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Resumo:
Nesta contribuição, será apresentada a bactéria homofermentativa do ácido lático
como uma fábrica celular eficiente para diferentes ingredientes (alimentares). A ênfase
estará em alguns exemplos bem-sucedidos de engenharia metabólica e na fisiologia
dessas bactérias, o que as torna tão adequadas como uma fábrica de células. Uma
conclusão interessante do metabolismo dessas bactérias é que elas escolheram
claramente a velocidade em vez da eficiência, embora alguns resultados evolutivos
ainda não possam ser explicados no nível mecanicista.
1 Introdução:
A fermentação natural já é usada há séculos para aumentar o prazo de validade
de vários materiais alimentares. Esse processo resultou em vários produtos
alimentícios tradicionais, como: laticínios queijo, manteiga, leitelho e iogurte; carne
fermentada, plantas e frutas como salsichas, silagem, chucrute, azeitonas e uvas; e
finalmente produtos fermentados de cereais, como pão e cerveja (Caplice & Fitzgerald,
1999). Com exceção da cerveja e do vinho, ambos envolvendo fermentação alcoólica
por levedura, todos esses produtos alimentares resultam da acidificação bacteriana,
levando a uma vida útil mais longa (Ross, Morgan & Hill, 2002).
As bactérias encontradas nesses produtos fermentados são quase sempre
bactérias do ácido lático (LAB), nomeadas para o ácido orgânico produzido durante a
fermentação. Na maioria dos casos, uma espécie específica de LAB se tornará
dominante em uma fermentação como resultado de sua conversão extremamente
eficiente dos açúcares disponíveis e da rápida formação de ácido lático que inibe o
crescimento da maioria dos outros microorganismos presentes. Além de produzir o
ácido (lático), as bactérias acidificantes, também chamadas de bactérias iniciadoras,
contribuem para o sabor, a textura e o valor nutricional dos alimentos fermentados
através da produção de componentes aromáticos, através da produção ou modificação
de exopolissacarídeos e proteínas e através da produção de componentes nutricionais,
como vitaminas.
A espécie, cepa ou variante que se torna dominante durante uma fermentação
específica é determinada pelo substrato alimentar usado, a temperatura do processo e
outras condições ambientais. No queijo Gouda, que não envolve o cozimento da
coalhada, o ácido lático prevalece a bactéria Lactococcus lactis, a chamada bactéria
mesofílica com um crescimento ideal a 30 ° C e incapacidade de crescer a
temperaturas acima de 35–38 ° C. No iogurte e no queijo parmesão, no entanto, onde
o aquecimento a 50 ° C é empregado, os chamados LAB termofílicos (Delcour, Ferain e
Hols, 2000) são encontrados, como Streptococcus thermophilus e Lactobacillus
helveticus. Atualmente, as fermentações lácteas são frequentemente realizadas em
tão grande escala que há uma forte necessidade de controlar o processo. Ao adicionar
uma alta dose de culturas ativadoras iniciadoras, a fermentação não é mais um
processo que ocorre aleatoriamente, mas se tornou um processo cuidadosamente
controlado.
A produção dessas culturas iniciais (Hansen, 2002) é agora um negócio mundial
de aproximadamente 500Mh. Nesta visão geral, algumas características do LAB
homofermentativo serão descritas e, se possível, explicadas. Esses recursos são a ''
escolha '' dessas bactérias para seu metabolismo específico, o uso dessas bactérias
para
engenharia metabólica e o uso dessas bactérias para fornecer sabor e componentes
nutricionais aos alimentos fermentados.
3. Engenharia metabólica
O metabolismo do LAB é completamente voltado para a produção de um único
metabólito - ácido lático. Esse metabolismo focalizado parece ser a base perfeita para
a criação de fábricas celulares de metabólitos únicos. Nos últimos dez anos, esse
potencial foi demonstrado com vários exemplos de engenharia metabólica bem-
sucedida. O desenvolvimento instrumental na maioria desses exemplos (de Ruyter,
Kuipers, & de Vos, 1996; Kuipers, Beerthuijzen, Siezen, & de Vos, 1993, Fig. 2).
Este sistema de expressão é baseado na produção do composto antimicrobiano
- nisina - por L. lactis. A produção desta bacteriocina é fortemente regulada através da
autoindução. Na ausência de nisina, os genes nisina-biossintéticos não são expressos e
o grau de expressão é diretamente proporcional à quantidade de indutor (nisina)
adicionado. Este sistema de expressão gênica tem foi usado para controlar a expressão
de outros genes usando plasmídeos de expressão contendo o promotor de nisina
controlável em um hospedeiro contendo os componentes sensores de nisina.
Essa fábrica de células pode superproduzir proteínas (enzimas) mil vezes ou
mais. Utilizando este sistema, um eficiente produtor de alanina foi construído através
da introdução do gene que codifica a alanina desidrogenase neste sistema NICEs (Hols
et al., 1999a). Outro exemplo de engenharia metabólica bem-sucedida é a alta
produção do composto de aroma de manteiga, diacetil. A via primária normal da
lactose (ou glicose) para o ácido lático, em L. lactis, foi redirecionada na direção do a-
acetolactato, o precursor químico do diacetil. Isso não foi feito interrompendo o LDH
(Platteeuw et al., 1995) como descrito acima, mas por um procedimento ainda mais
eficaz: a oxidação total do redoxmediator, NADH (de Felipe, Kleerebezem, de Vos e
Hugenholtz, 1998).
NADH, que geralmente é formado durante a glicólise e totalmente re-oxidado
através da redução de piruvato em lactato no LAB homofermentativo, foi agora
oxidado pela NADH-oxidase, que foi superproduzida em L. lactis usando o sistema
NICE. Em vez de piruvato, o oxigênio era agora usado como aceitador final de elétrons,
levando à produção de H2O. Não se formou mais lactato levando ao acúmulo e
subsequente conversão de piruvato em um sistema de expressão gênica muito eficaz
chamado NICE - para expressão gênica controlada por nisina - outros metabólitos,
principalmente o acetolactato. Este composto C5 é formado como resultado da fusão
de duas moléculas de piruvato, catalisadas pela a-acetolactato sintase (ALS), com a
liberação de uma molécula de CO2. Esta enzima está presente com altas atividades em
L. lactis, supostamente para evitar a formação de níveis tóxicos de piruvato
intracelular.
Este intermediário metabólico, a-acetolactato, é bastante instável e é
rapidamente descarboxilado quimicamente em acetona, a pH baixo. A maioria dos
LAB, onde prevalece um pH interno mais neutro, contém uma enzima específica para
esse fim, a-acetolactato descarboxilase. Ao interromper essa atividade enzimática em
L. lactis, é criada uma célula modificada que produz e excreta ativamente o a-
acetolactato.
Na presença de oxigênio, que é fornecido para a oxidação de NADH, esse a-
acetolactato é simultaneamente oxidado e descarboxilado para formar diacetil. A
produção de diacetil pela cepa recombinante pode ser reconhecida imediatamente
pela formação do aroma dominante (manteiga). Foi construída uma fábrica de células
LAB que converte mais de 50% do açúcar (lactose ou glicose) em diacetil (Hugenholtz
et al., 2000), enquanto as fermentações lácteas normais produzem apenas diacetil na
escala de ppm (partes por milhão).
6. Produção de vitaminas
Outro aspecto do metabolismo secundário no LAB, que foi direcionado usando
a engenharia metabólica, é a produção de vitaminas. As vitaminas B folato, riboflavina
e vitamina B12 podem ser produzidas por diferentes bactérias de qualidade alimentar,
pois são co-fatores essenciais nas atividades metabólicas vitais dessas bactérias (como
em todas as células vivas), como a biossinite de aminoácidos e, até mais importante,
de ácidos nucleicos.
Em humanos, por exemplo, uma deficiência de folato pode levar a anemia e
espinha bífida em recém-nascidos e aumentar o risco de doença cardiovascular. Vários
LAB (e também bactérias do ácido propiônico) parecem produzir tantas dessas
vitaminas, que todo o produto fermentado é enriquecido como resultado da produção
bacteriana (Smid, Starrenburg, Mierau, Sybesma e Hugenholtz, 2001). Este conceito de
enriquecimento natural com vitaminas do complexo B foi desenvolvido no projeto EU
Nutra Cells, em colaboração com o University College Cork, na Irlanda, o CERELA, na
Argentina, e a empresa de laticínios Campina, na Holanda.
Esses estudos sobre o enriquecimento de vitamina B incluíram estratégias de
engenharia metabólica para aumentar a biossíntese de vitaminas (Hugenholtz et al.
2002). Os resultados, até agora, foram nada menos que espetaculares. Wilbert
Sybesma e colaboradores visaram a via da biossíntese de folato em L. lactis (Fig. 6). Os
resultados iniciais com a superexpressão do primeiro gene na biossíntese de folato,
codificação gch para GTP-ciclo-hidrolase, e do último gene, codificação folA para
diidrofolato redutase, resultaram em um aumento de três a quatro vezes na produção
de folato e duas vezes em redução de folato, respectivamente ( Sybesma et al., 2003).
A análise dos mutantes de superexpressão gch revelou um acúmulo
extremamente alto na cepa de pteridinas, ainda desconhecidas (Klaus et al., 2005),
demonstrando uma restrição clara para uma conversão adicional em folato.
Estratégias subsequentes de engenharia metabólica envolvendo superexpressão de
todos os genes de folato, exceto folA, resultaram em uma superprodução enorme
dessa vitamina B até níveis de 20 a 30 miligramas por litro, em vez dos poucos
microgramas usuais (Sybesma, 2003). Esses níveis só poderiam ser alcançados
suplementando o meio de crescimento com o ácido paraaminobenzóico precursor
(pABA), mostrando que a síntese desse aminoácido é o próximo gargalo na produção.
Por superexpressão adicional dos genes envolvidos na biossíntese de pABA, pabABC,
uma cepa de L. lactis foi construída por Wegkamp e colaboradores (Wegkamp, van
Oorschot, de Vos e Smid, 2007), que podem produzir miligramas de folato por litro
sem adição de precursores específicos de folato.
Outra vitamina B que foi direcionada com sucesso usando a engenharia metabólica é a
vitamina B2 ou riboflavina.
Também neste caso, todos os (quatro) genes envolvidos na biossíntese da
riboflavina tiveram que ser superexpressos, simultaneamente, para atingir alta
produção (Burgess, O'Connell-Motherway, Sybesma, Hugenholtz e van Sinderen,
2004). Também foi desenvolvida uma estratégia de organismo não geneticamente
modificado (sem OGM) para aumentar a produção dessa vitamina. Ao cultivar o LAB na
presença de um análogo tóxico de riboflavina, roseoflavina, superprodutora de
riboflavina mutantes poderiam ser isolados (Sybesma, Burgess, Starrenburg, van
Sinderen e Hugenholtz, 2004). A rosoflavina é tóxica para a maioria das bactérias, pois
se assemelha fortemente à riboflavina e é absorvida como tal, mas não possui a
atividade de co-fator. Ao induzir alta produção intracelular de riboflavina, as células
podem superar o desafio desse componente tóxico (Kukanova, Zhdanov & Stepanov,
1982).
Agora, esse procedimento foi utilizado com sucesso não apenas em L. lactis,
mas também em vários outros LAB e em Propionibacterium freudenreichii, a bactéria
usada na produção de queijos do tipo suíço (Burgess, Smid, Rutten e van Sinderen,
2006; LeBlanc et al. 2006). Esse uso de análogos tóxicos de vitaminas é atraente, pois
pode resultar no desenvolvimento não-OGM de produtores ricos em vitaminas.
Recentemente, um procedimento para o isolamento de produtores ricos em folato
usando o metotrexato análogo de folato tóxico foi descrito em uma patente
(Wegkamp, Smid, & de Vos, 2006).
Para a vitamina B12, a história ainda não se desenrolou completamente. Essa
vitamina é comercialmente muito interessante, pois não pode ser sintetizada
quimicamente, não está presente nas células vegetais e é produzida apenas por
algumas bactérias, incluindo várias espécies do Propionibacterium de qualidade
alimentar (Piao et al., 2004; Ye, Shijo, Miyano e Shimizu, 1999). Um avanço importante
nessa área é a descoberta, há alguns anos pelo CERELA na Argentina, de um LAB
produtor de vitamina B12 (Taranto, Vera, Hugenholtz, Valdez e Sesma, 2003).
Esta bactéria probiótica, Lb. reuteri, foi identificado como contendo vitamina
B12, mesmo quando cultivado em meios de cultivo sem vitamina B12. As células
continham um corrinóide semelhante ao B12, a pseudovitamina B12, que possui
atividade biológica bastante normal (Santos et al., 2007). Também foi identificado e
sequenciado um agrupamento de genes de biossíntese de vitamina B12 de 25 genes
(Santos e colaboradores, submetidos à publicação). A descoberta desse LAB produtor
de B12 abre caminhos interessantes para o enriquecimento natural de alimentos
(fermentados) com esta importante e muito complexa vitamina B. Novos produtos
alimentícios (lácteos) podem ser esperados no mercado, em breve, que são
naturalmente enriquecidos em vitamina B12.
Também é possível aumentar a produção de vitamina B12 usando engenharia
metabólica? Esta questão ainda não pode ser respondida. O agrupamento de genes
que contém todos os genes que codificam a via de produção de B12 foi sequenciado
(Joint Genome Institute, 2005) e os experimentos iniciais de matriz de DNA mostram
alguns eventos de regulação interessantes e promissores na produção dessa vitamina.
No entanto, ainda não há uma indicação clara de quais genes precisam ser
direcionados para obter maior produção.
Volto agora ao metabolismo simples e direto do LAB homofermentativo. Por
que essas bactérias parecem confiar em quase todas as circunstâncias nesse
metabolismo que gera um rendimento energético tão baixo? A resposta pode ser
fornecida através da nova área científica de Biologia de Sistemas.
7. Biologia de sistemas
O metabolismo do LAB homofermentativo parece girar em torno da velocidade
(de crescimento) à custa aparente da eficiência (em termos de rendimento
energético). Para a bactéria iogurte Streptococcus thermophilus, um LAB termofílico
conhecido por sua capacidade de crescer a temperaturas relativamente altas de 45 ° C,
foi registrado um tempo de duplicação de menos de 10 min (Hols et al., 2005;
Poolman, 2002), que é muito menos do que o tempo clássico de duplicação de 20
minutos, mencionado na maioria dos livros didáticos de microbiologia.
Como é possível que esses LAB cresçam tão rápido? Aparentemente, não se
trata de geração máxima de energia através da conversão de açúcar. Curiosamente, S.
thermophilus nem sequer usa seu açúcar, lactose, mas escolhe utilizar apenas a porção
glicose e excreta a porção galactose no meio (Knol et al., 1996; Vaughan, van den
Bogaard, Catzeddu, Kuipers , & de Vos, 2001). Surpreendentemente, S. thermophilus
cresce mais rapidamente em lactose do que em glicose, presumivelmente como
resultado do sistema de captação extremamente eficiente de lactose que é uma
reação de troca real entre lactose e galactose e opera em taxas muito mais altas do
que a maioria dos sistemas de captação de substrato.
Então, qual é o fator determinante para o crescimento (taxa)? Essa pergunta
intrigante está na mente de muitos microbiologistas há anos. Com o advento das
diferentes tecnologias genômicas, parece agora possível finalmente responder a essa
pergunta para o LAB relativamente simples.
É necessária uma análise muito mais experimental para descrição e
compreensão completas do processo de crescimento dessas bactérias, mas alguns
modelos muito úteis já estão disponíveis. Com base nas sequências genômicas de L.
lactis MG1363 (Wegmann et al., 2007) e Lb. plantarum WCFS-1 (Kleerebezem et al.,
2003), modelos metabólicos estequiométricos completos foram desenvolvidos usando
Simpheny e outras plataformas de modelagem (Notebaart, van Enckevoort, Francke,
Siezen & Teusink, 2006; Oliveira, Nielsen, & Forster, 2005 Teusink & Smid, 2006;
Teusink et al., 2005, 2006).
Também foram desenvolvidos modelos dinâmicos e cinéticos de L. lactis para o
metabolismo do piruvato (Hoefnagel et al., 2002a) e para a glicólise (Hoefnagel et al.,
2002b). Não demorará muito para que modelos dinâmicos sejam desenvolvidos, que
incluem vias reguladoras e transcrição e tradução de DNA, e, portanto, serão capazes
de descrever e prever taxas de crescimento e crescimento. Com essa abordagem de
Biologia de Sistemas, deve ser possível calcular e, assim, entender as taxas de
crescimento desse LAB homofermentativo sob várias condições de cultivo. Com esses
modelos em mãos, deveríamos, finalmente, começar a entender por que um LAB empr