ANEXO I

PROJETO DE PESQUISA
PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA
PIBIC
EDITAL 002/2022 - PIBIC/CNPq

Avaliação da tolerância ao etanol por leveduras fermentadoras de pentoses aclimatadas

em hidrolisado hemicelulósico de torta de girassol

Proponente: Profa. Dra. Lílian de Araújo Pantoja

Área de Conhecimento:
[ ] Ciências Agrárias;
[ x ] Ciências Biológicas;
[ ] Ciências da Saúde;
[ ] Ciências Exatas e da Terra;
[ ] Engenharias;
[ ] Ciências Humanas;
[ ] Ciências Sociais Aplicadas;
[ ] Linguística, Letras e Artes.

Justificativa da escolha da Grande Área para submissão:

O presente projeto está inserido na área de ciências biológicas por se tratar de um estudo que
utiliza micro-organismos (leveduras) capazes de fermentar açúcares em produtos de interesse
para a área de biocombustíveis.

Renovação de Projeto: ( ) SIM ( x ) NÃO

Diamantina, 30 de junho de 2022

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 Identificação da (s) área (s) prioritária (s)

( ) Tecnologias Estratégicas, nos seguintes setores:

( ) Espacial;
( ) Nuclear;
( ) Cibernética;
( ) Segurança Pública e de Fronteira.
( X ) Tecnologias Habilitadoras, nos seguintes setores:
( ) Inteligência Artificial;
( ) Internet das Coisas;
( ) Materiais Avançados;
(X) Biotecnologia;
( ) Nanotecnologia.
( ) Tecnologias de Produção, nos seguintes setores:
( ) Indústria; Agronegócio;
( ) Comunicações;
( ) Infraestrutura;
( ) Serviços.
(X) Tecnologias para o Desenvolvimento Sustentável, nos seguintes setores:
( ) Cidades Inteligentes e Sustentáveis;
(X) Energias Renováveis;
( ) Bioeconomia;
( ) Tratamento e Reciclagem de Resíduos Sólidos;
( ) Tratamento de Poluição;
( ) Monitoramento, prevenção e recuperação de desastres naturais e ambientais;
( ) Preservação Ambiental.
( ) Tecnologias para Qualidade de Vida, nos seguintes setores:
( ) Saúde;
( ) Saneamento Básico;
( ) Segurança Hídrica;
( ) Tecnologias Assistivas.

Justificativa para escolha da (s) área (s) prioritária (s):

Considerando que a fermentação é um processo biológico que ocorre por meio das ações de
micro-organismos e atuam sobre açúcares contidos em uma solução sintética ou complexa, o
presente estudo encontra-se inserido na área de biotecnologia. A partir desses processos
biológicos vários produtos de valor agregado podem ser formados, dentre estes o bioetanol, uma
fonte de energia renovável.

SUMÁRIO
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Introdução 04
Objetivos 06
Justificativa 07

Metodologia 09
Fonte de recursos 14
Cronograma de execução 15
Referências bibliográficas 16

INTRODUÇÃO
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 A dependência global por insumos energéticos do refino de petróleo representa uma
problemática econômica e para a sustentabilidade. Constantemente são avaliadas estratégias
para reduzir o uso de produtos fósseis, que contribuem com a emissão de gases de efeito estufa
e mudanças climáticas. O uso de recursos energéticos alternativos produzidos por biomassa
biodegradável, como o bioetanol, se apresentam como uma das alternativas mais viáveis para
suprir a demanda energética mundial e minimizar os danos ao meio ambiente. (CHEN et al.,
2021; LEONG et al., 2021; ARUWAJOYE et al., 2020).
O bioetanol de segunda geração (2G), produzido a partir de biomassas lignocelulósicas,
é uma alternativa ao etanol produzido com biomassas açúcaradas ou amiláceas, que competem
pelo mercado de alimentos (SADHUKHAN et al., 2019; ALMEIDA; NASCIMENTO, 2021).
Todavia, a biomassa lignocelulósica, composta de celulose, hemicelulose e lignina, enfrenta
alguns desafios técnicos e econômicos na conversão de açúcares em bioetanol. A complexidade
das estruturas dificulta a decomposição dos polissacarídeos para liberação de açúcares
monoméricos, resultando em baixo rendimento de açúcar ou na grande variabilidade da
composição da matéria-prima (GUEDES; SANTOS, A.; SANTOS, H., 2021), na qual dificulta a
padronização das técnicas, bem como a incapacidade dos micro-organismos convencionalmente
empregados nos processos fermentativos em metabolizar os açúcares liberados durante a
hidrólise da hemicelulose (CORTIVO, 2021). Essa etapa de hidrólise, contudo, pode produzir
compostos que inibem os processos posteriores, diminuindo eficiência fermentativa (LIU et al.,
2020; ZHAO; SHAO; CHUNDAWAT, 2020).
A levedura Saccharomyces cerevisiae é o micro-organismo mais recorrente em
fermentações industriais (KUILA e SHARMA, 2016) devido a sua alta eficiência fermentativa,
mas também a resistência à elevada pressão osmótica, a tolerância à variação de pH e tolerância
a produtos inibitórios, como o próprio etanol (MUPONDWA et al., 2017). No entanto, a espécie
S. cerevisiae é incapaz de converter pentoses a etanol (BERŁOWSKA et al., 2016). Nesse
sentido, a busca por micro-organismos capazes de fermentar eficientemente todos os açúcares
existentes no hidrolisado lignocelulósico na presença de inibidores e ainda, tolerar altas
concentrações de etanol pode contribuir para uma melhor eficiência da produção de etanol 2G
(SILVEIRA, 2021).
A linhagem de levedura Candida akabanensis UFVJM-R131 é capaz de fermentar a D-
xilose em etanol, mesmo frente a compostos que são citotóxicos para as células (MATOS et al.,
2017; VALINHAS et al., 2018).
Com o intuito de aumentar a tolerância dessa levedura fermentadora de pentoses frente
aos inibidores celulares e aprimorar o rendimento e a produtividade da fermentação alcoólica, foi
realizado um processo de adaptação celular em hidrolisado hemicelulósico de torta de girassol.
De acordo com Opalek e Wloch-Salamon (2020) a adaptação é um método utilizado para
melhorar características genotípicas do micro-organismo, tais como tolerância aos inibidores,
sensibilidade à temperatura, bem como a produção de bioetanol a partir de substratos
lignocelulósicos. O desempenho fermentativo dessa levedura aclimatada em diferentes
concentrações de etanol, contudo, ainda não foi estudado. Nesse sentido, o presente projeto tem
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como objetivo avaliar a tolerância ao etanol, em diferentes concentrações, na linhagem C.
akabanensis UFVJM R131 silvestre e adaptada.

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 OBJETIVOS

OBJETIVO GERAL

Analisar o efeito de diferentes concentrações de etanol no desempenho da linhagem de levedura

aclimatada em hidrolisado de torta de girassol, Candida akabanensis UFVJM-R131, em
processos fermentativos para produção de etanol.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

I. Avaliar por meio do crescimento celular , consumo de açúcares e produção de etanol, a

tolerância da linhagem de levedura aclimatada estudada (Candida akabanensis UFVJM
R131) a diferentes concentrações de etanol, 2, 4, 6 e 8%.
II. Avaliar o comportamento dos inibidores furfural, 5-hidroximetilfurfural, ácido acético e sua
toxicidade para a linhagem de levedura estudada em meio fermentativo contendo
diferentes concentrações de etanol (2, 4, 6 e 8%).
III. Formar recursos humanos na área de biocombustíveis/biotecnologia.

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 JUSTIFICATIVA

O bioetanol de segunda geração (2G), produzido a partir de biomassas lignocelulósicas, é uma

alternativa ao etanol produzido com biomassas açúcaradas ou amiláceas, que competem pelo
mercado de alimentos (SADHUKHAN et al., 2019; ALMEIDA; NASCIMENTO, 2021). A biomassa
lignocelulósica, necessita de pré-tratamento para quebrar esses polissacarídeos e disponibilizar
açúcares que serão convertidos em etanol por agentes microbianos (ALAYOUBI et al., 2020;
SELVAKUMAR et al., 2022). Apesar de necessária, a etapa de pré-tratamento pode produzir
compostos que inibem o crescimento microbiano ou o processo fermentativo (LIU et al., 2020;
ZHAO; SHAO; CHUNDAWAT, 2020).

A levedura comumente empregada na produção do bioetanol é a Saccharomyces

cerevisiae, uma espécie de referência nessa bioconversão. Esse micro-organismo vem sendo
estudado há décadas, e já se conhece muito do seu desempenho nos processos fermentativos
para produção de etanol. Entretanto, essa levedura não satisfaz todas as características ideais
de um processo fermentativo para produção de bioetanol lignocelulósico, uma vez que não são
capazes de converter as pentoses disponíveis nos hidrolisados em etanol. Uma das alternativas
para o aproveitamento integral dos açúcares provenientes das biomassas lignocelulósicas é a
prospecção por micro-organismos naturalmente ocorrentes com a capacidade de converter
pentoses e hexoses em etanol. Todavia, os micro-organismos naturalmente ocorrentes capazes
de metabolizar esses açúcares apresentam baixa eficiência fermentativa, repressão por glicose,
sensibilidade aos compostos inibidores comumente encontrados nos hidrolisados
hemicelulósicos e baixa tolerância ao etanol (CORTIVO, 2017; LANE et al., 2020; TRAN et al.,
2020; ZHOU & LU, 2021; KUMAR et al., 2022).

O Grupo de Pesquisa de Prospecção Microbiana e Bioprocessos da UFVJM selecionou uma

linhagem de Candida akabanensis UFVJM-R131 isolada de bagaço de cana-de açúcar com
potencial para a produção de bioetanol 2G (VALINHAS et al., 2016; BARBOSA, 2017; MATOS
et al., 2017). Recentemente, o mesmo grupo de pesquisa, realizou um processo de adaptação
evolutiva da linhagem Candida akabanensis UFVJM-R131 com a finalidade de aumentar a
tolerância dessa levedura às substâncias tóxicas ou inibidoras formadas na etapa de pré-
tratamento ácido da torta de sementes de girassol. A existência de microrganismos capazes de
cofermentar glicose e xilose, como é o caso da espécie alvo desse projeto, pode, ao mesmo
tempo, permitir o aumento do rendimento da conversão de biomassas lignocelulósicas em etanol
e reduzir custos de produção.

Pelo exposto, com o projeto apresentado pretende-se aprofundar o conhecimento dos efeitos da
adaptação evolutiva sobre a fermentação de xilose na presença de compostos inibidores,
avaliando parâmetros morfológicos e cinéticos da linhagem de Candida akabanensis UFVJM-
R131 adaptada em comparação com a linhagem silvestre.

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As respostas às questões sugeridas no projeto poderão revelar características metabólicas e
cinéticas que preencherão lacunas científicas sobre a espécie e conduzirão a possível indicação
da nova linhagem microbiana como agente fermentativo ou modelo de estudo para a produção
de etanol de 2ª geração. Como são pouquíssimos os estudos dedicados à espécie C.
akabanensis, as repostas e ou processos resultantes do projeto proposto trará avanços
relevantes para a área de microbiologia aplicada.

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 METODOLOGIA

As etapas experimentais do presente projeto serão executadas nos seguintes

laboratórios: Laboratório de Bioprocessos e Biotransformação (LabBio), Laboratório de Pré-
tratamento e Caracterização de Biomassas Energéticas e Laboratório de Microbiologia para
Biocombustíveis (LabMBio) da Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri
(UFVJM), localizado no Campus JK, Diamantina-MG.
Os procedimentos experimentais serão realizados conforme a Figura 1.

Figura 1. Fluxograma de trabalho do estudo fermentativo com a linhagem de Candida

akabanensis UFVJM R131 adaptada

Fonte: Autoria Própria, 2022

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Reativação e autenticação dos micro-organismos

A linhagem de levedura Candida akabanensis UFVJM-R131, registrada no Sistema

Nacional de Gestão do Patrimônio Genético e do Conhecimento Tradicional Associado (SisGen),
número de cadastro A18446E, estava conservada em meio de cultura Yeast extract-Peptone-
Malt-Dextrose-YEPM (3,0 g L-1 de extrato de levedura; 3,0 g L-1 de extrato de malte; 5,0 g L-1 de
peptona de soja e 10 g L-1 de glicose) contido em microtubos tipo Eppendorf adicionado de
glicerol a 10%. Esta será reativada no mesmo meio, adicionado de mais uma fonte de açúcar,
xilose (YEPMGX). A manutenção do micro-organismo será realizada pela mesma metodologia
da reativação, seguida da conservação da linhagem estudada em glicerol 10% e repique tubo a
tubo.

Investigação da cinética fermentativa

Visando conhecer as melhores condições operacionais para a condução dos processos

fermentativos utilizando a linhagem de levedura Candida akabanensis UFVJM-R131 como
agente do processo, os parâmetros de temperatura e pH serão investigados, observando-se a
toxicidade dos inibidores fermentativos.

Os ensaios serão conduzidos em meio sintético YEPMX (3,0 g L-1 de extrato de

levedura; 3,0 g L-1 de extrato de malte; 5,0 g L-1 de peptona de soja e 20 g L-1 de xilose),
suplementados com etanol nas concentrações de 2, 4, 6 e 8%. Os frascos cônicos serão
inoculados com biomassa contida em volume proporcional a 10% do meio fermentativo,
previamente crescida em meio YEPMD até 1,0 DO610nm. Os ensaios serão conduzidos a 28ºC,
pH 5,0 e 100 rpm por 72 horas. Serão considerados fatores de resposta a taxa de crescimento
celular, a taxa de consumo de açúcares e o rendimento em etanol.

Processo fermentativo

Preparo do inóculo

O inóculo será preparado por meio da transferência de uma alçada da cultura crescida
em meio YPMD sólido para 30 mL de meio YPMD líquido, contido em Erlenmeyer de 50 mL, sob
velocidade de agitação de 100 rpm, à 28°C, por 12 horas. Ao atingir 1,0 de densidade óptica,
uma alíquota do meio será centrifugado a 4000 rpm por 10 min, seguida do descarte do
sobrenadante. As células serão recuperadas e ressuspensas em água e novamente submetida
a centrifugação e então, inoculadas no meio fermentativo na proporção de 10%.
O processo fermentativo será realizado em 50 mL de meio sintético YPMDX líquido
(Yeast extract - Peptone - Malt - Dextrose), composto por 3,0 g L-1 de extrato de levedura; 3,0 g
L-1 de extrato de malte; 5,0 g L-1 de peptona de soja e 5 g L-1 de glicose e 5 g L-1 de xilose,
contidos em frascos cônicos tipo Erlenmeyer de 125 mL. O processo será conduzido sob
velocidade de agitação de 100 rpm, à 28°C e o monitoramento do processo e do crescimento
celular será realizado através da retirada de alíquotas de 1000 µL a cada 4, 6 ou 8 horas, durante

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36 horas. A alíquota será centrifugada a 4000 rpm por 10 minutos e serão realizadas análises de
crescimento e parâmetros fermentativos.

Crescimento

A fim de se conhecer o perfil da linhagem estudada, o processo fermentativo será

monitorado quanto a densidade óptica e viabilidade celular.
A Densidade ótica será avaliada por espectrofotometria, no qual o precipitado celular
será ressuspenso em 1 mL de água destilada estéril e submetido à leitura espectrofotométrica a
610 nm (Densidade Óptica - D.O. 610 nm).
Para realização do peso seco as suspensões provenientes da análise de densidade
óptica serão e colocadas em placas de petri, previamente secas e pesadas. Essas placas serão
levadas para estufa à 105°C até o peso constante. Os valores encontrados na diferença da
pesagem da placa de petri antes e depois do acondicionamento da suspensão celular das
leveduras, serão utilizados para construção das curvas celulares, posteriormente utilizadas para
cálculos de rendimentos fermentativos.
A determinação da viabilidade celular das linhagens de leveduras será realizada
conforme a metodologia de Alves (1998), com a adição da solução de 1% de azul de metileno,
seguida de contagem em câmara de Neubauer, conforme descrito na Figura 2

Figura 2 - Desenho esquemático da Câmara de Neubauer

Fonte: CAMPEBELL; CAMPEBELL (1986), modificado.

O azul de metileno é empregado como indicativo de viabilidade celular, ou seja, as

células vivas se apresentaram incolores e as células não viáveis na coloração azul, quando
observadas no microscópio óptico. O resultado da contagem celular será expresso em número
de células mL-1 de acordo com a Equação 1.

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 (Equação 1)

No qual,
n = média de cinco contagens.
1000 = fator de conversão de mm³ para mL.
0,004 = volume do quadrado onde foi realizada a contagem.

Quantificação de compostos solúveis

A) Concentrações de açúcares redutores (AR): A quantificação de açúcares redutores

nas análises será determinada através do método colorimétrico com ácido 3,5-dinitrosalicílico
(DNS), descrito por Miller (1959) e adaptado segundo Vasconcelos, Pinto e Aragão (2013), no
qual 100 µL do reagente DNS é adicionado à 100 µL da amostra, seguida de incubação em
banho-maria a 70°C por 25 minutos, resfriamento em banho de água e gelo e leitura em
espectrofotômetro com leitor de microplaca (Asys Tech) a 540 nm. O método baseia-se na
redução do ácido 3,5-dinitrosalicílico a ácido 3- amino-5-nitrosalicílico, de coloração
amarronzada, ao mesmo tempo em que o grupo aldeído do açúcar é oxidado a grupos
carboxílicos. Curvas analíticas utilizando D-glicose e xilose como padrão, com concentração
variando de 0,0 a 1,0 g L-1, serão construídas e submetidas simultaneamente aos mesmos
procedimentos que a amostra.
B) Análise cromatográfica: ácido acético, etanol, furfural e 5-hidroximetilfurfural serão
determinados por cromatografia líquida de alta eficiência utilizando sistema Shimadzu
Prominence FPLC 20A equipado com coluna Rezex ROA-Shodex® (300 × 7,8 mm) mantida a
60 ° C. Os analitos serão eluídos com 0,0025 mol L-1 de H2SO4 a uma taxa de fluxo de 0,6 mL
min − 1. O etanol será analisado usando um detector de índice de refração (Modelo RID-20A,
Shimadzu®). O ácido acético, furfural e 5-hidroximetilfurfural serão examinados a 220 nm usando
detector de UV-Vis (Modelo SPD-10AV, Shimadzu®). A identificação e quantificação dos
compostos serão feitas com base em padrões externos.

Parâmetros fermentativos

O processo fermentativo será avaliado quanto às seguintes variáveis de resposta: fator

de rendimento de produção de Etanol (Yp/s); fator de produtividade volumétrica (Qp) e eficiência
fermentativa (EF).

A) Rendimento de etanol (Y p/s): O fator de conversão, que expressa a massa de etanol

produzida por massa de açúcar consumida em gramas, será calculado pela Equação 2.

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 (Equação 2)

Onde:
Yp/s= rendimento em etanol (gp gs-1)
P = concentração final de etanol (g L-1)
Si = concentração inicial de açúcar presente no meio (g L-1)
Sf = concentração final de açúcar presente no meio (g L-1)

B) Produtividade volumétrica de etanol (Q p g L-1 h-1): A produtividade volumétrica de etanol será

expressa com base na quantidade de etanol produzido (g L-1) por tempo de fermentação (h) e
calculada de acordo com a Equação 3, a seguir.

(Equação 3)

Onde:
Qp = produtividade volumétrica (g L-1 h-1)
P = concentração final de etanol (g L-1)
t = tempo de fermentação (h)

C) Eficiência Fermentativa - Ef (%): A eficiência fermentativa, expressa em %, representa a razão

entre o fator de rendimento Y p/s (gp gs-1) obtido experimentalmente e o fator de rendimento teórico
(Yt) de 0,511 g g-1 de glicose e/ou xilose consumida. Os valores serão obtidos por meio da
Equação 4, a seguir:

(Equação 4)

Onde:
Ef= eficiência fermentativa (%)
Yp/s = rendimento em etanol (g g-1)

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 FONTE DOS RECURSOS

INSTALAÇÕES (INFRAESTRUTURA FÍSICA)

O presente projeto contará com a infraestrutura do Laboratórios de Bioprocessos e

Biotransformação e do Laboratório de Microbiologia Aplicada a Biocombustíveis.

EQUIPAMENTOS

Os equipamentos listados a seguir já se encontram à disposição para as atividades previstas

no projeto (Tabela 1).

Tabela 1. Lista de equipamentos do laboratório de Bioprocessos e Biotransformação

Equipamentos Valor estimado (R$)
Estufa microbiológica 4.000,00
Estufa de secagem 3.000,00
Autoclave 75L 4.500,00
Banho-maria 2.000,00
Jogo de pipetas automáticas 5.000,00
Centrífuga de bancada 1.500,00
Centrífuga de bancada refrigerada 20.000,00
Centrífuga de bancada tipo Eppendorf 3.800,00
Capela de fluxo laminar nível II 15.000,00
Câmara Incubadora Refrigerada com Agitação Orbital (Shaker) 15.800,00
Microscópio óptico com câmera digital e sistema de documentação de 6.000,00
imagens
Microscópio óptico binocular 2.500,00
Balança analítica 4.500,00
Balança semi-analítica 2.500,00
Micro-ondas 400,00
Geladeira duplex 2.500,00
Freezer vertical 1.200,00
Potenciômetro 700,00
Agitador magnético 800,00
Espectrofotômetro UV/visível 14.000,00
Leitor de placas 20.000,00
Espectrofotômetro UV/visível 7.000,00
Bomba à vácuo 1.500,00
Purificador de água 10.000,00
Valor da contrapartida 232.200,00

O valor e identificação existentes que integrarão a contrapartida proposta, listados acima,

totalizam um valor de R$ 232.200,00

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 CRONOGRAMA DE EXECUÇÃO
_____________________________________________________________________

2022 2023
Atividades
set out nov dez jan fev mar abr mai jun jul ago
Revisão Bibliográfica x x x x x x x x x x x x

Planejamento e treinamento x x x
Reativação e autenticação das leveduras x x
Manutenção das linhagens de leveduras x x x x
Avaliação do efeito do etanol na concentração 2% para a viabilidade da levedura C. x
akabanensis UFVJM-R131
Avaliação do efeito do etanol na concentração 4% para a viabilidade da levedura C. x x
akabanensis UFVJM-R131
Avaliação do efeito do etanol na concentração 6% para a viabilidade da levedura C. x x
akabanensis UFVJM-R131
Avaliação do efeito do etanol na concentração 8% para a viabilidade da levedura C. x x
akabanensis UFVJM-R131
Apresentação de trabalhos em eventos científicos x x x x
Elaboração do relatório final x x

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 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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ALMEIDA, S. C.; NASCIMENTO, D. D. DO R. Revisão : leveduras utilizadas na produção de

etanol de segunda geração. Bioenergia em revista: diálogos, v. 11, n. 1, p. 99–119, 2021.

ARUWAJOYE, G.S.; SEWSYNKER-SUKAY, Y.; KANA, E.B.G. Valorisation of cassava peels

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CORTIVO, Paulo Roberto Dall. Produção de etanol de segunda geração por leveduras
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MUPONDWA, E.; LI, X.; TABIL, L.; SOKHANSANJ, S.; ADAPA, P. Status of Canada's
lignocellulosic ethanol: Part II: Hydrolysis and fermentation technologies. Renewable and
Sustainable Energy Reviews, v. 79, p. 1535-1555, 2017.

OPALEK, M.; WLOCH-SALAMON, D. Aspects of Multicellularity in Saccharomyces cerevisiae

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