UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO”

FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRONÔMICAS

GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA DE BIOPROCESSOS E BIOTECNOLOGIA

THIAGO BARCAÇA MARIANO

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA SOBRE A PRODUÇÃO DE ESPINOSINA ATRAVÉS

DO PROCESSO FERMENTATIVO DA SACCHAROPOLYSPORA SPINOSA

BOTUCATU/SP
2023
 THIAGO BARCAÇA MARIANO

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA SOBRE A PRODUÇÃO DE ESPINOSINA ATRAVÉS

DO PROCESSO FERMENTATIVO DA SACCHAROPOLYSPORA SPINOSA

Versão Original

Trabalho de conclusão de curso

apresentado à Faculdade de Ciências
Agronômicas da Unesp Câmpus de
Botucatu, como requisito parcial para a
conclusão do curso de graduação em
Engenharia de Bioprocessos e
Biotecnologia, sob orientação da Prof.
Dr. Adalberto Pessoa Júnior.
BOTUCATU/SP
2023
Nome: MARIANO, Thiago Barcaça

Revisão bibliográfica sobre a produção de espinosina através do processo fermentativo

da Saccharopolvspora spinosa

Monografia apresentada à Faculdade de

Ciências Agronômicas da Unesp -
Câmpus de Botucatu, como requisito
parcial para a conclusão do curso de
graduação em Engenharia de
Bioprocessos e Biotecnologia.

Aprovado em: ___ / ___ / _____

Banca Examinadora

Prof. Dr. __________________ Instituição: __________________

Julgamento: __________________ Assinatura: __________________

Prof. Dr. __________________ Instituição: __________________

Julgamento: __________________ Assinatura: __________________

Prof. Dr. __________________ Instituição: __________________

Julgamento: __________________ Assinatura: __________________

 DEDICATÓRIA

Dedico este trabalho, primeiramente a Deus, por me dar força e saúde para continuar;
aos meus pais, Edléia Regina Barcaça Mariano e Gilberto José Mariano, por todo amor,
trabalho duro e dedicação que tiveram, todos esses anos de graduação; À minha irmã,
Tainá Mariano, que sempre foi um exemplo de vida para mim; À minha Tia/Mãe
Sandrinéia Aparecida Barcaça, por toda ajuda afetiva e emocional (mesmo nas maiores
dificuldades acreditou no meu sonho); Aos meus amigos, que de forma indireta me
fizeram persistir, e por fim a todos os professores que me motivaram a ser fisicamente e
intelectualmente mais forte e capaz.

Também, de forma saudosa, ao curso de Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia da

UNESP de Botucatu, por todos os ensinamentos e experiências adquiridas durantes os
anos de aprendizagem.
 AGRADECIMENTOS

Ao professor Dr. Adalberto Pessoa Junior pela sua orientação e ensinamentos que
auxiliaram no meu crescimento profissional e pessoal.

Aos colegas do Laboratório de Bioprocessos (LabBio, EEL-USP). por toda ajuda e

orientação no começo de minha jornada na área de fermentações.

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelos apoios

financeiros concedidos em forma de Auxílio à Pesquisa na minha formação quanto
pesquisadora na graduação.

Por fim, a FCA-UNESP por conceder todo conhecimento necessário para realização
deste trabalho.
 Sumário

1. Introdução 10
2. Revisão teórica 11
2.1 Saccharopolyspora spinosa 11
2.1.1 Fisiologia do microrganismo 11
2.2 Biomolécula de interesse 12
2.2.1 Estrutura química 13
2.2.2 Mecanismos de ação 15
2.3 Processos fermentativo 17
2.3.1 Meio de cultura, substrato e processo 17
2.3.2 Purificação da molécula 18
3. Metodologia de pesquisa 19
4. Referências 20
 Resumo
Este estudo aborda a revisão teórica da produção da espinosina, um composto bioativo
com propriedades inseticidas (Biocidas), obtido a partir da bactéria Saccharopolyspora
spinosa. A pesquisa destaca a importância dessa descoberta na biotecnologia agrícola,
enfatizando a seletividade da espinosina para pragas e seu menor impacto ambiental em
comparação com inseticidas convencionais. O trabalho também explora a otimização do
processo fermentativo e a aplicação de técnicas de engenharia genética para aumentar a
produção do composto. A metodologia incluiu a busca de referências em plataformas
acadêmicas, análise crítica dos estudos selecionados e a síntese dos principais achados.
Os dados obtidos fornecem uma base sólida para a aplicação prática da espinosina na
agricultura sustentável.

Palavras-chave: Saccharopolyspora spinosa; Espinosina; Biocida; Biotecnologia

Agrícola.
 Abstract
This study addresses the theoretical review of the production of spinosyn, a bioactive
compound with insecticidal properties, obtained from the bacterium Saccharopolyspora
spinosa. The research highlights the importance of this discovery in agricultural
biotechnology, emphasizing spinosyn's selectivity for indirection and its lower
environmental impact compared to conventional insecticides. The work also explores
the optimization of the fermentation process and the application of genetic engineering
techniques to increase the production of the compound. The methodology included
searching for references on academic platforms, critical analysis of selected studies and
synthesis of the main findings. The data obtained provide a solid basis for the practical
application of spinosyn in sustainable agriculture.

Keywords: Saccharopolyspora spinosa; Spinosyn; Biocide; Agricultural

Biotechnology.
 10

1. Introdução

A identificação da Saccharopolyspora spinosa como produtora de espinosina

marca um salto significativo na história da biotecnologia agrícola. Esta descoberta,
liderada pelo Dr. R. B. Sparks e sua equipe na Dow AgroSciences, desencadeou um
avanço notável no campo do controle de pragas na agricultura. A espinosina, um
composto bioativo derivado dessa bactéria, provou-se altamente eficaz no controle de
pragas e seletiva em relação aos insetos-alvo, minimizando os impactos sobre
organismos não-alvo e o meio ambiente (SPARKS et al., 1982; SALGADO, 1998).
Essa descoberta não apenas catalisou a produção de espinosina em escala
comercial, mas também impulsionou avanços substanciais na biotecnologia agrícola. Ao
longo dos anos, o processo de fermentação da Saccharopolyspora spinosa foi
aprimorado, refinando as condições ideais de cultivo e os requisitos nutricionais para
otimizar a produção de espinosina. A engenharia genética também desempenha um
papel crucial nesse contexto, permitindo modificações na bactéria para aumentar a
produção de espinosina ou melhorar características específicas do processo fermentativo
(ZHAO et al., 2012).
Além dos benefícios práticos, a utilização da Saccharopolyspora spinosa em
processos fermentativos está alinhada com a crescente tendência de buscar alternativas
sustentáveis na agricultura. A produção biotecnológica da biomolécula reduz a
dependência de produtos químicos agressivos e contribui para práticas agrícolas mais
equilibradas e ecologicamente responsáveis (LING et al., 2017).
Ao ser identificada como um composto capaz de atuar no sistema nervoso dos
insetos, promovendo a paralisia e, consequentemente, a morte das pragas-alvo, mostrou
mais uma vez avanço significativo em relação aos inseticidas tradicionais (SPARKS et
al., 1982). Esta característica neurotóxica seletiva, focada principalmente nos insetos,
contrasta com a ação indiscriminada dos inseticidas convencionais, os quais
frequentemente não distinguem entre pragas e organismos benéficos.
A seletividade da molécula também se traduziu em um menor impacto sobre a
saúde humana e animais não-alvo, marcando uma melhoria substancial em relação aos
inseticidas sintéticos. Muitos destes últimos estavam associados a riscos para a saúde e à
contaminação de alimentos. A escolha de uma abordagem biotecnológica para a
produção do composto, em detrimento da síntese química, constituiu um passo
 11

fundamental na redução do uso de produtos químicos agressivos e na mitigação dos

impactos ambientais associados à produção de inseticidas.

2. Revisão teórica
2.1. Saccharopolys
pora spinosa
2.1.1. Fisiologia do microrganismo
A análise da fisiologia, parte da taxonomia, que evidencia uma espécie
pertencente ao gênero Saccharopolyspora, que, por sua vez, faz parte da família
Pseudonocardiaceae, que tem seu crescimento favorável em temperaturas de 15 a 37 °C
(MERTZ e YAO, 1990). Formada do latim “Saccharopolyspora”, que significa açúcar
com esporos e “spinosa” referente à espinhos (THOMPSON et al., 1997), esta bactéria é
classificada como Gram-positiva, o que significa que possui uma parede celular espessa
composta principalmente de peptidoglicano.
É importante notar que, assim como outros membros de seu gênero, a parede
celular de S. spinosa se destaca pela ausência de ácidos micólicos. Estes são ácidos
graxos β-hidroxilados de cadeia longa substituídos por α, característicos de algumas
espécies de bactérias Gram-positivas, como já descrito anteriormente. Esta distinção na
composição da parede celular implica em diferenças significativas na estrutura e nas
propriedades da membrana entre S. spinosa e outras linhagens bacterianas, contribuindo
para suas características únicas e funcionalidades específicas (ALEXANDER et al.,
2000). Esta complexidade arquitetônica da parede celular desempenha um papel crítico
na fisiologia e no comportamento, e compreendê-la é essencial para a exploração de
suas potencialidades em diversas aplicações biotecnológicas.
Além disso, S. spinosa é uma bactéria anaeróbica facultativa, o que significa que
pode crescer em ambientes com ou sem oxigênio (KIRST et al., 2002). O seu formato
filamentoso é uma das características morfológicas distintivas, e ela possui a capacidade
de formar esporos, uma estratégia de sobrevivência em condições ambientais adversas,
como destacada na figura 1.
 12

Figura 1. Imagem de microscopia eletrônica de varredura de hifas de S.

spinosa circundadas por bainha espinhosa (esquerda) e cadeias
semelhantes a contas (direita).

Fonte: Dow AgroSciences

A S. spinosa é onipresente, o que significa que pode ser encontrada em uma

variedade de habitats. Ela é especialmente comum em solos, onde desempenha um
papel importante na decomposição da matéria orgânica e na ciclagem de nutrientes.
Além disso, pode ser isolada em uma variedade de ambientes naturais, desde florestas
até ambientes aquáticos. Por esses motivos seu crescimento em meio de cultura como
ágar, ágar BHI, caldo de fermentação, entre outros, demonstram boa condição de
crescimento (WALDRON et al., 2001).

2.2. Biomolécula
de interesse
Especificamente para o controle de pragas, aproximadamente 8% dos inseticidas
utilizados na atualidade possuem os microrganismos como fonte ou equivalente
sintético. A espinosina é um exemplo de inseticida de origem microbiana
comercialmente disponível (SPARKS; HAHN; GARIZI, 2017).
As espinosinas são metabólitos secundários da fermentação aeróbica da
actinobactéria Saccharopolvspora spinosa (MERTZ; YAO, 1990). Atualmente, os dois
ingredientes ativos comerciais a base de espinosina para o controle de pragas agrícolas
são o espinosade e o espinetoram (PINTO et al., 2018).
 13

O espinosade é uma combinação de dois metabólitos naturalmente encontrados

em S. spinosa, nomeadamente espinosina A e espinosina D. O espinetoram (XDE-175) é
um inseticida semissintético derivado da mistura de espinosina J e L, que foi submetida
a modificações para se tornar 5,6-di-hidro e 3’-O-etil, tornando-se um análogo da
espinosina (HUANG et al., 2009). A ação das espinosinas nos insetos resulta da sua
influência nos receptores nicotínicos de acetilcolina e na excitação neural generalizada
(SALGADO et al., 1998; SAAR, 2004), que serão mais bem descritos no mecanismo de
ação (página 15).

2.2.1. Estrutura química

A estrutura da S. spinosa é composta por uma molécula central poliquetida de
quatro anéis, chamada aglicona, que possui uma ramificação de açúcar neutro (2,3,4-tri-
O-metil-α-L-ramnosil) na posição C-9, e um açúcar amino radical (β-D-forosaminil) na
posição C-17 (veja na Figura 2). A confirmação definitiva desta estrutura foi
estabelecida pela semelhança absoluta entre a forosamina, obtida a partir da hidrólise da
espinosina A, com a D-forosamina proveniente da hidrólise da espiramicina (Salgado,
1998).

Figura 2. Estrutura da espinosina com marcação para cada radical e seus respectivos
fatores.

Fonte: JIN et al., 2009

 14

Dentro das estruturas químicas da molécula, para que ela tenha ações inseticidas
é necessária a formação de espinosade, que é composto por um grupo de espinosinas
denominadas por letras, sendo elas as espinosinas A e D, já descritas na figura 2
(Salgado, 1998).
A espinosina A é uma molécula complexa composta por uma aglicona
tetracíclica e dois açúcares, um sacarídeo neutro (2,3,4-tri-O-metil-a-eu-ramnosil) e uma
fração de aminoaçúcar (b-D-forosaminil). A estrutura da espinosina A foi determinada
por análises de RMN, MS e raios-X, assim como a D, que será descrita a seguir
(Bertasso, 2003).
A segunda estrutura de fermentação mais abundante é a espinosina D, a qual é 6-
metil-espinosina A. A espinosina D, segundo Orr em 2009 é formada pela junção de
propionato de etila.

Figura 3. Estrutura da espinosina mostrado os radicais principais

Fonte: JIN et al., 2009

Analisando a figura 3, notamos que a diferença entre as estruturas químicas das

espinosas A e D está em seu radical ligado ao ciclobenzeno-6, que confere as
características importantes citadas.
Já as espinosinas J, M, F e L desempenham papéis específicos na criação dos
açúcares, participando de reações bioquímicas que levam à formação da ramnose. Por
outro lado, as espinosinas N, Q, R e S catalisam reações envolvendo as furosaminas,
enquanto as espinosinas H, I e K são responsáveis por realizar a permetilação da
unidade de ramnose. Finalmente, as espinosinas G e P, através da ação de enzimas
 15

transferases, anexam os açúcares formados nas posições C9 e C17, culminando na

produção do bioinseticida. Estas observações foram detalhadamente estudadas por
Isiorho e colaboradores em 2012.

2.2.2. Mecanismos de Ação

As espinosinas, de acordo com a classificação do Comitê de Resistência a
Inseticidas (IRAC), são agentes inseticidas que afetam o sistema nervoso central dos
insetos-praga. Elas agem como reguladores alostéricos dos receptores nicotínicos de
acetilcolina, pertencendo ao Grupo 5. Para compreendermos melhor esse processo, é
crucial entender o papel da acetilcolina como neurotransmissor liberado na sinapse. Ao
se ligar aos receptores no neurônio pós-sináptico, a acetilcolina possibilita a transmissão
dos impulsos nervosos (MARQUES, 2022).

Figura 4. Transmissão dos sinais nervosos em uma sinapse do sistema neuromuscular dos
insetos.

Fonte: SALGADO, 2013.

Do ponto de vista bioquímico, o biocida exerce seu efeito através de uma

interação sinérgica com a acetilcolina, agindo em um sítio distinto do receptor pós-
sináptico. Esse processo resulta em contrações musculares involuntárias, sendo a
consequência direta da ativação de neurônios motores pelo impacto das espinosinas no
sistema nervoso central ganglionar (SALGADO, 1997).
 16

Estudos conduzidos por Orr e colaboradores (2009) identificaram o Dmα6-

nAchR, um análogo do receptor nicotínico de acetilcolina conhecido como α-7, como o
alvo primário das espinosinas. A ativação do α6-nAchR por essas substâncias inicia uma
sequência de eventos que culmina na morte do inseto (Dripps et al., 2008). Além disso,
é possível que haja influência nos receptores do ácido gama aminobutírico (GABA), um
neurotransmissor que ativa canais permitindo o influxo de íons de cloro para dentro das
células. No entanto, o mecanismo exato dessa ação ainda não é completamente
compreendido (SALGADO, 1998; WATSON, 2001).
Se analisados individualmente, tanto espinosade quanto espinetoram
identificarmos diferenças pontuais, podendo elas agirem de formas diferentes. O
Espinosade, por exemplo, tem se destacado como uma ferramenta eficaz e segura no
controle de diversas pragas de interesse em ambientes veterinários, agrícolas e para a
saúde humana. Tello et al. (2013) conduziram experimentos utilizando uma
concentração de 240 mg de ingrediente ativo por litro (i.a.L -1) de Espinosade para
controlar Eretmocerus paulistus (Hymenoptera: Aphelinidae), um parasitoide de
Aleurothrixus floccosus (Maskell) em pomares de citros no norte do Chile, alcançando
uma taxa de mortalidade superior a 90% em condições de laboratório.
Wang et al. (2014) investigaram as doses letais e subletais do Espinosade para o
controle da mariposa da beterraba Spodoptera exigua (Hubner) (Lepidoptera:
Noctuidae), aplicando doses de 0.100 mg.kg-1 e 0.300 mg.kg-1. Os resultados foram
impressionantes, resultando em uma mortalidade de S. exigua superior a 80%.
No México, Marina et al. (2012) atestaram a eficácia larvicida do Espinosade no
controle de larvas de Culex spp e Aedes spp em ambientes incomuns, como pneus de
carros. O produto demonstrou eficácia larvicida por um período de 6 a 8 semanas,
dependendo da estação e concentração utilizada.
No contexto do controle de parasitas em bovinos, o Espinosade também
demonstrou eficácia no combate aos carrapatos do gênero Boophilus. Além disso, em
estudos para o controle de moscas que podem servir como vetores de doenças, obteve-se
resultados promissores. Estudos laboratoriais ainda confirmaram a persistência da
atividade do Espinosade no controle de Ctenocephalides felis em cães infestados
artificialmente, com taxas de eficácia superiores a 99% até três semanas após o
tratamento, e ainda mantendo entre 96,5% e 97,8% até quatro semanas após o
tratamento (WOLKEN et al., 2011).
 17

Já o espinetoram, que é uma variação mais moderna e semi-sintética da

espinosina, tem resultados diferentes. Devido a essas alterações, o espinetoram exibe
uma eficácia inseticida superior quando comparado ao espinosade.
São classificados como não-sistêmicos na planta, embora alguns estudos tenham
demonstrado uma certa movimentação translaminar (através das camadas da folha). A
adição de adjuvantes recomendados desempenha um papel crucial na otimização da
interação do produto com a folhagem, principalmente no que diz respeito ao controle de
pragas como as larvas-minadoras. Apresentam uma baixa solubilidade em água e uma
alta afinidade por lipídios (Tabela 1), o que em parte justifica a limitada capacidade de
deslocamento nos tecidos.

Tabela 1. Solubilidade das variações de espinosina em meio aquoso e afinidade lipídica.

Meia-vida Meia-vida
Inseticidas Solubilidade Lipofilicidade DT50 por DT50 por
fisiológicos em água (log Pow) fotólise em hidrólise (em
(mg/L) a água (em dias)
20°C dias)

Espinetoram 29,0 4,2 0,4 Estável

Espinosade 7,6 4,1 0,9 Estável

Fonte: MARQUES, 2022

Ambas são moléculas caracterizadas pela sua estabilidade razoável em meio
aquoso, embora sejam susceptíveis à degradação, por exemplo, sob a influência da luz.
Algumas pesquisas indicam uma meia-vida não muito superior a dois dias (Duchet et
al., 2008), o que, de certa forma, pode resultar em um efeito residual de curta duração.
Devido à singularidade e distinção do mecanismo de ação das espinosinas, esses
inseticidas podem ser empregados em uma estratégia de rotação para gerenciar a
resistência.

2.3. Processo Fermentativo

 18

2.3.1. Meio de cultura, substrato e processo

A faixa favorável de temperatura para o crescimento da Saccharopolyspora
spinosa, como já citado, é de 15 a 37 °C, sendo que não sobrevivem em temperaturas
superiores a 50 °C, se expostos por mais de 8 horas. Demonstram resistência a diversos
compostos como cefalotina, kasugamicina, ácido nalidíxico, novobiocina, oligomicina,
oxitetraciclina, penicilina, entre outros (Mertz e Yao, 1990).
O metabólito pode ser produzido através de um processo de “incubação”
aeróbica (rotatória) em meio enriquecido com soja, composto por ingredientes como
tryptic soy broth (TSB), levedura de soja, MgSO4 · 7H2O, glucose e maltose. Após a
“incubação” em um agitador rotatório a 250 RPM, as células são coletadas por
centrifugação, lavadas duas vezes com água deionizada e utilizadas como inóculo. Esse
inóculo é então incubado por aproximadamente 21 dias a 30 ºC. O extrato resultante
desta inoculação é o caldo com propriedades inseticidas, que passa por um processo de
secagem para se obter o produto na forma de cristais esbranquiçados.
De acordo com Wang et al. (2014), a cepa original de S. spinosa possui uma
produtividade baixa. Dado o requerimento comercial de quantidades substanciais do
biocida, foi implementado um programa de otimização visando aumentar a produção de
espinosinas, conforme indicado por Sparks et al. (1996). Para realizar essa modificação
na cepa, três estratégias são empregadas: Mutagênese físico-química tradicional
utilizando raios UV, Aprimoramento do processo fermentativo, Ampliação da produção
de espinosade através de técnicas de engenharia genética.
Um exemplo de otimização do processo fermentativo foi demonstrado por Jin et
al. (2006), que identificaram que as concentrações iniciais ideais de glicose e fosfato
são, respectivamente, 58.8 g por litro e 29.41 mmol por litro. Essas otimizações
resultaram em um aumento da produção de espinosade para 507 mg por litro em um
fermentador de 5 litros.

2.3.2. Purificação e quantificação

A quantificação da glicose é, mais comumente realizada, empregando o método
reagente de Fehling, que é uma técnica altamente confiável e estabelecida na análise de
carboidratos [21]. Para a avaliação do teor de aminonitrogênio, utiliza-se o método de
titulação do formaldeído, um procedimento reconhecido pela sua precisão na
determinação de compostos nitrogenados [21].
 19

A avaliação da biomassa foi conduzida de forma gravimétrica, o que envolveu a

filtração da amostra em papel de filtro previamente pesado e posterior secagem a uma
temperatura controlada de 70°C. Esse método é amplamente aceito por sua precisão e
eficácia na determinação do peso de células secas, proporcionando uma medida
confiável da biomassa produzida.
No que diz respeito à quantificação do Spinosad, utilizau-se a técnica de
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC), uma metodologia amplamente
empregada em análises de compostos químicos complexos. Essa abordagem permite
uma avaliação precisa e sensível do teor de Spinosad presente nas amostras,
proporcionando dados confiáveis sobre a produção deste composto.
Dessa forma, os métodos utilizados neste estudo são cuidadosamente
selecionados para garantir a precisão e confiabilidade das medições. Cada técnica
empregada possui uma fundamentação científica sólida e é amplamente aceita na
comunidade científica, assegurando a validade e robustez dos resultados obtidos.

3. Metodologia da pesquisa
A metodologia empregada neste Trabalho de Conclusão de Curso (TCC) se
concentrou na análise do processo de produção de espinosina pela bactéria
Saccharopolyspora spinosa. O objetivo primordial da pesquisa foi compreender os
mecanismos e as etapas envolvidas na produção desse biocida.
Inicialmente, a pesquisa começou com a seleção do tema e a formulação de
perguntas de pesquisa específicas voltadas para o processo. Isso proporcionou uma base
sólida para a busca por referências científicas relevantes.
A plataforma Google Acadêmico foi a primeira ferramenta utilizada para a coleta
de dados. Termos de busca precisamente formulados, como "produção de espinosina",
"Saccharopolyspora spinosa" e "biocida natural", foram inseridos para garantir a
obtenção de uma ampla gama de artigos, teses e publicações acadêmicas relacionadas
ao tema.
Em paralelo, a plataforma Science Direct foi também empregada para a busca de
literatura acadêmica. Os mesmos termos de busca utilizados no Google Acadêmico
foram inseridos na plataforma, assegurando uma abordagem abrangente na coleta de
dados.
 20

Para a seleção das referências, foram estabelecidos critérios de inclusão e

exclusão. Foram considerados estudos que abordassem diretamente o processo de
produção. Estudos duplicados e aqueles que não estavam alinhados com o objetivo do
trabalho foram excluídos.
Após a coleta de dados, procedeu-se à análise dos títulos, resumos e palavras-
chave das referências obtidas. Os estudos que atenderam aos critérios de inclusão foram
selecionados para leitura completa.
A leitura completa dos artigos selecionados permitiu a síntese dos principais
achados, metodologias e conclusões relacionadas ao processo. Esta etapa foi crucial
para a compreensão aprofundada dos mecanismos bioquímicos e das etapas do
processo.
Com as referências selecionadas e a síntese dos artigos realizada, foi possível
redigir o corpo do TCC.

4. Referências

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