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BQI 450 – BIOQUÍMICA DE PROTEÍNAS – UFV

Prof. Ciro Rossi Proteômica | Sumário BQI 450 – BIOQUÍMICA DE PROTEÍNAS – UFV
Prof. Ciro Rossi

Bioquímica de Proteínas
Introdução

Expressão de proteína

Proteômica Identificação de proteínas

Expressão, identificação e caracterização

Prof. Ciro César Rossi

Universidade Federal de Viçosa
Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular – sala 208
ciro.rossi@ufv.br

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Proteômica | Introdução BQI 450 – BIOQUÍMICA DE PROTEÍNAS – UFV

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Fungos
Separação
filamentosos e
leveduras
• Microrganismos, como leveduras, bactérias e
algas unicelulares são fundamentais em
diversas aplicações industriais de síntese de
enzimas e outras proteínas
• O crescimento rápido e alta produtividade os Bactérias
tornam “fábricas microscópicas” eficientes na
Preparo da amostra Extração Purificação Identificação / Caracterização Análise de produção de proteínas recombinantes.
dados

Algas unicelulares

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• Com a tecnologia do DNA recombinante, ou

clonagem gênica, o gene codificante da
proteína de interesse pode ser inserido em um
microrganismo superprodutor

• O gene é inserido na célula alvo em um vetor,

geralmente um plasmídeo, que é capaz de
autorreplicar
Principais sistemas de expressão utilizados na produção de biofarmacêuticos

Baeshen et al. 2014

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• O cultivo em larga escala de microrganismos pode

ser feito em biorreatores
• Vetores de expressão podem ser induzidos
para aumentar a produção da proteína de • Nesses recipientes com capacidades de
interesse centenas a milhares de litros, os microrganismos
de interesse são cultivados em condições ideais
• O gene de interesse pode ser marcado
Sítio de e constantes de pH, aeração, agitação e
clivagem
com um sinal de exportação, para que a
disponibilidade de nutrientes.
proteína seja secretada (facilitando a
Sítio de purificação)
clonagem • A cauda da proteína também pode
conter peptídeos que facilitem a
purificação, como exemplo na figura:
• O gene malE codifica uma proteína
ligante de maltose
Marca de
seleção

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• Exemplos de produtos proteicos obtidos por clonagem gênica • Exemplos de produtos proteicos obtidos por clonagem gênica

• Vacinas de subunidades
• Utilizam fragmentos antigênicos
que estimulam a resposta imune
• São mais seguras por natureza,
pois, não podem se reproduzir no
receptor.
• Apresentam pouco ou nenhum
material estranho e, portanto,
tendem a produzir menos efeitos
colaterais.

Kirk et al. 2002

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• MALDI-TOF
• Matrix-assisted laser desorption/ionization
time of flight / mass spectrometry
• A amostra é misturada a uma matriz
• Tempo de voo após dessorção e
aplicada (solução salina) a uma
ionização por laser assistida por uma
placa metálica
matriz, seguido por espectrometria de
mass • Uma fonte de laser irradia sobre
a matriz, ionizando-a e
• É uma sofisticação da espectrometria
promovendo a dessorção
de massas, muito usada para
identificar proteínas, comparando-as
com um banco de dados espectral

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• Proteínas e fragmentos são separadas por

aceleração por um campo elétrico, de
acordo com a massa e carga, em um tubo
de vôo a vácuo
• As proteínas são detectadas, gerando
um espectro, que é comparado com um
banco de dados
• A solução contendo a proteína pode ser
tratada com proteases ou reagentes,
produzindo peptídeos menores, com
massas características

Singhal et al. 2015

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Singhal et al. 2015

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Tecnologias baseadas em espectrometria de massas, como o MALDI-TOF, são

as mais utilizadas para se identificar proteínas, mas uma outra técnica de
sequenciamento ainda é utilizada, principalmente para se identifica a
extremidade NT de certas proteínas:

A degradação de Edman

Rossi et al. 2017

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(1) O sequenciamento de Edman utiliza

um composto, o PITC (fenil- (3) O composto resultante pode ser
isotiocianato), que se liga purificado e identificado por
covalentemente ao NT de uma proteína espectrometria de massa

(2) Na presença de um ácido fraco, o

• A técnica pode ser repetida
primeiro aminoácido se desconecta dos
demais aminoácidos da cadeia indefinidamente
• Extremamente laboriosa

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Determinação da estrutura tridimensional de proteínas

• Reação de degradação de Sanger Cristalografia
• É a menos útil, pois só identifica o primeiro
aminoácido NT
• Um reagente de marcação (ex.:
fluorodinitrobenzeno) se liga ao
aminoácido NT
• O peptídeo é hidrolisado e os aminoácidos
resultantes são separados
• Aquele ligado ao marcador (NT) é
identificado
Formação de cristais Determinação do Cálculo Determinação de
em solução salina padrão de difração computacional da um modelo
de raio X dos cristais densidade computacional da
eletrônica da estrutura
proteína tridimensional da
proteína

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Bijelic et al. 2018 Bijelic et al. 2018

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Bioinformática no estudo de proteínas

Bijelic et al. 2018

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Bioinformática no estudo de proteínas Bioinformática no estudo de proteínas

Coleta da sequência da proteína Hfq em

bancos de dados públicos

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Bioinformática no estudo de proteínas Bioinformática no estudo de proteínas

Arquivo em FASTA

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https://www.rcsb.org/3d-view/4JLI

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Modificação | Bibliografia BQI 450 – BIOQUÍMICA DE PROTEÍNAS – UFV

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Nelson, D. L., and M. M. Cox. "Lehninger Principles of Biochemistry, ; International ed." (2016): 612.
Baracat-Pereira, M.C. “Bioquímica de Proteínas: Fundamentos estruturais e funcionais.” Editora UFV (2014)
Baeshen, N. A. et al. (2014). Cell factories for insulin production. Microbial cell factories, 13(1), 1-9.
Kirk, O., Borchert, T. V., & Fuglsang, C. C. (2002). Industrial enzyme applications. Current opinion in biotechnology, 13(4), 345-351.
Opella, Stanley J., and Francesca M. Marassi. "Applications of NMR to membrane proteins." Archives of biochemistry and biophysics 628
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Singhal, N. et al. (2015). MALDI-TOF mass spectrometry: an emerging technology for microbial identification and diagnosis. Frontiers in
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Rossi, C. C. et al. (2017). The oral microbiota of domestic cats harbors a wide variety of Staphylococcus species with zoonotic potential.
Veterinary microbiology, 201, 136-140.

Trebunová, M et al. Basic principles of sample preparation for proteomic analysis. Acta Tecnologica: 4, 25-28 (2018). 10.22306/atec.v4i2.35
Mrácek, J. (2005). Investigation of genome-plastome incompatibility in Oenothera and Passiflora (Doctoral dissertation, Ph. D. Thesis,
Ludwig-Maximilians-Universität, Munich, Germany).
Boguszewska, K., Szewczuk, M., Urbaniak, S., & Karwowski, B. T. (2019). immunoassays in DNA damage and instability detection. Cellular
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Li, D., & Li, J. (2021). Immunologic testing for SARS-CoV-2 infection from the antigen perspective. Journal of clinical microbiology, 59(5),
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Baharvand, H., Fathi, A., Van Hoof, D., & Salekdeh, G. H. (2007). Concise review: trends in stem cell proteomics. Stem Cells, 25(8), 1888-1903.
Wood, V., Lock, A., Harris, M. A., Rutherford, K., Bähler, J., & Oliver, S. G. (2019). Hidden in plain sight: what remains to be discovered in the
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