao com tecnologia gentica.
Alguns exemplos incluem enzimas utilizadas a frio e a quente visando
otimizar o uso de energia e reduzir a quantidade de lixo. Os usos da

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engenharia gentica nos processos de produo proporcionam uma reduo


de 41% no consumo de matrias-primas, reduo de 48% no consumo de
vapor e reduo de 49% no consumo de eletricidade (ZECHENDORF,
1999).
O gene da fosfogliceratoquinase 1 (PGK 1) de S. cerevisiae codifica um
dos mais abundantes nveis de RNAm de determinadas protenas na clula,
compreendendo entre 1% e 5% do total celular (OGDEN et al., 1986 apud
LOJUDICE et al., 2001). Portanto, o promotor PGK 1 uma opo atraente
para obteno de altos nveis de expresso de protenas. Seqncias
codificadoras de protenas de interesse tambm tem sido clonadas sob o
controle do promotor GAL 1, o qual um dos mais potentes promotores
fortemente regulados na S. cerevisiae.
A Engenharia Gentica poder certamente melhorar a eficincia dos
microrganismos quando sua capacidade puder ser explorada ao mximo
(ZECHENDORF, 1999).