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Avaliação do potencial de produção de bacteriocinas a partir de bactérias ácido

lácticas visando inibição de microrganismos patogênicos

Conference Paper · September 2016

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Thiago Sidooski Carolina Krebs de Souza

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Avaliação do potencial de produção de bacteriocinas a partir de
bactérias ácido lácticas visando inibição de microrganismos
patogênicos.

T. SIDOOSKI1, C. K. de SOUZA1, S. L. BERTOLI1, S. K. F. YAMAGUCHI1 e L. F. de

CARVALHO1
1
Fundação Universidade Regional de Blumenau, Centro de Ciências Tecnológicas, Departamento de
Engenharia Química
E-mail para contato: eng.sidooski@gmail.com

RESUMO – Bacteriocinas são peptídeos, sintetizados no ribossomo de bactérias, que

apresentam atividade antimicrobiana contra um espectro especifico de bactérias. Nas
últimas décadas as bacteriocinas tornaram-se objeto de pesquisa devido a seu potencial
uso para biopreservação e extensão da vida útil de alimentos. Dentre as bactérias
produtoras de bacteriocinas, as bactérias ácido lácticas, possuem destaque especial por
produzirem bacteriocinas que não são tóxicas e que são facilmente quebradas no
estômago de mamíferos. Dentro deste contexto, este trabalho avaliou o potencial de cepas
de Streptococcus thermophilus e Lactobacilus viridescens para produção de
bacteriocinas. Foram realizadas fermentaçãoes em dois meios enriquecidos para avaliar
a influência dos meios na produção de bacteriocinas. As proteínas resultantes foram
obtidas através de centrifugação e precipitação com sulfato de amônio. A avaliação do
potencial inibitório foi realizada utilizando o método de difusão em placas de ágar.
Verificou-se que os metabólitos produzidos não foram capazes de inibir o crescimento
bacteriano dos microrganismos patógenos estudados. Foram propostas algumas
alterações no método de condução dos experimentos para concluir se as cepas utilizadas
não produzem bacteriocinas ou se os microrganismos testados são resistentes as
bacteriocinas produzidas.

1. INTRODUÇÃO
Segundo Parada et al. (2007), as bactérias láticas (BAL) são caracterizadas como cocos ou
bacilos Gram-positivas, não-aeróbicas mas aerotolerantes, capazes de fermentar carboidratos para a
energia e produção de ácido láctico. BAL são geralmente conhecidas como seguras (Generally
Recognized as Safe - GRAS), e tem um papel importante na preservação de alimentos e produtos
fermentados. Elas podem ser usados como microbiota competitiva natural ou como fermentos
específicos sob condições controladas (Cintas et al., 2001, apud Parada et al., 2007). Algumas dessas
bactérias produzem substâncias de estrutura proteica (tanto proteínas quanto polipeptídios) chamadas
bacteriocinas, que em pequenas quantidades são muito ativos contra microrganismos patógenos
(Klaenhammer, 1993; Beasley et al., 2004).

Bacteriocinas são compostos de cadeias proteicas, também conhecidas como peptídeos, que são
produzidas no ribossomo de bactérias e apresentam atividade bactericida contra um espectro de
bactérias estritamente relacionadas às espécies produtoras. Estima-se que a maior parte das bactérias
existentes produza algum tipo de bacteriocina (Rodriguez et al., 2000; Nascimento et al., 2008).

Embora as bacteriocinas possam ser categorizadas como antibióticos, elas não são. A principal
diferença entre as bacteriocinas e antibióticos é que as bacteriocinas restringem a sua atividade a um
espectro de bactérias pequeno, enquanto os antibióticos têm um espectro de atividade mais amplo.
Além disso, as bacteriocinas são sintetizadas ribossomicamente e produzidas durante a fase preliminar
de crescimento do microrganismo, enquanto os antibióticos são geralmente metabolitos secundários
(Beasley et al., 2004).

As bacteriocinas geralmente apresentam baixa massa molecular (raramente mais de 10 kDa) e

passam por modificação pós-translacional, além disto, podem ser facilmente degradadas por enzimas
proteolíticas, especialmente as proteases do trato gastrointestinal de mamíferos, o que as tornam
seguras para consumo humano (Rodriguez et al., 2000).

Diferentes mecanismos de ação têm sido propostos para bacteriocinas, entre eles a alteração da
atividade enzimática, a inibição da germinação de esporos e inativação de transportadores aniônicos
através da formação de poros seletivos e não seletivos (Abee, 1995 apud Parada et al., 2007; Martinez
e De Matins, 2006, apud Parada et al., 2007). Embora o mecanismo exato de ação das bacteriocinas
permaneça como tema de controvérsia, existe um consenso de que estes peptídeos interrompem
seletivamente as membranas celulares e se acredita que o arranjo estrutural anfipático dos peptídeos
possa desempenhar um papel importante neste mecanismo (Reddy et al., 2004).

A principal aplicação das bacteriocinas destina-se a indústria de alimentos. Segundo Cleveland

et al., (2001), desde que a segurança dos alimentos tornou-se uma preocupação crescente e com
abrangência internacional, a aplicação de peptídeos antimicrobianos de bactérias ácido lácticas, contra
patógenos alimentares alvos sem efeitos tóxicos adversos, tem recebido grande atenção.

Existe uma grande preocupação em relação ao uso de conservantes químicos em alimentos e os

riscos a eles associados (por exemplo, aumento do risco de câncer). Assim sendo, a técnica de
biopreservação dos alimentos torna-se uma alternativa muito atrativa. Todos estes pontos tornam as
aplicações de bacteriocinas na indústria de alimentos bastante diversificadas, visando ser uma
alternativa segura aos conservantes químicos utilizados atualmente. Para que as bacteriocinas possam
ser utilizadas como bioconservantes elas devem possuir algumas características como não afetar as
características sensoriais e a qualidade nutricional do alimento, apresentar termoestabilidade, possuir
um espectro de ação amplo sobre microrganismos patogênicos, devem ser comprovadamente seguras
e não oferecer quaisquer riscos a saúde do consumidor, devendo ainda ser proveniente de cepas
consideradas GRAS (Nascimento et al., 2008, Benitez, 2010, Machado et al., 2011).
 Outro campo de aplicações das bacteriocinas é o campo clínico. Segundo Benitez, 2010, existe
um forte potencial para o uso de bacteriocinas como alternativa aos atuais antibióticos. O crescimento
acelerado e a disseminação de bactérias patogênicas multirresistentes, têm obrigado pesquisadores e
empresas a procurarem métodos alternativos para o tratamento de infecções. Pelo fato de as
bacteriocinas matarem as bactérias através da ruptura da membrana celular, estas são menos
suscetíveis à induzir resistência genética nos microrganismos patógenos alvo, tornando-se um opção
em potencial para o desenvolvimento de novas drogas de combate à infecções.

Além destas aplicações, Benitez, 2010, ainda comenta em seu trabalho que as bacteriocinas
podem ser utilizadas também para o controle de doenças em plantas, que atualmente dependem do
uso extenso de agrotóxicos que são pouco eficazes e muitos poluentes. Gupta e Srivastava (2014),
estudaram a aplicação de um peptídeo antimicrobiano produzido por Lactobacillus plantarum para
combater o crescimento de fungos deteriorantes em grãos.

Em vista do exposto acima, este trabalho teve por objetivo avaliar o potencial de produção de
bacteriocinas das cepas de bactérias ácido lácticas Streptococcus thermophilus e Lactobacilus
viridescens e verificar a força de inibição das bacteriocinas produzidas frente aos microrganismos
patógenos Escherichia coli, Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa.

2. MATERIAIS E MÉTODOS
Os testes foram realizados com duas cepas de bactérias ácido lácticas, Streptococcus
thermophilus e Lactobacilus viridescens. Para produção de bacteriocinas, foram preparados dois
caldos, Brain Heart Infusion (BHI) e Tryptic Soy Broth (TSB), totalizando assim, 4 experimentos.
Ambos os caldos foram enriquecidos com adição de 4 g/L de extrato de levedura, e 20 g/L de glicose.
Foram utilizados na fermentação Erlemeyers contendo 200 mL de cada um dos caldos. As cepas de
BAL utilizadas na fermentação foram previamente propagadas em 2 mL de caldo BHI e TSB para
que as mesmas estivessem metabolicamente ativas. Os Erlemeyers contendo o caldo foram
esterilizados em autoclave e posteriormente inoculados com 2 mL da cepa de BAL ativa. A
fermentação foi realizada em shaker com controle de temperatura, mantido à 37 °C por um período de
48 h e sob agitação constante de 120 RPM.

Após a fermentação, as amostras foram centrifugadas à 5 °C, durante 25 min à 6000 RPM para
separação das células e materiais sólidos do caldo fermentado. Para separação do conteúdo proteico
contido no caldo fermentado, foi feita a adição de sulfato de amônio P.A. ao caldo fermentado até
uma concentração final de 20% m/v. Este procedimento foi realizado sob agitação constante por um
período de 1 h a 4 °C. A solução saturada foi então submetida à centrifugação a 6000 RPM por um
período de 25 min a 4 °C para concentração do conteúdo proteico. Os pelets resultantes foram
suspensas em tampão fosfato pH 7,0, conforme metodologia utilizada por Teixeira et al. (2013) e
mantidas congeladas para posterior uso.
 A atividade antimicrobiana das amostras foi testada com três bactérias: Staphylococcus aureus
(ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25922) e Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), as quais
foram mantidas em BHI adicionado de 10% de glicerol à -20 ºC. Para a realização dos testes, as
bactérias da cultura estoque foram semeadas em placas de ágar nutritivo e incubadas por 24 h a 36 ºC.

Para a preparação do inóculo, de 3 a 4 colônias com a mesma morfologia foram raspadas da

placa de Petri, com o auxílio de uma alça estéril, e suspendidas em 5 mL de solução fisiológica estéril.
A turvação da solução foi verificada para ajuste em 0,5 da escala de McFarland (108 UFC/mL)
(Oplustil, 2004). O meio de cultura foi preparado conforme as instruções do fabricante, sendo
esterilizado em autoclave por 15 min a 120 ºC. O ágar Muller-Hinton foi adicionado em placas de
Petri obtendo-se uma espessura de 4 a 6 mm. O inóculo bacteriano preparado foi semeado na
superfície do ágar Muller-Hinton com auxílio de um swab estéril. Uma alíquota de 50 uL das
amostras diluídas foram aplicadas em orifícios de aproximadamente de 7 mm de diâmetro, no ágar.
Este orifício foi realizado com auxílio de um furador de aço estéril. Foi deixado um afastamento de no
mínimo 15 mm entre um poço e outro.

As placas semeadas em triplicata foram incubadas a 35 ºC durante 24 h em estufa

bacteriológica . Após este período, foi observada a homogeneidade das placas e a leituras dos halos de
inibição bacteriana. Essa técnica consiste em medir o diâmetro, em milímetros com uma régua. A
força de inibição é medida conforme a metodologia proposta por Aslim et al. (2005), no qual os halos
de inibição são classificados em relação ao seu diâmetro, conforme segue:

– Neutro, não houve inibição;

+ Fraco, zona de inibição de 8,0-10,0 mm;

++ Intermediário, de inibição de 10,0-20,0 mm;

+++ Forte, de inibição de 20,0-30,0 mm.

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Após o período 48 h, onde os meios em estudo fermentaram com as duas diferentes cepas de
BAL, foi possível observar que a fermentação ocorreu normalmente, havendo um bom crescimento
celular e uma turvação adequada do meio.

Na fase do estudo de separação das proteínas do meio de fermentação, após a precipitação

com sulfato de amônio seguida de centrifugação, foi possível separar um pelet sólido contendo o
filtrado bruto da cepa de Streptococcus thermophilus nos caldo BHI e TSB. Já para a cepa de
Lactobacilus viridescens foi possível separar o conteúdo sólido apenas para o fermentado do caldo
BHI. A fermentação no caldo TSB não gerou nenhum precipitado sólido, indicando assim que pode
não ter havido a secreção de metabólitos como proteínas ou bacteriocinas para o meio durante a
fermentação ou que os metabólitos produzidos não apresentaram uma quantidade suficiente para
formar um pelet sólido ao final da centrifugação.

Já na fase de análise do potencial de inibição das bacteriocinas, foi possível observar que as
bactérias patogênicas apresentaram um bom crescimento após o período de 24 h, formando uma
camada visível de colônias que cobriram a placa quase em sua total extensão. No entanto, não foi
verificado em nenhuma das 9 placas analisadas a formação de um halo, obtendo-se assim uma
classificação de efeito neutro (-), como mostrado na Figura 1.

Figura 1: Placas de petri contendo P. aeruginosa (esquerda), E. coli (centro) e S. aureus (direita).

Nota-se na Figura 1 que a placa contendo o microrganismo P. aeruginosa, apresentou uma

coloração esverdeada ao redor do poço onde foi colocada a solução contendo as proteínas da cepa de
L. viridescens cultivada em TSB. Essa coloração pode ser resultante de uma iteração entre as
proteínas produzidas em conjunto com o ágar e os metabólitos das colônias de P. aeruginosa.

Avaliando a metodologia aplicada e os resultados obtidos, três hipóteses podem ser

consideradas:

a) Não houve produção de bacteriocinas nas condições de fermentação utilizadas;

b) As bacteriocinas produzidas não estavam presentes em concentração suficiente para inibir o

crescimento dos microrganismos patógenos;

c) As bacteriocinas produzidas não possuem efeito inibitório frente aos microrganismos testados.

A literatura disponível a cerca deste tema, diz que a maioria das bactérias produz algum tipo de
bacteriocina durante o processo fermentativo como um metabólito secundário. A mesma diz ainda
que as bacteriocinas produzidas possuem um efeito antimicrobiano em um range de bactérias
específicas, podendo assim, não possuir efeito frente aos microrganismos testados e apresentar efeito
frente a algum outro microrganismo.
 Avaliando o procedimento experimental utilizado, verificamos que em uma primeira fase de
separação da suspensão de interesse, obteve-se pouca quantidade de pelet, sendo posteriormente
este diluído em 2 mL de solução tampão. Após este processo, não se sabe a concentração total de
proteínas suspensas na solução tampão. Além disto, para cada poço foram utilizadas 50 uL desta
solução, assim sendo, a hipótese “b” mostra-se bastante plausível.

Como alternativa à metodologia utilizada neste estudo, após o congelamento das amostras de
proteína contidas no tampão fosfato, pode ser realizada uma liofilização destas amostras, obtendo-se
assim um sólido de proteínas que pode ser quantificado, e posteriormente, pode-se produzir uma
solução com concentração conhecida para verificar se a concentração de trabalho é suficiente para
inibir o crescimento dos microrganismos patógenos.

Uma vez que mesmo em altas concentrações de proteína não ocorra a formação de um halo de
inibição, deve-se considerar alternativas para as hipóteses “a” e “c”.

4. CONCLUSÃO
O uso de bacteriocinas como alternativa natural aos produtos químicos utilizados para
conservação de alimentos e combate as pragas em lavouras, mostra-se promissora e com grande
potencial de crescimento.

Não foi possível constatar a produção de bacteriocinas com efeito inibitório frente aos
microrganismos patógenos testados.

A metodologia utilizada no desenvolvimento deste trabalho mostrou algumas oportunidades

de melhoria, a fim de se verificar todas as hipóteses levantadas e confirmar ou não o potencial das
cepas de BAL testadas para produzir bacteriocinas com efeito inibitório frente aos microrganismos
patógenos testados.

5. AGRADECIMENTOS
A FURB – Fundação Universidade Regional de Blumenau pela estrutura utilizada e a CAPES
– Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior pela bolsa de estudos

6. REFERÊNCIAS
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