UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA

FACULDADE DE AGRONOMIA E MEDICINA VETERINÁRIA

LABORATÓRIO DE ANÁLISES DE LEITE E DERIVADOS

APOSTILA DE ANÁLISES FISICO-QUÍMICAS E

MICROBIOLÓGICAS DO LEITE FLUÍDO

Disciplinas: Tecnologia de Leite e Derivados

Inspeção de Leite e Derivados

Elaborado por: Márcia de Aguiar Ferreira (mafer@unb.br)

Sabrina dos Santos Costa Poggiani (sabrinacosta@unb.br)
Jaqueline Lamounier Ribeiro (jaqueribeiro@unb.br)

2017
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SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO
2 COMPOSIÇÃO DO LEITE
3. PROPRIEDADES ORGANOLÉPTICAS E FÍSICO-QUÍMICAS DO LEITE
3.1. Densidade
3.2. Ponto de Congelamento e de Ebulição
3.3. Condutividade elétrica
3.4. pH
3.5. Viscosidade
3.6. Acidez
3.7. Calor específico
3.8. Tensão superficial
4. MICROBIOLOGIA DO LEITE
4.1. Microrganismos benéficos presentes no leite
4.2. Microrganismos deteriorantes e patogênicos no leite
5. TRATAMENTOS TÉRMICOS: PASTEURIZAÇÃO E ULTRA-ALTA
TEMPERATURA (UAT)
6. ANÁLISES FÍSICO-QUÍMICAS PARA LEITE
6.1. ANÁLISES FÍSICO-QUÍMICAS PARA LEITE CRU E PASTEURIZADO
6.1.1 Procedimentos para colheita de amostras de leite
6.1.2. Medição da temperatura
6.1.3. Teste do Alizarol
6.1.4. Prova de acidez pelo método Dornic
6.1.5. Peroxidase
6.1.6. Fosfatase alcalina
6.1.7. Crioscopia
6.1.8. Análises físico-químicas do leite em equipamento ultrasônico
6.1.9. Determinação da porcentagem de gordura pelo processo
6.1.10. Extrato seco total
6.1.11. Densidade
6.1.12. Sólidos não gordurosos
6.2. ANÁLISES FÍSICO-QUÍMICAS COMPLEMENTARES
6.2.1. Lactofermentação
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6.2.2. Sedimentação
6.2.3. Lactofiltração
6.2.4. Ring Test - prova do anel azul
6.2.5. Teste do Álcool
7. PESQUISA DE RESÍDUOS DE SUBSTÂNCIAS QUÍMICAS
7.1. CONSERVANTES
7.1.1 Antibióticos
7.1.2 Peróxido de hidrogênio
7.1.3. Formol
7.1.4. Cloro e hipoclorito
7.2. NEUTRALIZANTES DA ACIDEZ
7.2.1. Bicarbornato e outros alcalinos
7.3. RECONSTITUINTES
7.3.1 Amiláceos
7.3.2. Cloretos
7.3.3. Sacarose
7.3.4. Álcool etílico
8. ANÁLISES MICROBIOLÓGICAS
8.1. Planos amostrais
8.2. Colheita e preparo da amostra para análises microbiológicas
8.3. Diluições decimais seriadas
8.4. Análises obrigatórias para leite fluido
8.4.1. Contagem Padrão em Placas
8.4.2. Número mais provável de Coliformes a 30/35°C
8.4.3. Número mais provável de Coliformes a 45°C
8.4.4. Pesquisa de Salmonella spp
9. Outras análises microbiológicas
9.1. Contagem de Bolores e Leveduras
9.2. Contagem de Microrganismos Psicrotróficos
9.3. Contagem de Staphylococcus coagulase positiva
9.4. Pesquisa de Listeria monocytogenes
10. OBTENÇÃO DE LEITE COM QUALIDADE (Cartilha de Boas Práticas de
Produção de Leite e Fabricação de Queijo de Búfala).
BIBLIOGRAFIA CONSULTADA/RECOMENDADA
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1. INTRODUÇÃO

O leite é considerado um alimento completo. Dessa forma, com elementos nutricionais

importantes (proteínas, carboidratos, vitaminas e minerais), também é um excelente substrato
para vários microrganismos. Por este motivo, o leite deve ser obtido com a máxima higiene e
mantido em baixa temperatura, desde a ordenha até a ocasião de seu beneficiamento, a fim de
garantir características físicas, químicas e nutricionais do produto final (GERMANO &
GERMANO, 2008). Para tanto, deve-se ter maior rigor na fiscalização da qualidade do leite
para assegurar sua condição indispensável de alimento sadio, e preservar a saúde dos
consumidores (Carvalho et al., 1995).

2. COMPOSIÇÃO DO LEITE

O leite "in natura" é um produto obtido higienicamente, por meio da ordenha completa e
ininterrupta de vacas sadias, devendo ser resfriado imediatamente após sua obtenção, podendo ser
proveniente de uma ou várias fêmeas e de uma ou mais ordenhas (SPREER, 1975). A sua composição
média inclui água (87,3%), gordura (3,9%), proteínas (3,2%), lactose (4,6%), sais minerais (0,6%) e
pode variar conforme a espécie, raça, individualidade, alimentação, tempo de gestação, intervalos
entre ordenhas, estresse ou ação de drogas medicamentosas (PEREIRA et al., 2001).

A matéria gorda é o elemento mais variável do leite, constituída por triglicérides e formada
por glóbulos de diversos tamanhos que se encontram em emulsão. No leite de vaca há,
aproximadamente, 347 acidos graxos, com destaque para o butírico, capróico, caprílico,
láurico, mirístico, palmítico, esteárico e oleíco (BEHMER, 1982, PEREIRA et al., 2001).

As proteínas presentes no leite representam três grupos diferentes: a caseína, as lactoalbuminas

e as lactoglobulinas. A caseína é o componente principal da proteína láctea (80%) e tem grande
importância nutricional, sendo responsável pela formação do coágulo na elaboração de queijos. É uma
fosfoproteína que contém cálcio, dando origem ao complexo cálcio-caseína. As lactoalbuminas e as
lactoglobulinas (cerca de 20%) são haloproteínas, destacando-se a beta-lactoglobulina que se
desnatura a altas temperaturas liberando grupos sulfidrilos redutores (SH) (SPREER, 1975).

A lactose é um açúcar dissacarídeo composto por glucose e galactose (C12H22O11H2O)

encontrado somente no leite e que tem importância tecnológica em todos os processos de
acidificação do leite ou fermentação láctica, que é base para a fabricação de iogurtes, manteigas e
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queijos, sendo o constituinte mais estável do leite, praticamente não variando entre as raças bovinas.
A lactose isolada do leite em forma de pó serve como matéria prima na indústria farmacêutica
(VIERA DE SÁ, 1978).

Os constituintes minerais, ou sais do leite, representam 0,6 a 0,8% do peso total. Na

indústria, são indiretamente úteis, como o caso, por exemplo, dos sais de cálcio cuja presença no leite é
fundamental para que se opere a coagulação das proteínas, e dos citratos que desempenham
papel essencial na formação do aroma da manteiga (SPREER, 1975).

As enzimas do leite são provenientes do sangue e das células secretoras da glândula

mamária, sendo que também podem ser produzidas por microrganismos. A temperatura que
favorece a ação das enzimas varia, assim como a temperatura de desnaturação, que é diferente para
cada uma. As principais enzimas naturais presentes no leite são a peroxidase, que é destruída à
temperatura em torno de 80°C e tem sua importância estabelecida com relação à determinação
da temperatura a que foi submetido o leite pasteurizado, e a fosfatase alcalina, que é destruída em
temperaturas de 70 a 75° C, sendo importante na avaliação da eficiência da pasteurização
(SPREER, 1975).

Segundo Veisseyre (1972), o leite está entre os alimentos que contém uma maior
variedade de vitaminas, apesar de encontrarem-se em pequenas quantidades, sendo que as principais
vitaminas lipossolúveis são A (1500 UI/litro), D (20 UI/litro) e E (l a 2 mg/litro) e as vitaminas
hidrossolúveis são B1 (400 a lOOOµg/litro), B2 (800 a 3000 µg/litro), B6 (0,3 a l,5 mg/litro), B12 (l a
8 µg/litro), ácido pantotênico (2 a 5 mg/litro), niacina (l a 2 mg/litro) e vitamina C (10 a 20
mg/litro).

3. PROPRIEDADES ORGANOLÉPTICAS E FÍSICO-QUÍMICAS DO LEITE

O leite fresco apresenta-se como um líquido cuja coloração pode variar do branco
opaco, devido à passagem da luz através da caseína e substâncias coloidais dispersas, à
amarela devido ao caroteno dissolvido na gordura; é duas vezes mais viscoso que a água, com
sabor levemente adocicado devido à relação entre a lactose e os sais, e de odor pouco
acentuado conferido pelo ácido cítrico (VEISSEYRE, 1972).

As propriedades físicas do leite são influenciadas pela sua composição e algumas

dessas são importantes no processamento do leite, além disso, servem como marcadores nas
provas de detecção de fraudes (HENDERSON, 1971). As principais são:
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3.1. Densidade: corresponde a relação entre a massa e o volume. A densidade do leite

é fortemente influenciada pela gordura, pois ao aumentar-se a matéria gorda, a densidade
diminui e vice-versa, podendo ser utilizada para detectar fraudes por aguagem ou adição de
solutos, sendo que qualquer fator que aumente ou diminua o peso ou volume do leite afetará a
densidade (PEREIRA et al., 2001).

3.2. Ponto de Congelamento e de Ebulição: o leite é uma solução que contém sais e
açúcares. Portanto apresenta ponto de congelamento mais baixo, em relação à água
(aproximadamente -0,530° Celsius que corresponderá a -0,550° Hortvet), e de ebulição (entre
100oC e 101oC) (PEREIRA et al., 2001).

3.3. Condutividade elétrica: por conter eletrólitos (sais, ácidos e bases), o leite
possibilita a passagem de corrente elétrica que pode ser utilizada para detectar leites anormais,
como aqueles provenientes de animais com mastite (ocorre aumento de cloretos) e para
detecção de fraudes por adição de substâncias neutralizantes. Em média, a condutividade do
leite varia entre 46,1 – 49,2 x 104 S cm-1.

3.4. pH: é importante na tecnologia do leite, pois todos os fenómenos fermentativos,

processos de formação da manteiga, precipitação de proteínas e o resultado da pasteurização
dependem da concentração de íons hidrogênio, ou pH do leite, que apresenta valores entre 6,4
a 6,8. Em leite de conjunto, o pH varia entre 6,6, a 6,8 com média de 6,7 a 20oC ou 6,6 a 25oC
(PEREIRA et al., 2001).

3.5. Viscosidade: o leite é mais viscoso do que a água, devido à presença de proteínas
e gorduras, podendo sofrer alterações com o processamento industrial (PEREIRA et al.,
2001). A viscosidade depende da resistência de atrito entre as moléculas, que diminui quando
há aumento da temperatura e é especialmente importante na avaliação do creme.

3.6. Acidez: O leite logo após a ordenha apresenta reação ácida com a fenolftaleína
sem que nenhuma acidez como ácido lático tenha sido produzida por fermentações. A acidez
do leite fresco deve-se à presença de caseínas, fosfatos, albumina, dióxido de carbono e
citratos. A elevação da acidez é determinada pela hidrólise da lactose por enzimas de origem
microbiana e formando ácido lático, caracterizando a acidez desenvolvida do leite (PEREIRA
et al., 2001).
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3.7. Calor específico: o conhecimento do calor específico do leite e dos produtos

lácteos é essencial para controle dos aspectos de engenharia de processos e dimensionamento
de equipamentos. A 15oC o leite integral apresenta calor específico de 3,93J K-1kg-1
(PEREIRA et al., 2001).

3.8. Tensão superficial: A tensão superficial do leite integral é de 55,3 dyn/cm e o

aumento nos teores de constituintes tensoativos (proteínas, ácidos graxos livres) ocasiona a
redução da tensão superficial do leite (PEREIRA et al., 2001).

4. MICROBIOLOGIA DO LEITE

4.1. Microrganismos benéficos presentes no leite

O leite obtido de forma higiênica e procedente de animais sadios contém células e
microrganismos que constituem a microbiota normal, predominando as células epiteliais, os
leucócitos, linfócitos e monócitos (VEISSEYRE, 1972), e bactérias ácido-lácticas (BALs),
conhecidas como fermentos lácticos e responsáveis pela fermentação natural do leite.
O grupo das BALs compreende diversos gêneros de bactérias, os principais são:
Carnobacterium, Lactococcus, Lactobacillus, Lactosphaera, Leuconostoc, Oenococcus,
Pediococcus, Streptococcus, Vagococcus e Weissella (SILVA et al., 2010). Esse grupo
apresenta elevado potencial tecnológico na produção de alimentos, devido à capacidade de
fermentar os carboidratos do leite produzindo ácido lático, Os gêneros Bifidobacterium e
Enterococcus também estão incluídos neste grupo no que diz respeito às bactérias utilizadas
com finalidade funcional. São empregadas na fabricação de variados derivados lácteos
conferindo-lhes sabores, odores e texturas específicas (TULINI et al., 2016). Além do que,
são benéficas à saúde do hospedeiro por melhorar o equilíbrio microbiano intestinal e
sintetizar compostos e substâncias proteicas que agem de forma antimicrobiana ao
desenvolvimento de bactérias deteriorantes de alimentos e patogênicas. (ANVISA, 2008;
ORTOLANI et al., 2010).

4.2. Microrganismos deteriorantes e patogênicos no leite

A contaminação do leite por microrganismos deteriorantes é um fator que altera a

composição do produto e por consequência, a sua qualidade nutricional. Esta contaminação
pode acontecer no momento da ordenha, do transporte, do beneficiamento (recontaminação
após a pasteurização). Além disso, nos pontos de venda quando nestas etapas não são
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observadas as boas práticas de conservação. Diversos são os agentes microbianos

deteriorantes que podem contaminar o leite, tendo como principais os coliformes, os
psicrotróficos, os bolores e as leveduras (FRANCO & LANDGRAF, 2008).

Os microrganismos patogênicos podem ser incorporados ao leite e derivados, por

contaminações dos próprios animais ou do ambiente (ordenha, fabricação/manipulação,
armazenamento, comercialização). Os principais microrganismos patogênicos que podem
estar presentes no leite são: Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Salmonella spp.,
Staphylococcus aureus enterotoxigênicos, Brucella spp., Mycobacterium spp. e
Campylobacter (SILVA et al., 2010).

Diante da impossibilidade de enumeração e detecção de todos os microrganismos que

podem ser veiculados pelos diversos tipos de alimentos, a identificação dos chamados
microrganismos indicadores é utilizada para se avaliar a qualidade microbiológica dos
alimentos em relação à vida de prateleira ou à segurança. Neste ultimo caso, devido à
presença de patógenos alimentares. São grupos ou espécies de microrganismos que, quando
presentes em um alimento, podem fornecer informações sobre a ocorrência de contaminação
de origem fecal, sobre a provável presença de patógenos ou sobre a deterioração potencial do
alimento, além de poderem indicar condições sanitárias inadequadas durante o
processamento, produção ou armazenamento (FRANCO & LANDGRAF, 2008).

Segundo a ICMSF (International Commission on Microbiological Specifications for

Foods), microrganismos indicadores podem ser agrupados em microrganismos que não
oferecem riscos à saúde (psicrotróficos, termófilos, bolores e leveduras) e microrganismos
que oferecem um risco baixo ou indireto à saúde (coliformes totais, coliformes fecais,
enterococos, enterobactérias totais e Escherichia coli).

5. TRATAMENTOS TÉRMICOS: PASTEURIZAÇÃO E ULTRA-ALTA TEMPERATURA,

(UAT)

Entende-se por pasteurização o tratamento térmico aplicado ao leite com objetivo de

evitar perigos à saúde pública decorrentes de microrganismos patogênicos eventualmente
presentes, e que promove mínimas modificações químicas, físicas, sensoriais e nutricionais
(RIISPOA, 2017).

Os processos de pasteurização permitidos pela legislação para o leite são a

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pasteurização lenta (Figura 1), que consiste no aquecimento do leite a 63 - 65°C (sessenta e
três a sessenta e cinco graus centígrados) por 30 (trinta) minutos mantendo-se o leite em grande
volume sob agitação mecânica, lenta, em aparelhagem própria, sendo indicada para pequenos
volumes; a pasteurização rápida, que consiste no aquecimento do leite em camada laminar a
72 - 75°C (setenta e dois a setenta e cinco graus centígrados) por 15 a 20 (quinze a vinte)
segundos, em aparelhagem própria, devendo imediatamente após o aquecimento, o leite ser
refrigerado em temperatura não superior a 4oC e em seguida envasado. Somente é permitida a
utilização de aparelhagem convenientemente instalada e em perfeito funcionamento, provida
de dispositivos de controle automático, de termo-regulador, de registradores de temperatura
(termógrafos de calor e frio) e outros que venham a ser considerados necessários para o
controle técnico-sanitário da operação (Figuras 2 e 3) (RIISPOA, 2017).

Figura 1. Pasteurização lenta. Disponível em: www.fazendatamandua.com.br

Figura 2. Pasteurizador a placas. Disponível em www.dantherm.com.br

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Figura 3. Embalagem do leite pasteurizado em “saquinho”. Acervo próprio.

Outro tratamento térmico, amplamente utilizado é o da Ultra Alta Temperatura (UAT),

ou UHT (Ultra High Temperature), que consiste na passagem do leite, previamente
pasteurizado em aparelhagem própria, à temperatura em torno de 140°C/l-4’ (um a quatro
segundos) devendo ser imediatamente resfriado, a temperatura menor ou igual a 32oC e
acondicionado em embalagens longa vida (Figuras 4 e 5). Este tratamento elimina formas
vegetativas (mas não as esporuladas), sendo obrigatória a homogeneização da gordura, que de
acordo com diversos autores promove uma melhor digestibilidade do produto, e sem prejuízo
das características nutricionais além de promover um tempo de prateleira maior em relação ao
produto pasteurizado ("saquinho").

Além da pasteurização, outros fatores são importantes para a garantia da higidez do

produto como, taxa de contaminação inicial do leite, sanidade do rebanho, higiene na ordenha e
equipamentos, saúde do pessoal envolvido e condições satisfatórias de armazenamento e
distribuição (NADER FILHO et al.,1989 a,b; MORAIS et al., 1992; AZJENTAL et al., 1993).
Qualquer que seja o método utilizado, seus efeitos podem ser anulados em grande parte ou
totalmente, caso não haja cuidados de se evitar recontaminações no produto corretamente tratado.
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Figura 4. Sistema de Ultra Alta Temperatura (UAT). Disponível em:

www.niroinc.com/images/geaFilt/UHT_plants

Figura 5. Embalagem do leite UAT. Disponível em: www.ecoeficientes.com.br

6. ANÁLISES FÍSICO-QUÍMICAS

6.1. ANÁLISES FÍSICO-QUÍMICAS DE LEITE CRU E PASTEURIZADO

6.1.1. Procedimento para colheita de amostras de leite

Para leite cru, recomenda-se a utilização de agitadores, com turbulência moderada para
mistura do leite no latão ou no tanque de resfriamento, e coletor com alça (Figuras 6 e 7). Os
frascos para acondicionamento do leite não devem ser cheios até a tampa para evitar
extravasamento e permitir uma homogeneização antes das análises, devendo ser colhidos pelo
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menos 1000 mL para a realização de todas as análises. As amostras deverão ser mantidas em
refrigeração (máximo de 7°C) até o momento das análises, que devem ser realizadas o mais
rápido possível, identificadas corretamente. Para leite pasteurizado, coletar um litro na
embalagem original, que deve estar íntegra, manter em refrigeração (máximo de 7°C) até o
momento da realização das análises, que deve acontecer o mais rápido possível e com o
produto dentro do prazo de validade. Para o leite UAT, a amostra pode ser mantida em
temperatura ambiente.

Figura 6. Agitadores para latões e para tanques de resfriamento. Disponível em: www.cap-
lab.com.br/2004/images/prod

Figura 7: Canecas para coleta de leite. Disponível em: www.cap-lab.com.br/2004/images/prod

6.1.2. Medição da temperatura

Princípio: o leite cru refrigerado coletado de tanques de resfriamento deve estar em
temperatura de até no máximo 4oC e a 7oC quando armazenado em latões (tanques de
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imersão). Deverá ser coletado e transportado, em igual temperatura, por caminhões

isotérmicos até o laticínio. Portanto, o leite será recusado pelo transporte ou pelo laticínio,
caso a temperatura esteja acima dos valores preconizados (IN 62/2011; RIISPOA, 2017).

6.1.3. Teste do Alizarol

Princípio: baseia-se na verificação da estabilidade da proteína ao álcool e, na avaliação
qualitativa da acidez pela reação colorimétrica desenvolvida devido à presença de indicador
alizarina, sendo um teste de triagem e auxiliar para a diferenciação entre o desequilíbrio salino
e a acidez excessiva.
Procedimento (IN 68/2006): em tubo de ensaio pipetar 2 mL de leite + 2 mL de alizarol 70º GL
e homogeneizar cuidadosamente. Na coleta do leite na propriedade e no laticínio, a análise é
feita em aparelho específico (pistola para teste de alizarol) (Figuras 8 e 9).
Resultados: vermelho-castanho com coagulação fina: leite normal, estável;
amarelo coagulado: leite ácido, instável;
violeta sem coagulação: leite alcalinizado.

Figura 8. Prova do Alizarol com leite ácido, alcalino e normal, respectivamente. Acervo próprio.

Figura 9. Pistola para teste de Alizarol.Disponível em: www.hexasystems.com.br

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6.1.4. Prova de acidez pelo método Dornic (°D)

Princípio: baseia-se na determinação quantitativa da acidez no leite, por meio de uma reação
de neutralização realizando titulação de determinado volume de leite por uma solução alcalina
conhecida (Hidróxido de sódio), utilizando a fenolftaleína como indicador do ponto de
viragem da reação. O resultado poderá ser expresso em graus Dornic (ºD) ou porcentagem de
ácido lático (Figuras 10, 11 e 12).
Procedimento (IN 68/2006): pipetar 10 mL de leite em tubo de ensaio (18 x 180) e adicionar
5 gotas de fenolftaleína; em seguida titular através de acidímetro (Figura 11,12 e 13) a
solução Dornic até viragem de cor do indicador, para levemente róseo. Verificar o volume de
solução utilizada, sendo que para cada 0,1mL gasto corresponde a 1°D e cada grau Dornic
corresponde a 0,01% (m/v) ou, 0,1g/L de ácido lático.
Normalidade (IN 62/2011; RIISPOA, 2017): 14 a 18°D.

Figura 10. Bureta para titulação. Acervo próprio.

Figura 11. Acidímetro de Dornic para análise de acidez. Disponível em: www.cap-lab.com.br/2004/images
 15

Figura 12. Viragem de cor no teste de acidez Dornic. Acervo próprio.

6.1.5. Peroxidase
Princípio: a peroxidase é uma enzima, utilizada na avaliação da eficiência do sistema de
pasteurização por ser considerada termoresistente, ou seja, permanece ativa após o tratamento
térmico. A peroxidase, ao hidrolisar o peróxido de hidrogênio, libera oxigênio, o qual
transformará o guaiacol da sua leucobase para a forma corada (Figura 13).
Procedimento (IN 68/2006): Transferir 10 mL da amostra para um tubo de ensaio, aquecer
em banho-maria a 45ºC por 5 minutos, para ativação da enzima. Acrescentar 2 mL da solução
hidroalcoólica de guaiacol a 1 % ao tubo de ensaio, pelas suas paredes, seguir a adição de 3
gotas da solução de peróxido de hidrogênio a 3 %.
Resultados: cor salmão: prova positiva, leite cru ou propriamente pasteurizado.
cor branca: prova negativa, leite superaquecido ou fervido (acima de 80°C).

Figura 13. Teste da Peroxidase com reação positiva. Acervo próprio.

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6.1.6. Fosfatase alcalina

Princípio: ao contrário da peroxidase, a fosfatase alcalina é uma enzima considerada
termosensível, ou seja, é inativada pelo tratamento térmico devendo estar ausente no leite
pasteurizado. A verificação da atividade enzimática é feita mediante a adição ao leite, do
substrato específico da enzima em condições ideais para sua atuação. A presença do indicador
permite identificar a atividade enzimática pela reação colorimétrica com os produtos de
degradação (Figura 14).
Procedimento rápido: é realizada com "Kit" comercial para fosfatase alcalina, pipetar
0,025mL do substrato (n° 1); 0,25mL de solução tampão (n° 2); adicionar 0,025mL da
amostra, homogeneizar e incubar em banho-maria a 37°C por 10 minutos; acrescentar 2mL do
reagente de cor (n°3).
Resultados: cor azul: reação positiva, fosfatase presente.
cor amarela/esverdeada: reação negativa, fosfatase inativada.
Procedimento (IN 68/2006): Transferir 0,5 mL da amostra a analisar para um tubo de ensaio,
adicionar 5 mL do substrato, tampar com rolha de borracha, agitar ligeiramente e levar ao
banho-maria mantido a 39-41ºC durante 20 minutos. Esfriar o tubo de ensaio em água
corrente, adicionar 6 gotas de solução reagente e 2 gotas do catalisador. Levar o tubo
novamente ao banho-maria a 39 – 41ºC por 5 minutos. Repetir o mesmo procedimento acima
descrito, usando, em lugar da amostra e em diferentes tubos, 0,5 mL de leite cru e 0,5 mL de
leite fervido.
Resultados: cor azul intensa: leite cru.
cor cinza: leite pasteurizado.
Observação: A tonalidade do azul vai ficando tanto mais intensa, quanto maior for a
deficiência de pasteurização.

Figura 14. Teste da fosfatase com reação positiva e negativa, respectivamente. Acervo próprio.
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6.1.7. Crioscopia
Princípio: baseia-se na determinação do ponto de congelamento do leite em comparação ao
da água e está relacionado com o equilíbrio entre água e solutos.
Procedimento: para a determinação dos índices crioscópicos (IC) das amostras, utiliza-se 3
repetições de cada amostra distribuídas em tubos de crioscópio, em um volume de 2,5mL cada, e
transferidos para crioscópio (Figura 15), para a determinação do ponto de congelamento. Após a leitura
de cada amostra, calcula-se a média, determinando assim o valor do índice crioscópico, expresso em
graus Hortvet (°H).
Normalidade (RIISPOA, 2017): - 0,530ºH a -0,555ºH (equivalentes a -0,512ºC e a -0,536ºC)

Figura 15. Equipamento crioscópio eletrônico Laktron®-M-90. Acervo próprio.

6.1.8. Análises físico-químicas do leite em equipamento do tipo ultrasônico

Princípio: metodologia rápida (em 40 segundos) através do equipamento ultrasônico
Ekomilk Total® (Figura 16) para as análises dos teores de gordura (F), Estrato seco total
(EST), sólidos não gordurosos (S), proteínas (P), lactose (L) e densidade do leite (D),
Condutividade elétrica (Z).
Procedimento rápido: adicionar em dois tubetes uma porção de leite e mergulhar o sugador e
o phmetro do equipamento ultrasônico (Figura 8).
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Normalidade (IN 62/2011; RIISPOA, 2017): F - Integral: 3,0% (no mínimo)

F - Semi-desnatado: 2,9 a 0,6%
F - Desnatado: 0,5 (no máximo)
S: 8,4% (no mínimo)
EST: 11,4% (no mínimo)
D: 1,028 -1,034 mg/mL (15°C)
P: 2,9% (no mínimo)
L: 4,3% (no mínimo)

Figura 16. Equipamento Ekomilk Total® (EON Trading). Acervo próprio.

6.1.10. Extrato seco total (EST)

Princípio: extrato seco, ou matéria seca, é o conjunto de todos os componentes do leite com
exceção da água.
Procedimento (IN 68/2006): determinar os valores de EST das amostras, através da fórmula
de FURTADO (ILTC, 1993):
EST= 1,2G + D/4 + 0,25 onde: G = gordura / D = densidade
Normalidade (IN 62/2011; RIISPOA/2017) 11,4% no mínimo

6.2. ANÁLISES FÍSICO-QUÍMICAS COMPLEMENTARES

6.2.1. Lactofermentação
Princípio: baseia-se na coagulação espontânea do leite, pelas bactérias presentes, quando
incubado a temperaturas de 30-35oC por 24 horas. O material utilizado deve apresentar-se
rigorosamente limpo e esterilizado; é uma análise qualitativa (Figura 17).
Procedimento (LANARA, 1981): pipetar l0 mL da amostra de leite em um tubo esterilizado
hermeticamente vedado e incubar em estufa à 3 8°C/24h.; classificar o coágulo.
 19

Resultados:
 tipo gelatinoso: o coágulo apresenta-se uniformemente gelatinoso e é proveniente da
fermentação lática (bactérias de várias espécies transformam a lactose em ácido lático). A
biota normal é aquela que produz ácido lático, acidificando naturalmente o leite ( S.
cremocis, S. lactis e Lactobacillus casei).
 tipo esfacelado ou esponjoso: com produção de gás e ácido; o soro é claro e mais ou
menos abundante e é proveniente de fermentação pseudolática, devido à presença de
coliformes.
 tipo caseoso: apresenta coágulo que se contrai de um lado ou em todo o contorno; o soro é
claro ou leitoso; o coágulo é proveniente de fermentação proteolitica, devido à ação de
microrganismos que agem sobre a substância proteica, decompondo-a em compostos de
aroma desagradável. Aeróbios e Psicrotróficos: Proíeus spp, Serratia spp,
Pseudomonas spp, Achromobacter spp, Flavobacterium spp. Anaeróbios: Clostridium spp.
 tipo floculoso: apresenta flocos de caseína, com bolhas gasosas, sendo que o soro muitas
vezes, apresenta-se leitoso. O coágulo é proveniente de fermentação por leveduras. Ocorre
forte produção de gás carbónico devido à formação de pequena quantidade de álcool etílico.
 aspecto líquido: com ausência de coágulo ou escassa coagulação. Este leite é um meio
impróprio para o crescimento bacteriano denotando um produto impróprio para a indústria e
para o consumo, pois geralmente indica presença de substâncias inibidoras como antibióticos.

Figura 17. Resultados possíveis para o teste de lactofermentação. Acervo próprio.

 20

6.2.2. Sedimentação
Princípio: baseia-se na avaliação visual do sedimento formado pela deposição de substâncias
próprias ou residuais presentes no leite.
Procedimento (LANARA, 1981): pipetar 5 mL de cada amostra em tubos de centrífuga; após
centrifugação a 2.000 rpm por 5 minutos, observar o sedimento formado classificando-o segundo
descrito abaixo.
Resultados: bom: pequeno sedimento branco;
regular: presença de células, sujidades;
ruim: presença de células, sujidades, sangue, terra;
péssimo: presença de células, sujidades, sangue, terra, fezes.

6.2.3. Lactofiltração
Princípio: é feita a filtração, em papel filtro, de um volume determinado de leite levemente
aquecido para avaliar quantitativamente, a presença de sujidades no leite cru provenientes de
processos anteriores à sua recepção na indústria (ordenha, utensílios, transporte) como
estimativa das condições higiênico-sanitárias. É necessário utilizar aparelho de filtração de
Minit com papel filtro adequado.
Procedimento (PEREIRA et al., 2001): transferir 500 mL de leite para béquer de 1000 mL;
aquecer o leite em banho-maria a no máximo 40°C; transferir para o aparelho de filtração de
Minit com o papel filtro previamente tarado (P1); vedar o aparelho; insuflar ar com auxílio de
pera de borracha até completar a filtração; retirar o filtro, secar em estufa à 100ºC e esfriar em
dessecador; em seguida pesar o filtro com o resíduo seco em balança analítica (P2).
Resultados: a massa do resíduo é determinada por diferença entre os resultados das pesagens
P2 e P1 que será expressa em miligramas de sujidade por litro de leite.

6.2.4. Ring Test - prova do anel azul

Princípio: o teste tem a finalidade de evidenciar aglutininas anti brucelas no leite. São mais
usuais para o teste, antígenos corados com hematoxilina, que por sua vez formam uma
coloração azulada característica da reação positiva. Desse modo, se houver presença de
anticorpos no leite, os mesmos reagirão com o antígeno Brucella abortus formando uma
malha de complexo antígeno-anticorpo que será arrastada pelos glóbulos de gordura,
culminando com a ocorrência de um anel azulado na camada de creme do leite (reação
positiva). O antígeno Cepa 1119/ Brucella abortus, contém 4% de células e deve ser
conservado em refrigeração e pH 4,0. É uma prova de grande utilidade para localizar
 21

rebanhos potencialmente infectados, principalmente quando aplicada em usinas

beneficiadoras de leite.
Procedimento: coletar leite de latão ou individual; manter 24h em refrigeração; adicionar 1 mL
de leite e 0,03mL do Ag (M.A) em um tubo de ensaio de mais ou menos l cm de diâmetro;
incubar a 37°C por 45 minutos; fazer a leitura.
Resultados: é classificada em cruzes de l a 4. prova positiva: anel escuro na superfície, sendo
que, quanto maior a largura do anel formado, maior a concentração de Brucella spp. no leite.

6.2.5. Teste do Álcool

Princípio: verifica a estabilidade do leite em presença de solução alcoólica; a coagulação
ocorre por efeito da elevada acidez ou do desequilíbrio salino quando se promove
desestabilização da caseína pelo álcool etílico 70°GL.
Procedimento (IN 68/2006): transferir para um tubo de ensaio, partes iguais (2mL) de leite e
de álcool e misturar cuidadosamente.
Resultados: coagulado: leite sem estabilidade;
coagulação fina ou sem coagulação: leite normal.

7. PESQUISA DE SUBSTÂNCIAS QUÍMICAS

7.1. CONSERVANTES

7.1.1 Antibióticos
Princípio: Os resíduos de antibióticos no leite geralmente estão em concentrações baixas, da
ordem de ppb (partes por bilhão) e são vários os medicamentos que podem ser utilizados em
vacas leiteiras. Atualmente, os denominados métodos rápidos, que se baseiam em kits
comercialmente disponíveis, já podem ser utilizados e têm como princípios a inibição do
crescimento bacteriano e reações enzimáticas ou imunológicas, sendo que os mais usados são os
de inibição do crescimento, como o Charm Test utilizado pelo LABLEITE (Figura 18).
 22

Figura 18. Placa aquecedora para Charm e fitas de MRL BL/TET test.

Procedimento: verificar se a incubadora está em +- 56°C, agitar o leite e retire o rótulo da fita;
inserir no local adequado da incubadora a fita. Pipetar 300 µL da amostra no compartimento da
amostra na fita. Fechar o compartimento da fita e a tampa da incubadora, apertar para travar,
aguardar não mais que 10 minutos, retirar a fita para fazer a leitura.
Resultados: reação inválida: falha na linha “C” e duas linha “BL” e “ TE” visíveis.
reação negativa: Linha “C” clara ou escura e linhas “BL” e “TE” escuras.
reação positiva: Linha “C” visível e linhas “BL” e/ou “TE” clara ou linhas “BL” e/ou
“TE” escura (Figura 19).

Figura 19. Resultados do kit Charm MRL BL/TET test. Disponível no manual do produto.

7.1.2 Peróxido de hidrogênio

Princípio: reação é devida a ação da enzima peroxidase (presente no leite) degradando H2O2 e
oxidando o indicador a Tetraguaiacol (Figura 20).
Procedimento (PEREIRA et al., 2001): em tubo de ensaio pipetar 5 mL de leite cru e 0,5 mL de
Guaiacol 1% (v/v) S.R. e agitar .
Resultados: reação positiva: cor salmão
reação negativa: inalterado
 23

Figura 20: Teste do Peróxido de hidrogênio com reação positiva. Acervo próprio.

7.1.3. Formol
Princípio: A metodologia alternativa possui reação colorimétrica em caso positivo - uma cor
violeta, que varia de acordo com a concentração do contaminante adicionado na amostra. A
formação de uma cor rosácea indica o resultado negativo (Figura 21).
Procedimento: pipetar 15 mL de leite em tubo de ensaio e adicionar 1 mL de Formfix em
seguida.
Resultados: reação positiva: coloração roxa
reação negativa: coloração rosa

Princípio: metodologia oficial baseada no aquecimento do formaldeído e ácido cromotrópico,

que com a presença de ácido sulfúrico, origina um produto de condensação, no qual oxidado
posteriormente transforma-se em um composto p-quinoidal de coloração violeta.
Procedimento (IN 68/2006): Medir 100 mL de leite homogeneizado e passar para balão de
destilação juntamente com 100 a 150 mL de água. Acidificar com 2 mL de ácido fosfórico
p.a.. Destilar lentamente recolhendo cerca de 50 mL de destilado. Em tubo de ensaio colocar
5 mL de solução de ácido cromotrópico a 0,5 % e 1 mL de destilado. Colocar em banho-maria
durante 15 minutos.
Resultados: reação positiva: coloração violácea.
 24

Figura 21. Teste Formfix com reação negativa e positiva para formol, respectivamente. Acervo próprio.

7.1.4. Cloro e hipoclorito

Princípio: o teste se dá pela adição de iodeto de potássio ao leite, que promoverá desenvolvimento de
coloração alaranjada em presença de hipocloritos devido à liberação de iodo (Figura 22).
Procedimento (IN 68/2006): pipetar 1mL de leite em tubo de ensaio (16 x 160) e em seguida
adicionar 1mLde iodeto de potássio a 10% homogeneizando a amostra (ELTC, 1993).
Resultados: reação positiva: alaranjado
reação negativo: inalterado

Figura 22. Teste para cloro e hipoclorito com reação negativa e positiva, respectivamente. Acervo próprio.
 25

7.2. NEUTRALIZANTES DA ACIDEZ

7.2.1. Bicabornato e outros alcalinos

Princípio: a adição de substâncias alcalinas ao leite têm como objetivo mascarar uma má qualidade
do produto, pela neutralização da acidez de forma a produzir uma estabilidade da proteína (Figura
23).
Procedimento(ILTC, 1993): pipetar em tubo de ensaio com rosca, 5mL de leite + 5mL da mistura
álcool-éter acetona (11mL de éter + 7mL de álcool + 0,l mL de acetona); após fechamento do tubo,
invertê-lo até uniformizar a mistura.
Resultados: reação positiva: formação de solução homogénea semi-transparente.
reação negativa: formação de grumos aderentes à parede do tubo.

Figura 23. Teste para bicabornato e outros alcalinos com reação negativa. Acervo próprio.

7.3. RECONSTITUINTES

7.3.1 Amiláceos
Princípio: verifica o desenvolvimento de coloração azulada após o aquecimento e adição da
solução de iodo/iodeto de potássio (lugol) à amostra em presença de amido. O aquecimento
promove a abertura da cadeia helicoidal da molécula do amido, e permite a absorção do iodo, com
o desenvolvimento da coloração característica após resfriamento (Figura 24).
Procedimento (IN 68/2006): transferir 5mL de leite para um tubo e ferver, resfriar com água
quente e acrescentar cinco gotas de solução lugol.
Resultado: reação positiva: coloração azul-violeta devido à presença de dextrina
reação negativa: inalterado
 26

Figura 24. Teste do amido. Controle positivo seguido por resultados negativos. Acervo próprio.

7.3.2. Cloretos
Princípio: baseia-se na reação do nitrato de prata com os cloretos, em presença de cromato de
potássio como indicador de cor. Quando o teor de cloretos é normal, a quantidade de nitrato de
prata adicionado é excessiva, reagindo com o indicador para a produção de coloração marrom.
Por outro lado, quando o teor de cloreto é elevado, haverá maior consumo de nitrato de prata,
diminuindo a intensidade da coloração marrom. A reação deve desenvolver-se em pH ajustado
(Figura 25).
Procedimento (IN 68/2006) misturar em um tubo de ensaio partes iguais (1mL) de leite, de
cromato de potássio 5% (m/v) S.R. (Reagente A) e de nitrato de prata 10% (m/v) S.R.
(Reagente B).
Resultado: reação positiva: coloração amarelo claro
reação negativa: coloração vermelho-tijolo

Figura 25. Teste para cloretos com reação negativa e positiva, respectivamente. Acervo próprio.

7.3.3.Sacarose
Princípio: a presença de açúcar é detectada pela reação de caramelização deste em meio
fortemente acidificado.
 27

Procedimento: Misturar em um tubo de ensaio 1ml de leite e 1ml de ácido clorídrico p.a.,
agitar até a dissolução e deixar em banho-maria por 2-3 minutos
Resultado positivo: escuro
negativo: inalterado

7.3.4.Álcool etílico
+6
Princípio: na presença de álcool etílico, em meio ácido, ocorre a redução do cromo a
+3
cromo , modificando a coloração da solução sulfocrômica.
Procedimento: medir 100 mL da amostra e transferir para o kitazato, adicionar 10 mL de
antiespumante e misturar bem, transferir para um tubo de ensaio 2 mL da solução
sulfocrômica e mergulhar nessa solução a extremidade da pipeta de Pasteur acoplado ao
kitazato por um tubo de silicone ou látex, de modo a formar um sistema fechado, aquecer a
amostra contida no kitazato mantendo em fervura por 5 minutos.
Resultado positivo: verde
negativo: inalterada ou amarelada

8. ANÁLISES MICROBIOLÓGICAS

8.1. Planos amostrais

Pode-se trabalhar com amostra indicativa ou com amostra representativa, sendo a
primeira aquela composta por um número de unidades amostrais inferior ao estabelecido em
plano de amostral constante na legislação específica. A amostra representativa é aquela
constituída por um determinado número de unidades amostrais, estabelecido de acordo com o
plano de amostragem determinado em legislação. Para amostras representativas é
estabelecido, no caso do leite fluído, a colheita aleatória de cinco (n=5) amostras do mesmo
lote (ANVISA, 2001).

8.2. Colheita e preparo da amostra para análises microbiológicas

Para a colheita de leite cru de latões ou de tanque de resfriamento deve-se proceder a
homogeneização do leite com equipamentos adequados (Figuras 6 e 7) e em seguida passar o
leite para frasco esterilizado. Para leite beneficiado deve-se colher o leite em suas
embalagens próprias e íntegras sendo que em qualquer caso, a amostra deve ser mantida
refrigerada até o momento das análises, que devem ser realizadas o mais rápido possível.
 28

Todo o material a ser utilizado em análises microbiológicas deve estar rigorosamente limpo e
esterilizado.

8.3. Diluições decimais seriadas

A partir da amostra integral, prepara-se a diluição 10-1 pipetando-se 1 mL de leite em
9 mL de solução salina (NaCl) 0,85%; a partir da diluição 10-1 (1:10) preparam-se as diluições
necessárias, 10-2 (1:100), 10-3 (1:1000) e assim sucessivamente (Figuras 26 e 27) (BRASIL,
2003).

Figura 26. Preparo das diluições Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms,2003.
 29

Figura 27. Esquema de diluições para amostras sólidas e líquidas.

 30

8.4. Análises obrigatórias para leite fluído

8.4.1. Contagem Padrão em Placas (CPP) ou Contagem Bacteriana Total (CBT)
Fundamento: baseia-se na semeadura da amostra ou de suas diluições, em ágar padrão para
contagem (Plate Count Agar) seguida de incubação em temperatura de 36 ± 1ºC por 48
horas; devem ser selecionadas três diluições para serem semeadas em duplicatas.
Procedimentos (IN 62/2003): pipetar 1 mL de cada diluição selecionada no centro de placas
de Petri estéreis, e adicionar a cada placa 10 mL de PCA, previamente fundido e mantido a
45°C; homogeneize, sendo essa técnica denominada de semeadura por profundidade ou
pour - plate e, após a solidificação, incuba-se as placas invertidas a 35 ± 1°C / 48 horas. Para
a contagem escolhe-se o par de diluição que apresentou crescimento de 25 a 250 colônias,
multiplicando a média do número de colônias contadas pelo fator de diluição correspondente
e expressando o número de unidades formadoras de colônias (UFC) por mL de leite,
conforme Anexo III da Instrução Normativa 62/2003 (Métodos Analíticos Oficiais para
Análises Microbiológicas para controle de Produtos de Origem Animal e Água).
Exemplo: se o par de diluição selecionado para contagem foi o correspondente a diluição 10-2
(1:100) e as placas apresentaram crescimentos de 150 e 148 colônias, deve-se calcular a
média destas placas=> 150 + 148 = 298 / 2 = 149; em seguida deve-se converter o resultado
para 1mL, ou seja, retornar ao fator de diluição: 149 x 100 = 14900 UFC/mL que será o
resultado final da contagem de AM (Figuras 28 e 29).

Normalidade: Leite cru refrigerado tipo A: Máx. 1,0 x 104UFC/mL(*)

Leite pasteurizado tipo A: n=5; c=2; m=5,0 x 102; M= 1,0 x 103(*)
Leite cru refrigerado: Máximo de 3,0 x 105 (**)
Leite Pasteurizado: n=5; c=2; m=4 x 104; M= 8 x 104(*)
(*) IN 62/2011; (**) IN 07/2016
 31

Figura 28. Esquema de semeadura e crescimento de aeróbios mesófilos para amostras sólidos e líquidos.

Figura 29. Esquema de semeadura e crescimento de aeróbios mesófilos. Adaptado de Madigan et al., Brock
Biology of Microorganisms, 2003.
 32

8.4.2. Número Mais Provável de Coliformes a 30/35°C (NMP)

Princípio: a presença destes microrganismos em contagens acima dos padrões estabelecidos
indica contaminação ambiental e possível presença de microrganismos patogênicos; quando
em leite beneficiado pode indicar falhas no processamento térmico (pasteurização) e/ou
recontaminação.
Procedimento (IN 62/2003): utilizar as diluições previamente preparadas; semear 1 mL de
três diluições selecionadas, em triplicata, em tubos contendo 9 mL de Caldo Verde Brilhante
Bile 2% Lactose (CVBL), contendo tubos de fermentação (Durhan). Obter ao final, nove
tubos semeados; homogeneizar cuidadosamente e incubar a 35°C ±1 por 24 a 48 horas. No
resultado positivo há turvação do meio e presença de gás nos tubos de Durhan (figuras 30, 31
e 32). O resultado baseia-se na tabela do Anexo III, da Instrução Normativa 62/2003 e
expresso em NMP/mL.
Normalidade:Leite pasteurizado tipo A: n = 5; c = 0; m < 1 (*)
Leite Pasteurizado: n=5, c=2, m=2, M=4 (*)
(*) IN 62/2011

Figura 30. Esquema de semeadura e crescimento de coliformes totais (NMP) para amostras sólidas e líquidas
 33

Figura 31. Semeadura para coliformes totais em CVLB em triplicata. Acervo próprio/Lipoa/UEL.

Figura 32. Resultado positivo para coliformes totais em CVBL com turvação e formação de gás nos tubos de
Durhan. Acervo próprio.

8.4.3. Número mais provável de coliformes Termotolerantes a 45°C (NMP)

Princípio: altas contagens destes microrganismos indicam condições sanitárias inadequadas
devido à presença de matéria fecal e a possível presença de enteropatógenos, sendo
inaceitável em alimentos e indicadores de graves falhas de higiene; ainda o consumo de
alimentos com altas contagens pode significar riscos de toxinfecção, pois o principal
representante é a bactéria Escherichia coli que pode causar doenças severas nos seres
humanos.
 34

Procedimento (IN 62/2003): A partir de cada um dos tubos positivos no NMP de coliformes
totais, semear uma a duas alçadas em tubo contendo caldo EC e em tubo contendo caldo
Triptona; incubar ambos a 44,5°C (± 0,5°C), por 24-48 horas em banho-maria; após a
incubação verificar (Figura 33):
a) Fermentação da lactose com presença de gás nos tubos de Durhan.
b) Teste da presença do Indol: adicionar ao tubo com caldo triptona, ± 0,3mL de reativo de
Kovacs; o aparecimento de coloração vermelha-escura na camada representa uma reação
positiva (Figura 34).
Considerar como coliforme a 45°C quando ambas as provas apresentarem resultados
positivos. Calcular o NMP de coliformes a 45°C através do número de tubos confirmados,
conforme Anexo III da Instrução Normativa 62/2003.
Normalidade: Leite pasteurizado tipo A (IN 62/2011): n = 5; c = 0; m= ausência
Leite pasteurizado (IN 62/2011): n=5, c=1, m=1, M=2

Figura 33. Esquema de semeadura e crescimento de coliformes termotolerantes 45°C (NMP) para amostras
sólidas e líquidas.
 35

Figura 34. Resultados positivos para coliformes termotolerantes no caldo EC com formação do anel vermelho e
formação de gás em tubo de Durhan no caldo triptona. Acervo próprio.

8.4.4. Pesquisa de Salmonella

Princípios: análise de Salmonella pelo método Internacional Organization for
Standardization ISO 6579:2007 (E), aplica-se em todos os alimentos destinados ao consumo
humano, às ações animais e às amostras do ambiente de fabricação ou manipulação de
alimentos.
Procedimento (ISO 6579/2007): para o pré-enriquecimento, adicionar 25g/ 25 mL da
amostra em 225 mL de água Peptonada Tamponada; homogeneizar e incubar a 37°C por 18
horas; pipetar 1 mL da amostra pré-enriquecida em 10 mL caldo Tetrationato Muller (TT) e
0,1 mL em 10 mL de caldo Rappaport (RP); incubar a amostra em caldo TT a 37°C por 24
horas e o em caldo RP 41°C por 24 horas; realizar esgotamento de alça nos meios XLD e
MLB (opcional) da amostra em caldo TT e em caldo RP; incubar a 37°C por 24 horas
(Figuras 35, 36, 37).
Resultados: Colônia negra com halo translucido
Normalidade: Leite pasteurizado tipo A: n = 5; c = 0; m= ausência
Leite pasteurizado: n = 5; c = 0; m= ausência
 36

Figura 35. Esquema para pesquisa de Salmonella para amostras sólidas e líquidas.

Figura 36. Crescimento de colônias típicas de Salmonella em ágar XLD. Disponível em

http://www.microbiologyinfo.com
 37

Figura 37. Crescimento de colônias típicas de Salmonella em ágar MLCB. Disponível em

http://www.hyserve.com

8.5. Outras análises microbiológicas

8.5.1. Contagem de Bolores e Leveduras

Fundamentos: Baseia-se na verificação da capacidade desses microrganismos se
desenvolverem em meios de cultura com pH próximo a 3,5 e temperatura de incubação de 25
± 1ºC. A utilização de meios acidificados a pH 3,5 ± 0,1 promove seletivamente o
crescimento de fungos, inibindo a maioria das bactérias presentes no alimento.
Procedimento (IN 62/2003): semear as diluições selecionadas em ágar batata glicose,
acidificado até pH 3,5 por meio da adição de 1,5 mL de solução de ácido tartárico 10% para
cada 100 mL de meio, previamente distribuído nas placas (cerca de 15mL). Pipetar 0,1 mL no
centro das placas e com o auxílio de alça de Drigalski espalhar por toda a superfície do meio
até que seja totalmente absorvido, sendo essa metodologia denominada de semeadura por
superfície; incubação sem inverter, a 25 ± 1ºC, por 5 a 7 dias, em incubadora de B.O.D. Para
a contagem deve-se seguir o mesmo procedimento utilizado para aeróbios mesófilos, porém
multiplicar o resultado por 10 (dez) para levar em conta o volume dez vezes menor inoculado
no plaqueamento em superfície. Selecionar o par de placas que apresentaram de 25 a 250
colónias, multiplicando a média do número de colónias contadas pelo fator de diluição
correspondente; os resultados serão expressos em UFC/mL (Figura 38).
Obs.: Não abrir, em hipótese alguma, as placas que contenham crescimento de fungos, para
evitar a contaminação ambiental por meio da dispersão dos seus esporos.
 38

Normalidade: Não há parâmetros legais para leite fluído

Figura 38. Esquema de semeadura e crescimento de Bolores e Levedura para amostras sólidas e líquidas.

8.5.2. Contagem de Microrganismos Psicrotróficos

Princípio: microrganismos psicrotróficos são aqueles que se multiplicam bem, em
temperaturas de refrigeração e considerados deteriorantes, por produzirem proteases e lipases
termoestáveis, ou seja, resistentes aos tratamentos térmicos aplicados ao leite fluído. Essas
enzimas produzem lipólise (sabor e o odor de ranço) e proteólise diminuindo o valor
nutricional do leite, além de prejuízos para a indústria e para o consumidor.
Procedimento (COUSIN et al., 2001): as diluições selecionadas devem ser semeadas em
ágar padrão para contagem (PCA) previamente distribuído nas placas (cerca de 15mL),
utilizando o plaqueamento em superfície com auxílio de alça de Drigalski espalhando todo o
inóculo por toda a superfície do meio até que todo o excesso de líquido seja absorvido. O
volume a ser semeado de cada diluição é de 0,1mL, também em duplicata e a incubação deve
ser em temperatura baixa que pode ser de 7oC/10dias, de 18oC/45 horas ou de 21oC/25horas
com as placas invertidas. Para a contagem, seguir o mesmo procedimento utilizado para
aeróbios mesófilos, porém multiplicar o resultado por 10 (dez) para levar em conta o volume
dez vezes menor inoculado no plaqueamento em superfície (Figuras 39).
 39

Normalidade: de acordo com o Regulamento da Inspeção Industrial e Sanitária de Produtos

de Origem Animal o número de psicrotróficos não deve exceder a 10% do total de aeróbios
mesófilos.

Figura 39. Esquema de semeadura e crescimento de Psicrotróficos para amostras sólidas e líquidas.

8.5.3. Contagem de Staphylococcus coagulase positiva

Princípio: a contagem de estafilococos coagulase positiva pode ser feita com dois objetivos,
sendo um relacionado à saúde pública para confirmar o envolvimento desta bactéria em
surtos de intoxicação alimentar, e outro com o controle da qualidade higiênico sanitária do
processo de produção do leite e derivados, e neste caso a bactéria serve como indicador de
manipulação inadequada e falhas na higienização de equipamentos.
Procedimento (IN 62/2003): utilizar o meio ágar Baird-Parker. Antes do uso, fundir e resfriar
a 50°C; adicionar para cada litro do meio base 50mL de emulsão de gema de ovo a 50% e
3mL de solução aquosa de telurito de potássio a 3,5% esterilizada por filtração; homogeneizar
bem e distribuir em placas, submetendo à teste de esterilidade (incubar a 35oC/24h). O
plaqueamento deve ser por superfície inoculando-se 0,1mL de cada diluição selecionada,
inclusive 0,1mL da amostra integral (sem diluição); incubar as placas invertidas a 36°C ±1
 40

por 30-48 horas; selecionar placas que contenham entre 10-150 colônias; contar as colônias
típicas, negras brilhantes com anel opaco, rodeado por um halo claro transparente,
destacando-se sobre a opacidade do meio; contar também as colônias atípicas, acinzentadas
ou negras brilhantes sem halo ou com apenas um dos halos. Após a seleção de 3-5 colônias
típicas e atípicas de cada placa, semear em tubos contendo caldo cérebro-coração (BHI),
incubados a 35°C por 24 horas; a partir deste caldo deve-se efetuar a prova para pesquisa da
presença de coagulase. Para a pesquisa da presença de coagulase deve-se transferir 0,2 mL de
cultivo para tubos contendo 0,5mL de plasma de coelho oxalatado; incubar a 35°C por 6 horas
e verificar a presença de coagulação (reação positiva); quando negativa, reincubar até 12
horas (Figuras 40, 41 e 42). Verificar a presença de coágulos, considerando:
Reação 1+: coágulo pequeno e desorganizado
Reação 2+: coágulo pequeno e organizado
Reação 3+: coágulo grande e organizado
Reação 4+: coagulação de todo o conteúdo do tubo (não se desprende se o tubo é
invertido) *Se a coagulação for do tipo 3+ e 4+, considerar positivo para S. aureus.
A partir da cultura feita no caldo BHI, realizar testes complementares: coloração de Gram e
prova de catalase; Para realização da prova de catalase, pingar uma gota de peróxido de
hidrogênio sobre a colônia a ser testada e observar se houve formação de bolhas. Se sim, o
teste é positivo, se não, é negativo;
Resultado: quando todas as colônias repicadas no caldo BHI forem confirmadas nos testes, o
resultado final da contagem será igual ao número obtido na contagem inicial. Quando não se
confirmam todas as colônias, calcular o resultado final com a fórmula: R = C x c x d / r, sendo
R = Resultado; C = número de colônias contadas; c = número de colônias confirmadas; r =
número de colônias repicadas; d = diluição usada.
Exemplo: Diluição 10-2 = 30 colônias contadas, das quais 20 eram típicas e 10 atípicas. Para
confirmação, foram repicadas 5 colônias de cada tipo. Quatro colônias típicas e duas atípicas
apresentaram resultado positivo nos testes confirmativos. Aplicando-se a fórmula para as
típicas: RT = 20x4x100/5 = 1600. Para as atípicas: RA= 10x2x100/5 = 400. O resultado final é
a soma: 1600 + 400 = 2000 = 2,0 x 103 UFC/mL/g.
Normalidade: Não há parâmetros legais para leite fluído
 41

Figura 40. Esquema de semeadura e crescimento de Staphylococus coagulase positiva para amostras sólidas e
líquidas.

Figura 41. Crescimento de colônias típicas de estafilococos em ágar Baird-Parker

 42

Figura 42. Prova da coagulase para estafilococos sendo A um resultado positivo (coagulação) e B negativo.
Disponível em: <www.interlabdist.com.br>.

8.5.4. Detecção de L. monocytogenes

Princípios: Detecção de L. monocytogenes pelo método BAM da US Food and Drug
Administration (FDA) descrito no Bacteriological Analitycal Manual (Hitchns, 2003), aplica-
se a todos os alimentos.
Procedimento (Hitchns, 2003): Adicionar 25g/25mL de amostra para 225mL de caldo de
enriquecimento para Listeria tamponada (LEB) sem os agentes seletivos; homogeneizar e
incubar a 30°C por 4 horas; adicionar 50 uL dos agentes seletivos e incubar a 30° por 44
horas; realizar esgotamento de alça da amostra enriquecida no LEB para o ágar Oxford (OX);
incubar por 35°C de 24-48 horas e observar se existe colônias típicas (Figuras 43, 44).
Resultados: colônia translucida com halo negro.
Normalidade: Não há parâmetros legais para leite fluído
 43

Figura 43. Esquema para pesquisa de L.monocytogenes para amostras sólidas e líquidas.

Figura 44. Crescimento de colônias típicas de L.monocytogenes em ágar oxford. Disponível em

http://www.eolabs.com
 44

9. OBTENÇÃO DE LEITE COM QUALIDADE

UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA-UnB

FACULDADE DE AGRONOMIA E MEDICINA VETERINÁRIA

Manual de Boas Práticas de

Produção de leite e Fabricação de
Queijo de Búfala

Brasília – DF/2016
 45

Manual de Boas Práticas de Produção do Leite

e Fabricação de Queijo de Búfala

Janaína Wanderley Pimentel

Graduanda em Medicina Veterinário da Universidade de Brasília

Nayara Dantas Condé

Graduanda em Medicina Veterinário da Universidade de Brasília

Brasília–DF
2016
 46

Apresentação

A produção de alimentos para toda a população começa na propriedade rural. Para que
a indústria possa produzir um alimento seguro (saudável), é necessário que receba uma
matéria-prima com a menor contaminação possível.

Por isso, a segurança e a qualidade dos alimentos produzidos dependem diretamente

do comprometimento do produtor rural. Dependendo dos cuidados tomados na produção dos
alimentos, haverá maior ou menor possibilidade de riscos à saúde do consumidor.

Esta cartilha dá uma visão geral sobre o que são os perigos da cadeia agroalimentar do
leite e da fabricação de queijos de búfalas.
 47

Conteúdo

Local e instalações.……………………………………………………………………..28

Ordenhador……………………………………………………………………………....28

Saúde do úbere…………………………………………………………………………28

Linha de ordenha………………………………………………………………………..30

Preparação para ordenha………………………………………………………………30

Ordenha…………………………………………………………………………………..30

Ações após a ordenha………………………………………………………………….31

Limpeza dos equipamentos……………………………………………………………32

Recepção do leite do fornecedor………………………………………………………32

Limpeza dos equipamentos do laticínio………………………………………………34

Manipuladores…………………………………………………………………………...34

Pasteurização……………………………………………………………………………35

Limpeza da câmara fria…………………………………………………………………36

 48

Local e Instalações

 O local deve possuir água de boa qualidade, em quantidade suficiente para

realização de todas as atividades de limpeza das instalações. Segundo a IN62 MAPA, a fonte
de abastecimento deve assegurar um volume disponível de 100L por animal a ordenhar e 6L
apara cada litro de leite produzido.

 A área deve ser longe de locais com mau cheiro ou que favoreçam o
desenvolvimento de moscas e outras pragas.

Ordenhador

 Entre as responsabilidades do ordenhador, destacam-se:

 cumprimento dos horários de ordenha
 preparação das instalações
 acompanhamento da saúde das búfalas para informar ao
proprietário qualquer alteração realização da ordenha

Saúde do Úbere

 Sempre monitorar a saúde do úbere das búfalas realizando Califórnia Mastite

Teste (CMT)* mensalmente em todas as búfalas para identificação dos animais com mastite
subclínica.
 49

Quadro 1: Resultado do teste CMT.

Resultado do CMT

Negativo Não há formação de gel na mistura do leite com a solução CMT

Traço Há instantânea formação de gel na solução, desaparecendo

muito rápido. Não há alteração na consistência da solução.
(falso positivo)

Fracamente Há rápida formação de gel no centro da solução, que

desaparece em seguida. Há uma leve alteração na consistência
positivo (+)
da solução.
Positivo (++) Há formação de gel bem visível na solução, tendendo ficar
mais fraca se continuar agitando. Há alteração na consistência
da solução.
Fortemente Há forte formação de gel na solução, não desaparecendo
mesmo após algum tempo. Há forte alteração na consistência
positivo (+++)
da mistura.
*O CMT é o teste mais comum e de fácil realização, sendo necessário utilizar uma raquete própria e
a solução CMT para fazê-lo, que podem ser adquiridos em lojas agropecuárias.

 Faça o teste da caneca de fundo preto, a partir dos três primeiros jatos de cada
teto, para diagnóstico da mastite clínica em todas as vacas e em todas as ordenhas.

Quadro 2: Resultado do Teste da Caneca de Fundo Preto.

Resultado do Teste da Caneca de Fundo Preto

Negativo Leite normal

Positivo Alteração no leite, como grumos, pus, presença de sangue ou coloração

alterada.

 Se identificar alterações no leite ou úbere, indicativos de mastite clínica faça o

descarte do leite e o tratamento do animal
 50

Linha de ordenha

 A ordem com que as vacas são ordenhadas é chamada de linha de ordenha.

Esta é geralmente definida com base no diagnóstico de mastite, realizando a ordenha na
seguinte sequência:
 Búfalas sem mastite
 Búfalas com mastite subclínica (descartar o leite)
 Búfalas com mastite clínica (descartar o leite)

Preparação para a ordenha

 As búfalas devem ser peiadas para maior segurança do ordenhador evitando

assim risco de acidentes com coices.

 Nos casos em que os tetos estiverem muito sujos, é necessário que sejam
lavados. Direcione o jato de água para o teto, tenha cuidado para não molhar o úbere da vaca.
Ao molhar o úbere, aumenta-se o risco de que a água suja da lavagem escorra para a teteira,
contaminando o leite.
 Realize o pré-dipping, limpeza dos tetos antes da ordenha, com solução clorada
a 750 ppm (misturar 75 mL de água sanitária em 2 litros de água) usando o copo aplicador.

 Depois da aplicação deixe a solução agir por 30 segundos e então, seque os

tetos com papel toalha.

Ordenha

 Verificar sempre o correto posicionamento do conjunto de teteiras para evitar

entrada de ar e riscos de contaminação do leite ou dos tetos.

 Nunca puxe as teteiras e nem faça pressão com as mãos no conjunto de

ordenha antes de cortar o vácuo. Isso pode ferir os tetos das búfalas.
 51

 Realizar higienização das teteiras entre ordenhas de animais, por imersão em

solução clorada a 750 ppm.

Ações após a ordenha

 Realizar o pós-dipping com solução de iodo glicerinado a 0,5% em toda a

superfície do teto.

Quadro 3: Cálculo para preparação de solução de iodo glicerinado.

Como calcular a concentração para sempre ter um volume final de 0,5L de

iodo glicerinado

Substituir a concentração de Iodo (2%, 5%, 10%) dependendo de qual será

usado para a diluição.

Volume que será usado de iodo.

Completar o volume que será uso de iodo com água e colocar um pouco de
glicerina apenas aumentar a viscosidade.

 Forneça alimento para a búfala logo após sua saída da sala de ordenha. Ao
oferecer o alimento diminuímos a probabilidade de que ela se deite. Neste tempo, o esfíncter
do teto fechará, diminuindo o risco de mastite ambiental.
 52

Limpeza dos equipamentos

 Imediatamente após a ordenha, deve-se realizar a limpeza das instalações e dos

equipamentos.

 Os baldes e os utensílios deverão ser lavados com água corrente e detergente

alcalino clorado (sugere-se SH 3000 Plus – Qualimilk - diluição segundo o fabricante).
Depois de lavados, coloque-os virados para baixo em local limpo, para secarem naturalmente.

 As teteiras devem ser lavadas ao final de cada ordenha com escova apropriada
e detergente alcalino clorado (sugere-se SH 3000 Plus – Qualimilk - diluição segundo o
fabricante)

Recepção do leite do fornecedor

 Realizar o teste do alizarol do leite de cada latão recebido. Em qualquer

recipiente meça 1,0 mL da solução de alizarol e 1,0 mL do leite a ser testado, misture-os e
interprete o resultado de acordo com o quadro abaixo:

Quadro 4: Resultado do Teste de Alizarol.

Resultado do Teste de Alizarol

Leite normal Coloração rosada ou cor de tijolo; pode haver a formação de

grumos finos.

Leite ácido Coloração amarela; com formação de grumos bem evidentes.

Leite alcalino Coloração arroxeada ou violeta; sem formação de grumos. (pode

ser um indicativo da presença de água, leite originário de animais
com mamite ou leite adicionado de redutores como bicarbonato
de sódio).
 53

 Realizar o teste Dornic no conjunto de leite. Adicionar 10 mL de leite e três a

quatro gotas de fenolftaleína a um tubo de ensaio ou recipiente devidamente higienizado.
Medir 1,4mL de solução dornic e juntar à mistura do leite e fenolftaleína; agitar até misturar
completamente. A partir daí pode-se ir gotejando a solução dornic até ficar levemente rosa
(comparada com o branco).

Quadro 5: Resultado do Teste Dornic.

Resultado do Teste Dornic

Quando ocorrer alteração da cor para levemente rosa (usar um tubo só com leite
para comparar), parar de adicionar a solução Dornic e verificar o volume utilizado;
para cada 0,1mL de solução Dornic corresponderá a 1°D.

Boas Práticas no Laticínio

Limpeza dos equipamentos do laticínio

 Todos os equipamentos devem ser lavados sempre ao final do dia de trabalho.

 Deve ser utilizado detergente alcalino (sugestão: Qualimilk 300) na diluição

recomendada pelo fabricante.

 É indispensável a remoção mecânica das sujidades com o auxilio de esponja

dupla face e escova, sempre novos, e reservados para utilização somente na higiene dos
equipamentos.

 Após a aplicação do detergente e limpeza dos utensílios, deve ser realizado o

enxágue com água abundantemente.

 Nas mesa e no tanque de pasteurização pode ser despejado água quente para
auxiliar o enxágue e remoção de resíduos de gordura.
 54

 As formas de queijos devem ser lavadas segundo as orientações anteriores e

colocadas para secar em prateleiras telada, viradas para baixo para uma secagem total da
água.

Manipuladores

 Os manipuladores devem sempre estar vestidos adequadamente, com roupas e

botas brancas.
 É indispensável o correto uso de touca e máscara pelos manipuladores e por
qualquer pessoa que entre nas instalações do laticínio.

 A higiene das mãos devem ser realizada sempre que:

 iniciar o turno de trabalho.
 antes do preparo dos produtos.
 antes de manipular a massa.
 após manipular equipamentos não higienizados.
 se sair e voltar para o laticinio.
 Sempre que utilizar o banheiro.

 Manter frasco com álcool gel à disposição dos funcionários e de outras pessoas
que adentrem as instalações de produção.

 As mãos devem ser lavadas seguindo o esquema abaixo:

 55

Figura 1: Esquema de lavagem adequada das mãos.

Fonte: Organização Mundial da Saúde.

http://www.paho.org/bra/index.php?option=com_content&view=article&id=5077:higienizacao-
correta-das-maos-e-fundamental-para-garantir-seguranca-do-paciente&Itemid=816
 56

Pasteurização

 Deve ser realizada com a pasteurizadora adequadamente limpa.

 A pasteurização deve sempre ser conduzida em tanque fechado afim de evitar

contaminações de qualquer natureza.

 O tempo e a temperatura de pasteurização devem ser rigorosamente

respeitados: ápos atingir 65 oC contar o tempo de 30 minutos.

 A temperatura deve ser constantemente monitorada com o uso de termômetro.

Limpeza da câmara fria

 Recomenda-se que a câmara fria passe por uma limpeza geral, pelo menos uma
vez a cada semana ou sempre que julgar necessário, dependendo da utilização.

 Devem ser retirados todos os produtos, as prateleiras e os equipamentos que

estiverem na câmara fria para uma adequada higienização.

 A limpeza deve ser com detergente alcalino neutro (QualiMilk 300) na diluição
indicada pelo fabricante e usando esponja e escova apropriados.

 Após a lavagem esperar secar por tempo adequada, para diminuir a umidade no
local.

 Diariamente, devem ser observadas boas práticas de armazenamento

respeitando a capacidade da câmara fria e a perfeita circulação do ar frio.
BIBLIOGRAFIA CONSULTADA/RECOMENDADA
 57

AZJENTAL et al., 1993;

BEHMER, M. L. A.; Tecnologia do Leite: leite, manteiga, queijo, caseína, sorvetes e

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www.anvisa.gov.br/alimentos/comissoes/tecno_lista_alega. htm>. Acesso em: 20 mar.
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Bolor, listeria