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fermentação
Revisão
Produção de bioetanol a partir de Saccharomyces cerevisiae:
Oportunidades e desafios
Hongyang Zhang, Pengcheng Zhang, Tao Wu e Haihua Ruan *
Citação: Zhang, H.; Zhang, P.; Wu,
T.; Ruan, H. Produção de bioetanol
com base em Saccharomyces
cerevisiae: Oportunidades e desafios.
Fermentation 2023, 9, 709. https://
doi.org/10.3390/fermentation
9080709
Editor Académico: Debarati Paul
Recebido: 29 de junho de 2023
Revisão: 19 de julho de 2023
Aceite: 22 de julho de 2023
Publicado em: 26 de julho de 2023
Direitos de autor: © 2023 pelos
autores. Licenciado MDPI, Basileia,
Suíça. Este artigo é um artigo de
acesso aberto distribuído sob os
termos e condições da licença
Creative Commons Attribution (CC
BY) (https://
creativecommons.org/licenses/by/
4.0/).
Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of
Commerce, Tianjin 300134, China; zhyang@tjcu.edu.cn (H.Z.); shengwuzpc@tjcu.edu.cn (P.Z.);
wutao@tjcu.edu.cn (T.W.)
* Correspondência: ruanhaihua@tjcu.edu.cn
Resumo: O grande consumo de combustíveis fósseis não renováveis provocou o esgotamento de
energia e a poluição ambiental, gerando a produção de biocombustíveis renováveis, uma alternativa
importante para aliviar eficazmente a crise energética. Como um dos tipos ideais de biocombustível, a
síntese de bioetanol em Saccharomyces cerevisiae tem atraído muita atenção. Devido às suas inúmeras
vantagens, a S. cerevisiae tem sido desenvolvida como célula de base essencial com elevada eficiência
para a síntese de bioetanol. Este estudo resumiu sistematicamente a preponderância de S. cerevisiae na
biossíntese. Apresentou objetivamente as estratégias de investigação da síntese de bioetanol com base
em S. cerevisiae e os problemas de estrangulamento existentes. Este estudo propôs ainda perspectivas
razoáveis para a síntese de bioetanol por S. cerevisiae, t e n t a n d o fornecer estratégias de
investigação alternativas.
Palavras-chave: bioetanol; Saccharomyces cerevisiae; fábrica de células; fermentação; estrangulamento
1. Introdução
A crescente procura de combustíveis fósseis causada pelo aumento das actividades
antropogénicas e pelo rápido crescimento económico provocou graves problemas
ambientais e o esgotamento dos recursos [1,2], o que constitui um impulso direto
para a reconstrução da estrutura energética, o desenvolvimento e a industrialização de
biocombustíveis renováveis [3-5].
Os biocombustíveis são produzidos em resposta às preocupações ambientais mundiais
e ao esgotamento dos combustíveis fósseis não renováveis [6-8]. O biocombustível refere-se ao
combustível renovável e sustentável obtido através do processamento de materiais de
biomassa (palha de culturas, madeira, erva de trigo, etc.) que podem substituir os
combustíveis fósseis tradicionais [9], entre os quais o bioetanol é particularmente
atrativo, tendo o potencial para acelerar a utilização sustentável dos recursos e mudar a
economia global para um futuro mais verde [10-12]. A inovação biotecnológica contínua
promove fortemente a modernização e a produção em massa de biocombustíveis
representados pelo bioetanol. A biofermentação baseada em importantes
microrganismos-modelo é uma tecnologia com grande potencial de desenvolvimento,
sem qualquer dúvida
para a produção de biocombustíveis no presente e no futuro [13,14].
Com o rápido desenvolvimento da tecnologia de biologia sintética, com base na
enorme procura de biocombustíveis no mercado, a Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) é
cada vez mais utilizada na biossíntese de biocombustíveis devido às suas superioridades
[15,16]. A S. cerevisiae é uma levedura eucariota de qualidade alimentar,
indissociavelmente ligada à produção e à vida humanas [17], que pode ser encontrada
sem esforço tanto em habitats naturais como em vários ambientes afectados por
actividades humanas [18]. Desde a antiguidade, a S. cerevisiae tem tido um longo papel
histórico na civilização humana e no desenvolvimento social, reflectindo-se
principalmente na produção e fermentação de alimentos como o pão, a cerveja e o vinho
[19,20].
Com base em numerosos estudos neste domínio, esta investigação tomou o
bioetanol como exemplo, fábrica celular sintética bastante eficiente e as principais técnicas atualmente utilizadas para
analisou as vantagens melhorar a produção de bioetanol. Além disso, foram analisados os pontos de
significativas da S. estrangulamento existentes no atual processo de síntese de bioetanol utilizando S.
cerevisiae como uma cerevisiae

Fermentação 2023, 9, 709. https://doi.org/10.3390/fermentation9080709 https://www.mdpi.com/journal/fermentation

Fermentação 2023, 9, 709 2 de 22

como células de chassis, e será proposta uma perspetiva futura racional e viável. Espera-se que
este estudo possa fornecer a base necessária para a continuação da investigação sobre a
síntese de bioetanol a partir de S. cerevisiae.

2. Saccharomyces cerevisiae: Uma Fábrica de Células Eficiente

S. cerevisiae tem recebido uma atenção crescente nos últimos anos, tendo em conta as suas
relações inseparáveis com a humanidade. Os avanços na biotecnologia, a procura
crescente de produtos biológicos sintéticos e as alterações ambientais dinâmicas
permitiram a atualização e otimização contínuas das estirpes de S. cerevisiae [21]. Com a seleção
e a domesticação a longo prazo, as estirpes de S. cerevisiae com funções específicas foram
gradualmente seleccionadas na direção esperada a partir dos tipos selvagens [22].
Atualmente, a S. cerevisiae já não se limita à fermentação de alimentos e bebidas, tendo sido
concebida como uma fábrica celular para a produção de importantes produtos farmacêuticos,
proteínas recombinantes e biocombustíveis avançados, com base na inovação contínua de
diferentes abordagens técnicas [23-26]. S. cere visiae tem várias vantagens importantes
em comparação com outros microrganismos procarióticos e eucarióticos, o que a torna
uma das mais importantes fábricas de células actuais (Figura 1).

Figura 1. Principais vantagens da Saccharomyces cerevisiae como uma fábrica de células eficiente.

2.1. Preocupações finitas com a biossegurança

A S. cerevisiae está intimamente relacionada com a dieta e a vida humanas, é
completamente não patogénica e foi confirmada como um microrganismo de qualidade
alimentar ao longo da história [27]. Para além da função de fermentação alimentar,
estudos realizados nos últimos anos revelaram que S. cerevisiae também apresenta
propriedades probióticas óbvias. Um estudo realizado por Sun et al. mostrou que a
aplicação de S. cerevisiae modificada poderia atenuar a colite induzida por DSS em ratos
através da supressão da piroptose de macrófagos e da modulação da microbiota intestinal [28].
A S. cerevisiae também tem efeitos probióticos significativos em animais de criação. A
digestibilidade dos alimentos e o número de bactérias patogénicas podem ser eficazmente
melhorados através da adição de células vivas de S. cerevisiae aos alimentos para animais [29].
Existem também provas directas de que os probióticos à base de S. cerevisiae constituem um
novo agente antimicrobiano para o tratamento de doenças bacterianas [30,31]. Além
disso, a S. cerevisiae tem um efeito de controlo biológico significativo na doença da
população de citrinos através da competição nutricional e da produção de compostos
antifúngicos [32]. Por conseguinte, a elevada biossegurança e a atividade probiótica são
vantagens proeminentes que distinguem S. cerevisiae de outros organismos,
apresentando um grande potencial e os pré-requisitos necessários como fábrica de
células.
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2.2. Posição evolutiva aplicável

A S. cerevisiae é uma espécie de eucariota unicelular, que não só tem as características
de cultura fácil, reprodução rápida e manipulação genética sem ferramentas semelhantes às
dos procariotas, como também tem as características moleculares e biológicas celulares
básicas dos eucariotas típicos. A posição evolutiva aplicável de S. cerevisiae tornou-a um
modelo experimental indispensável para a elaboração de muitas regularidades na genética
moderna, biologia celular e bioquímica de células eucarióticas e procarióticas [33]. Além
disso, a S. cerevisiae é considerada a ferramenta mais promissora para a expressão de genes
exógenos [34,35], essencial para remodelar as vias de síntese in vivo dos biocombustíveis. As
evidências também indicam que a S. cerevisiae é útil como hospedeira para a engenharia
genética, uma vez que permite a dobragem e a glicosilação de proteínas eucarióticas
heterólogas expressas e pode ser sujeita a muitas manipulações genéticas [36].

2.3. Condições de cultivo pouco exigentes

S. cerevisiae é relativamente fácil de cultivar em diferentes tipos de meios em condições
laboratoriais, permitindo a avaliação de muitos fenótipos e a construção de diferentes tipos
de fábricas de células [37]. De um modo geral, a S. cerevisiae não necessita de um meio
complexo para crescer e pode ser cultivada em meios líquidos e sólidos. Os nutrientes
necessários a quase todos os tipos de estirpes de S. cerevisiae, incluindo mutantes com
deficiência de nutrientes e mutantes com deleção de genes, são comuns, baratos e
facilmente disponíveis. Os meios mais comummente utilizados para
S. cerevisiae são os meios YPD (também designado YPED), SC, mínimo (suplementado com
aminoácidos essenciais) e de esporulação [38]. Dada a certeza das necessidades
nutricionais de S. cerevisiae, os investigadores podem efetuar uma investigação
aprofundada, como a regulação da via de utilização metabólica dos nutrientes e dos
metabolitos correspondentes para melhorar a qualidade e o rendimento do produto [39-
41].

2.4. Forte tolerância ao stress ambiental

A tolerância dos microrganismos a diversos stresses é muito importante para
aplicações práticas [42,43]. O habitat de vida de S. cerevisiae é complexo e extenso,
enfrentando sempre uma variedade de perturbações ambientais adversas. A S. cerevisiae
desenvolveu uma capacidade de lidar com ambientes adversos na evolução natural a
longo prazo e na aplicação artificial [44-47]. Com base nas características fisiológicas e
genéticas de forte tolerância de S. cerevisiae, a modificação racional pode ser efectuada através da
engenharia genética para obter estirpes mais robustas para fazer face a alterações
ambientais agudas, incluindo o stress oxidativo, a baixa temperatura, o choque térmico, a
perda de nutrientes, o stress osmótico, a pressão antibiótica, o stress do ácido acético,
etc., na aplicação prática [45,48-51].

2.5. Facilidade de Manipulação

Como organismo modelo eucariótico mais bem estudado, a investigação tem sido
conduzida em S. cerevisiae com base na informação bem anotada do genoma. A
manipulação madura do genoma e as técnicas de edição de genes para S. cerevisiae
levaram a uma fácil operação de construção de fábricas de células específicas [52]. A estirpe
S288c de S. cerevisiae foi o primeiro eucariota a ser geneticamente elucidado em 1996, o que,
pela primeira vez, abriu a oportunidade para o estudo global da expressão e do
funcionamento do genoma eucariótico [53] e criou oportunidades para estudos
posteriores em genómica comparativa, funcional e evolutiva, estabelecendo uma base
sólida para a compreensão sistemática e a engenharia racional das vias metabólicas [54].
Nesta base, a S. cerevisiae pode ser estudada em profundidade e pormenor a vários níveis
no estudo de acompanhamento [55]. A notável plasticidade do genoma de S. cerevisiae
torna possível a elaboração de vias sintéticas e a produção de biocombustíveis em grande
escala [18,33].

3. Síntese de bioetanol em Saccharomyces cerevisiae

Os biocombustíveis têm potencial para alcançar um desenvolvimento sustentável do
ponto de vista ambiental, reduzir a dependência de recursos importados e satisfazer a
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procura de energia com crescimento económico [3,7]. A Figura 2A mostra os níveis de

produção de biocombustíveis em petajoules (PJ; 1 PJ = 1015 J) em países com produção
de chumbo-
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O bioetanol é uma classe de biocombustíveis particularmente atraente, considerada uma

alternativa proeminente aos combustíveis fósseis no século XXI, devido às suas
vantagens de combustão completa, baixas emissões de gases de escape e contribuição
para a redução do consumo de petróleo bruto e das emissões de gases de escape. O
bioetanol é uma classe de biocombustíveis particularmente atraente, considerada uma alternativa
proeminente aos combustíveis fósseis no século XXI, devido às suas vantagens de
combustão completa, baixas emissões de gases de escape e contribuição para a redução do
consumo de petróleo bruto e da poluição ambiental [56]. A situação atual da produção de
bioetanol nos principais países do mundo é apresentada na Figura 2B.

Figura 2. Países líderes com base na produção mundial de biocombustível (A) e bioetanol (B) em
2021, respetivamente. (Fonte de dados: https://www.statista.com acedido em 25 de junho de 2023).

O bioetanol é produzido principalmente por microrganismos em um processo de

fermentação que utiliza matérias-primas vegetais (por exemplo, milho, cana-de-açúcar, beterraba
sacarina, sorgo sacarino) [57]. De acordo com as diferentes matérias-primas de produção, a
produção de bioetanol pode ser dividida em três categorias: o uso de grãos, o uso de
lignocelulose e o uso de algas para a produção de bioetanol [58,59]. Existem várias
fábricas de células microbianas para a fermentação do produto etanol a partir de
diferentes matérias-primas, entre as quais se destacam Es- cherichia coli [60,61],
Zymomonas mobilis [62,63], Bacillus subtilis [64,65], S. cerevisiae [66,67], etc. De entre todos
os microrganismos fermentativos, S. cerevisiae é considerado um excelente organismo
etanologénico industrial, com base nas excelentes vantagens acima mencionadas. O
processo baseia-se na capacidade da S. cerevisiae de fermentar eficaz e completamente os açúcares
da biomassa de matéria-prima em etanol em grande escala [68].
Com base nos últimos resultados da investigação, as principais medidas adoptadas
para a produção de bioetanol utilizando S. cerevisiae como células de base podem ser
resumidas da seguinte forma (Figura 3).
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Figura 3. Principais estratégias para promover a síntese de bioetanol em Saccharomyces cerevisiae.

3.1. Adição de estimulantes externos ao meio

As condições nutricionais necessárias para o crescimento e metabolismo de S.
cerevisiae são relativamente simples. Na fermentação para produzir etanol a partir de
matérias-primas de biomassa, a adição de nutrientes exógenos ao meio é um estímulo
eficaz para aumentar o rendimento do etanol. Um estudo de Li et al. mostrou que a
adição de péptido de colagénio ao meio aumentou significativamente o rendimento de
bioetanol sob diferentes concentrações de glucose e tempos de fermentação, em
comparação com o grupo sem adição [69]. Na produção de bioetanol de segunda geração,
a tolerância finita de S. cerevisiae aos inibidores dos hidrolisados lignocelulósicos
continua a ser um desafio significativo. A adição de uma mistura de piridoxina, tiamina e
biotina aos meios de propagação poderia melhorar em grande medida o crescimento
celular e os rendimentos de etanol durante a fermentação tanto no hidrolisado de palha de
milho como no de palha de trigo [70]. Este método é simples e fácil e pode conseguir um
aumento significativo do rendimento num curto espaço de tempo.

3.2. Otimização de componentes e sistemas de cultura de S. cerevisiae

A otimização racional e o melhoramento das condições e sistemas de cultura
podem aumentar eficazmente a produção de bioetanol. Um estudo de Pereira et al.
mostrou um meio otimizado baseado em licor de milho e outras fontes de nutrientes de
baixo custo que aumentaram significativamente o título final de etanol, o rendimento e a
atividade da levedura, fornecendo informações valiosas sobre a suplementação
nutricional econômica da produção de bioetanol [71]. Além disso, a inovação do sistema
de cultura de fermentação é também uma prática útil que vale a pena tentar. Através da
co-cultura de S. cerevisiae e Pichia pastoris, o rendimento do bioetanol pode ser
aumentado em grande medida [72]. Este método de aumento do rendimento requer
tentativas e erros para determinar o componente mais adequado do meio e o sistema de
cultura mista.

3.3. Criação de estirpes de elevada tolerância

A S. cerevisiae, como célula de chassis, enfrenta pressões complexas e variadas na
fermentação do bioetanol. As condições físico-químicas, a concentração de substrato, os
efeitos tóxicos do etanol e outros factores são elementos essenciais que afectam o
rendimento final do bioetanol. Por conseguinte, a seleção e a criação de estirpes de S.
cerevisiae com melhor tolerância são muito importantes.
Atualmente, a criação de estirpes de S. cerevisiae centra-se principalmente na
melhoria da tolerância térmica, da tolerância à glucose e da tolerância ao etanol, que é o tipo de
stress mais comum enfrentado pelas células de S. cerevisiae no processo de fermentação
do bioetanol [73,74]. A criação de cepas excelentes é um pré-requisito essencial para alcançar
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um alto rendimento de bioetanol,

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e é por isso que, atualmente, há uma quantidade considerável de investigação centrada

neste aspeto através de vários métodos físico-químicos.

3.4. Modificação precisa do genoma de S. cerevisiae

Para aumentar o rendimento do etanol, a edição e a modificação do genoma de S.
cerevisiae com precisão a partir de diferentes vias metabólicas, com base num fundo
genético transparente e num sistema de funcionamento genético maduro, constituem um
ponto de acesso para a investigação. Há muita investigação relevante, tendo-se
r e g i s t a d o progressos notáveis. A modificação, a supressão e a sobreexpressão de
genes e promotores-chave podem estar intimamente relacionadas com o rendimento do
bioetanol. Por exemplo, a desregulação do gene da álcool desidrogenase (ADH2) através
da supressão completa do gene e a introdução de uma mutação de frameshift no locus
ADH2 através da tecnologia CRISPR/Cas9 mostraram que o rendimento em etanol
aumentou até 74.7% em comparação com o rendimento obtido utilizando a estirpe nativa
[75]; a introdução do simportador glucose-protão, do simportador frutose-protão e da
invertase extracelular no contexto da supressão dos genes que codificam os transportadores
de hexose, os transportadores de dissacarídeos e as hidrolases de dissacarídeos resultou
num aumento de 16,6% do rendimento de etanol anaeróbio [76]; a introdução e a supressão de
genes-chave na via metabólica da glucose são também cruciais para aumentar a produção de
bioetanol [77,78]. Esta abordagem é mais precisa, mais direccionada e mais completa,
ilustrando a aplicabilidade para promover a melhoria da produção de bioetanol em S.
cerevisiae através da engenharia do genoma.

4. O estrangulamento da produção de bioetanol por Saccharomyces cerevisiae

As leveduras, como a S. cerevisiae, têm sido utilizadas na produção de bioetanol,
especialmente nas indústrias cervejeira e vinícola, há milhares de anos. Foram envidados
numerosos esforços para compreender e melhorar a fermentação das leveduras. No
entanto, a produção de bioetanol por fermentação em S. cerevisiae não está isenta de
obstáculos. Existem muitas restrições externas, incluindo condições ambientais, factores de
preço, contexto político, limitação de escala e complexidade e incerteza do processo de
fermentação, e estes factores evoluíram para os principais problemas de
estrangulamento, impedindo inevitavelmente o aumento da produção de etanol. Com
base nos resultados da investigação existente, resumem-se a seguir alguns
estrangulamentos representativos (Figura 4).

4.1. O dilema da utilização de matérias-primas de fermentação

A primeira geração de bioetanol é produzida a partir de culturas alimentares (milho,
trigo, batata-doce, etc.) com excelentes características de fermentação [79]. No entanto,
os cultivos alimentares são recursos extremamente importantes, com altos custos de
produção e armazenamento, que se refletem principalmente no uso de valiosos e
escassos terrenos agrícolas e água de irrigação. Portanto, em termos de custos, a
produção de bioetanol a partir de cultivos alimentares não é uma opção baseada no
menor custo e no maior rendimento.
A biomassa lignocelulósica representa a maior reserva de recursos a nível mundial e
é a matéria-prima para a produção de bioetanol de segunda geração com baixo custo e
amplas fontes. Uma vantagem notável da biomassa lignocelulósica é que ela pode ser
obtida para a produção de etanol sem competir por terras aráveis e insumos agrícolas com
culturas para consumo humano ou animal [80]. No entanto, apesar da intensa
investigação sobre o etanol lignocelulósico, esta opção ainda representa menos de 1% da
produção mundial de etanol [68]. A principal desvantagem destas matérias-primas é a
recalcitrância à degradação da matriz lignocelulósica, que é composta por polímeros de
celulose e hemicelulose ligados covalentemente e por hidrogénio, que estão ainda ligados
à lignina no seu estado natural [81-83]. Além disso,
A S. cerevisiae, a espécie produtora de etanol mais utilizada na produção de bioetanol,
tem dificuldade em utilizar a β-D-xilose e a α-L-arabinose, as principais pentoses dos
polímeros de hemicelulose [84,85]. Essa é uma razão importante que impossibilita a
expansão da produção de bioetanol de segunda geração.
A terceira geração de produção de bioetanol é derivada da biomassa de microalgas.
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As microalgas são atualmente uma opção promissora para a produção de novas formas de
energia renovável com uma vasta gama de fontes e nutrientes ricos. No entanto, devido à
particularidade
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A complexidade das microalgas, o processo de utilização de matérias-primas de

microalgas para a produção de bioetanol é relativamente complicado, devendo passar por
várias etapas, como o tratamento de quebra da parede celular, a extração do amido, a
sacarificação por hidrólise e o processo final de fermentação [86]. Além disso, em
comparação com o equipamento e o processo de produção de bioetanol a partir de culturas
alimentares, o equipamento de produção de biomassa de microalgas para a síntese de
bioetanol não está suficientemente maduro e muitas tecnologias-chave estão ainda na fase
de investigação teórica. Além disso, a forma de prevenir eficazmente a contaminação
bacteriana torna-se outro constrangimento significativo no cultivo em massa e impede o
processo industrial [87]. Atualmente, a maior fonte de matéria-prima para a produção de
bioetanol continua a ser as culturas alimentares [88]. Como superar o gargalo da utilização
de matérias-primas na síntese de bioetanol
é um problema que precisa de ser resolvido no futuro.

4.2. Limitações das técnicas de edição de genes em Saccharomyces cerevisiae

Tecnologia de edição de genes CRISPR-Cas9 para identificar a sequência do genoma alvo
através de sgRNA (RNA guia) concebido artificialmente. Este guia a protease Cas9 para
cortar a cadeia dupla de ADN, resultando em quebras de cadeia dupla de forma eficaz. O
sistema CRISPR-Cas9 de S. cerevisiae está suficientemente maduro em comparação com
outras células de referência em biologia sintética, mas ainda existem alguns problemas
que impedem a sua aplicação prática. Por exemplo, a cromatina afecta a eficiência de
edição de genes da proteína Cas9 em S. cerevisiae porque a acessibilidade de PAM na cromatina
é um fator crítico que regula o direcionamento e a clivagem da Cas9 [89]. Além disso, a
edição de genes com base na Cas9 pode, por vezes, levar a um corte excessivo do ADN,
o que pode conduzir a algumas mutações. O gRNA é crucial para a atividade de edição,
mas a forma de evitar efeitos secundários desnecessários da edição de genes através da
racionalização da modificação do gRNA continua por esclarecer. A baixa eficiência do
genoma mediado por HDR também afectará significativamente a eficiência da edição de
genes. Trata-se, sem dúvida, de um problema que deve ser tido em conta para melhorar a
produção de bioetanol através de novas modificações genéticas [90].
Em conclusão, um sistema de edição de genes de S. cerevisiae deve ser melhor
construído para uma melhor produção de bioetanol.

4.3. Factores de limitação do rendimento

A produção eficiente de bioetanol é desejada para aplicações de bioenergia em larga escala,
mas é severamente desafiada pelo stress do etanol, que é um problema mútuo no
contexto global [91]. O bioetanol acumula-se continuamente e atinge uma concentração
mais elevada na fermentação por S. cerevisiae. Embora a S. cerevisiae tenha sido modificada
através de reprodução mutagénica, edição de genes e outras tecnologias para melhorar a
tolerância ao etanol, ainda está longe do valor esperado. Não consegue atingir o nível de
fermentação em escala de maior densidade.
Por outro lado, olhando para a produção mundial de bioetanol, verifica-se
claramente que o grau de mercantilização é sensivelmente elevado, com uma
concorrência feroz e lacunas de desenvolvimento entre diferentes países e regiões [92].
Em 2020 e 2021, a capacidade global da indústria de fermentação de bioetanol mostrou
uma tendência relativamente decrescente em comparação com 2019 e 2020 (Tabela 1).
Entre os principais países produtores de bioetanol, a produção global da China, do Brasil
e da Tailândia registou uma quebra nos últimos dois anos. Para além do impacto das
políticas de regulação macroeconómica e do efeito da pandemia de COVID-19, o
desenvolvimento agrícola específico dos países também afecta significativamente a
produção de bioetanol. Tomando a China como exemplo, é difícil formar um suprimento
estável e em grande escala de matérias-primas de bioetanol de primeira geração na China
em termos do desafio da segurança alimentar, que é o maior obstáculo à industrialização
do bioetanol na China atualmente [93].
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Tabela 1. Produção mundial anual de etanol combustível (Mil. Gal.) (Fonte de dados:
https://ethanolrfa.org acedido em 25 de junho de 2023).

Região 2016 2017 2018 2019 2020 2021 % da produção mundial

Estados Unidos 15,413 15,936 16,091 15,778 13,941 15,016 55%
Brasil 6840 6730 8060 8860 8100 7320 27%
União Europeia 1190 1250 1300 1350 1280 1350 5%
China 730 850 810 1010 930 870 3%
Índia 260 230 430 460 540 850 3%
Canadá 460 460 460 497 429 434 2%
Tailândia 330 380 390 430 390 360 1%
Argentina 240 290 290 290 210 270 1%
Resto do mundo 587 644 709 655 650 820 3%
Total 26,050 26,770 28,540 29,330 26,470 27,290

Figura 4. Principais estrangulamentos na produção de bioetanol por Saccharomyces cerevisiae.

5. Perspectivas futuras
As preocupações globais com o esgotamento dos combustíveis fósseis e os efeitos
ambientais das emissões de gases com efeito de estufa levaram a uma produção
generalizada de bioetanol com base na fermentação [94].
O S. cerevisiae, o microrganismo preferido para a produção de bioetanol, devido ao seu
cultivo conveniente e às manipulações genéticas, pode utilizar mais eficazmente as
matérias-primas da biomassa para sintetizar bioetanol através de vias metabólicas
específicas. Até agora, a fermentação de bioetanol em S. cerevisiae representa o produto
predominante da biotecnologia industrial [95,96].
Ao mesmo tempo que se constatam as notáveis vantagens da produção de bioetanol
por S. cerevisiae, é também urgente reconhecer os desafios significativos. Para melhorar
as melhorias substanciais, os seguintes aspectos poderiam ser considerados e
reforçados em futuras investigações.

5.1. Reformulação do sistema de cultura de fermentação

Um bom sistema de cultura de fermentação é fundamental para aumentar a produção
de bioetanol. Como já foi referido, as microalgas são uma matéria-prima essencial para a
produção de bioetanol de terceira geração, mas ainda há um longo caminho a percorrer até à
Fermentação 2023, 9, 709 12 de 22

sua aplicação generalizada. Fu-

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A investigação sobre o equipamento de cultura de microalgas deve ser reforçada, a

fim de promover a transformação e a valorização das matérias-primas microalgais e a
construção de uma sociedade que poupe recursos e respeite o ambiente. Por exemplo,
para obter mais biomassa de microalgas, devem ser desenvolvidos novos tipos de
fotobiorreactores simples adequados para o cultivo de alta densidade de microalgas a
baixo custo, bem como uma série de equipamentos que podem ser ampliados para a
colheita e a quebra da parede celular, a fim de reduzir ao máximo a secagem das
microalgas e a extração de hidratos de carbono, poupando o investimento em
equipamento e o consumo de energia [97].
Além disso, o sistema simbiótico de microrganismos e microalgas tornou-se um
ponto de interesse para a investigação nos últimos anos, devido à forte capacidade de
sequestro de carbono e aos ricos factores nutritivos das microalgas, que podem fornecer a
maioria das fontes essenciais de carbono, bem como os microelementos necessários para
o crescimento microbiano. Existem algumas pesquisas sobre o sistema simbiótico de
bactérias e algas [98,99], mas há poucos relatos sobre sua aplicação na fermentação do
bioetanol. Um novo sistema simbiótico entre S. cerevisiae e microalgas poderia ser construído
para otimizar as condições de cultura e aumentar eficazmente o rendimento do bioetanol.

5.2. Regulação direccionada do processo de pré-tratamento da fermentação

Foi demonstrado que a fase de pré-tratamento eficiente da fermentação de matérias-
primas é essencial para a conversão de biomassa renovável em combustíveis e produtos
químicos. Por conseguinte, é um esquema prático modificar as matérias-primas de fermentação
através do controlo direcional do processo de pré-tratamento. A otimização da conceção
direcional baseada na aprendizagem automática pode regular eficazmente os parâmetros
de pré-tratamento [100]. O acoplamento orgânico desta tecnologia com o processo de
pré-tratamento de matérias-primas de fermentação poderia ser considerado para melhorar
continuamente o rendimento do bioetanol. Por exemplo, a xilose é um dos açúcares mais
abundantes na biomassa celulósica, mas não pode ser utilizada pela S. cerevisiae de tipo
selvagem [100-102]. No futuro, com base na aprendizagem automática e na estratégia de
otimização do design inverso, o processo de pré-tratamento da fermentação das matérias-
primas poderá ser continuamente optimizado e melhorado para aumentar a utilização da
xilose e a eficiência da conversão.

5.3. Exploração aprofundada de factores regulamentares importantes

Atualmente, a manipulação genética de estirpes de S. cerevisiae está muito madura e
algumas vias metabólicas relacionadas com a síntese de etanol foram analisadas em
profundidade e em pormenor. No entanto, continua a faltar a prospeção e identificação de
alguns elementos reguladores importantes, como os ARN não codificantes (ncRNA). Os
ncRNAs não podem ser traduzidos em proteínas funcionais, mas conferem importantes
funções reguladoras [103]. Muitos estudos demonstraram que os ncRNAs desempenham
papéis reguladores cruciais em todas as fases do crescimento e do metabolismo
microbiano, e S. cerevisiae não é exceção [104]. No entanto, não existem estudos
relevantes sobre se o ncRNA desempenha um papel regulador importante nas vias de
síntese de bioetanol de S. cerevisiae. Estudos futuros poderiam enfatizar a identificação
de elementos reguladores chave como ncRNAs intimamente relacionados com o
metabolismo e a síntese de bioetanol no genoma de S. cerevisiae através de
sequenciamento de alto rendimento e tecnologia -omics, para que possam ser usados de
forma flexível como elementos biológicos reguladores cruciais.

5.4. Construção de um sistema biológico sintético sem células baseado em extractos celulares
de Saccharomyces cerevisiae
Devido à complexidade do sistema celular vivo, à irrevogabilidade do crescimento
celular, à interferência do ruído intracelular e à obstrução da membrana celular, a
transformação de elementos biológicos é muito limitada. Assim, a atual síntese de
bioetanol a partir de S. cerevisiae continua a enfrentar problemas como a imprevisibilidade, a
incompatibilidade e a elevada complexidade, que não podem ser subestimados.
Nos últimos anos, surgiram sistemas biológicos sintéticos sem células (CFSB), que se
referem à ciência da engenharia que implementa os princípios centrais da biologia in vitro,
Fermentação 2023, 9, 709 14 de 22

complementando de forma instrutiva o estudo da biologia sintética. O núcleo deste

sistema consiste em quebrar os grilhões das células, reintegrar os recursos celulares in
vitro e concentrar-se na síntese de
Fermentação 2023, 9, 709 15 de 22

produtos-alvo personalizados [105]. Os sistemas CFSB apresentam vantagens

significativas em termos de tolerância à toxicidade, custo económico, eficiência sintética,
etc. Os sistemas CFSB baseados em extractos de células são meios técnicos amplamente
utilizados atualmente, entre os quais os sistemas CFSB baseados em extractos de células
de E. coli e extractos de células de germe de trigo são os mais maduros entre os sistemas
procarióticos e eucarióticos, respetivamente [106,107]. Há também alguma investigação
sobre o sistema de síntese sem células de S. cerevisiae, mas está apenas a começar e não é
suficientemente profunda [108,109]. No futuro, os sistemas CFSB eficientes baseados em
extractos de células de S. cerevisiae podem ser mais explorados e construídos para estabelecer
a base específica para proporcionar a máxima eficiência de síntese do bioetanol.

5.5. Exploração da deteção de quorum na fermentação de bioetanol

As abordagens não genéticas para alterar o metabolismo podem ter as vantagens da
aplicabilidade geral e do controlo simples. A deteção de quorum é uma forma essencial
de as bactérias efectuarem a comunicação intra-espécie ou inter-espécie, que utiliza a
secreção e a transmissão de moléculas sinalizadoras para fazer com que as bactérias
respondam a alterações na densidade celular e na composição da flora no ambiente [110-
112]. Devido à sua estrutura relativamente simples e ao seu mecanismo transparente, o
sistema é frequentemente utilizado como um módulo genético para caraterizar o
complexo mecanismo de resposta intracelular e a interação de diferentes bactérias, o que
tem um significado de grande alcance para a investigação em biologia sintética [113]. A
deteção de quorum também desempenha um papel essencial no processo de síntese de
bioetanol por S. cerevisiae. Estudos demonstraram que o rendimento do etanol pode ser
melhorado através da adição de moléculas quorum-sensing para inibir o crescimento
celular de
S. cerevisiae [114]. No entanto, não se sabe se o quorum sensing desempenha um papel
importante e como funciona no sistema de fermentação mista de microrganismos e
microalgas. No futuro, vale a pena explorar e elaborar mais sobre se o quorum sensing
poderia realizar a regulação interativa das duas comunidades (por exemplo, S. cerevisiae
e mi- croalgas) no sistema de fermentação, enquanto regula o comportamento espaço-
temporal da comunidade S. cerevisiae no processo de fermentação do bioetanol, para fornecer
novos insights para melhorar a produção de bioetanol.

Contribuições dos autores: H.Z. contribuiu para a redação e edição deste manuscrito. P.Z. e T.W.
contribuíram para a investigação deste estudo. H.R. contribuiu para o desenvolvimento e correção
deste manuscrito. É também a autora correspondente deste artigo. Todos os autores leram e
concordaram com a versão publicada do manuscrito.
Financiamento: Esta investigação foi financiada pelo Projeto de Investigação Científica da
Comissão de Educação de Tianjin (subsídio número 2022KJ004), pelo Gabinete Municipal de
Ciência e Tecnologia de Tianjin (subsídio número 22ZXJBSN00010) e pelo Programa Nacional de
Investigação e Desenvolvimento (subsídio número SQ2022YFE013001).
Declaração do Conselho de Revisão Institucional: Não aplicável.
Declaração de consentimento informado: Não aplicável.
Declaração de disponibilidade de dados: Não aplicável.
Conflitos de interesse: Os autores declaram não haver conflito de interesses.

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