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Revista de Gestão Ambiental 293 (2021) 112966

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Revista de Gestão Ambiental

página inicial do jornal: www.elsevier.com/locate/jenvman

Melhoria do desempenho do processo para a produção simultânea de

enzimas ligninolíticas em cultura sólida utilizando resíduos agrícolas através da
Método Taguchi
Jazel Sosa-Martínez , Nagamani Balagurusamy b , Juan Roberto Benavente-Vald´es
uma uma

,
˜a uma,*
Julio Montanez , Lourdes Morales-Oyervides
uma

Departamento de Engenharia Química, Faculdade de Ciências Químicas, Universidade Autônoma de Coahuila, Boulevard Venustiano Carranza SN, Saltillo, Coahuila, 25280,
México
b
Laboratório de Biorremediação, Faculdade de Ciências Biológicas, Universidade Autônoma de Coahuila, Libramiento Torre´ on-Matamoros, Torre´ on, Coahuila, 27000, México

INFORMAÇÕES DO ARTIGO ABSTRATO

Palavras-chave: Apesar de uma grande quantidade de pesquisas publicadas sobre a produção de enzimas ligninolíticas, estas ainda não estão
Fanerochaete chrysosporium sendo aplicadas no combate à poluição ambiental. Nenhum processo econômico foi desenvolvido até o momento. Este estudo
Otimização descreve um aprimoramento do procedimento de fermentação em estado sólido para a produção de enzimas ligninolíticas via
Multi-resposta Phanerochaete chrysosporium ATX, aplicando o método de Taguchi e utilizando como substrato um resíduo agroindustrial. A
Ambiental
produção de lignina peroxidase (LiP), manganês peroxidase (MnP) e lacase (Lac) foi aumentada simultaneamente em uma coluna
Biorrefinaria
de leito empacotado. Os fatores e níveis estudados foram umidade (A: 60, 70, 80%), concentração de inóculo (B: 7,5, 10,0, 12,5 ×
105 esporos/mL), densidade compactada (C: 0,14, 0,16, 0,18 g/mL), e tempo (D: 6, 8, 10 dias). Os resultados mostraram que a
umidade foi o fator com maior efeito sobre a produção de LiP e Lac's, enquanto o tempo foi para MnP. A umidade exerceu a maior
influência sobre a conveniência global do processo. Condições melhoradas (A, 60%; B, 1,0 × 106 esporos/mL; C, 0,17 g/mL; D, 8
dias) foram ainda validadas: os resultados revelaram um aumento geral de conveniência de 237% em relação ao processo não
otimizado. O desempenho do processo também foi mantido em uma escala maior (1:10). Os resultados contribuem para o
estabelecimento de um bioprocesso econômico para a produção de enzimas ligninolíticas, reduzindo o custo associado às matérias-
primas e etapas de purificação.

1. Introdução hidrocarbonetos, produtos farmacêuticos e outros contaminantes (Yadav e Yadav, 2015;

O aumento da superpopulação e a industrialização geraram um alto volume de
resíduos e poluentes contaminando o solo, a água e o ar (Azubuike et al., 2016). Nesse
sentido, a degradação microbiana surgiu como um tratamento ecologicamente correto
para biorremediação de poluentes (Bhandari et al., 2021). Além disso, a utilização de
extratos enzimáticos microbianos para degradação de poluentes pode proporcionar um
processo mais controlado evitando o longo tempo de adaptação do microrganismo,
efeitos inibitórios devido a contaminantes ou acúmulo de biomassa (Okino-Delgado et
al., 2019).
Os fungos da podridão branca são capazes de excretar um coquetel enzimático
amplamente utilizado na degradação da lignina, o composto orgânico mais resistente à
degradação (Alcalde, 2015). Estas enzimas extracelulares têm sido utilizadas na
biodegradação de corantes sintéticos, corantes aromáticos policíclicos
Zdarta et al., 2019; Zhang et al., 2016).
Um dos principais fungos da podridão branca é o Phanerochaete chrysosporium,
que é capaz de produzir duas enzimas peroxidase (lignina peroxidase, LiP; manganês
peroxidase, MnP) e uma enzima fenoloxidase (lacase, Lac) (Kersten e Cullen, 2007).
Embora um número significativo de estudos tenha abordado a produção de tais enzimas
por Phaner ochaete chrysosporium, uma restrição crucial para a aplicação de enzimas
ligninolíticas é a necessidade de produzir grandes volumes das mesmas a um custo
acessível, como foi apontado recentemente (Chowdhary et. al., 2019). O interesse em
desenvolver um bioprocesso eficiente, sustentável e econômico para sintetizar enzimas
ligninolíticas está aumentando (Atila no-Camino et al., 2020).
Um dos potenciais bioprocessos conhecidos por oferecer tais vantagens é a
fermentação em estado sólido (FSS), na qual os resíduos orgânicos podem ser utilizados como

* Autor correspondente.
E-mail: lourdesmorales@uadec.edu.mx (L. Morales-Oyervides).

https://doi.org/10.1016/j.jenvman.2021.112966 Recebido em
26 de janeiro de 2021; Recebido em formulário revisado em 19 de maio de 2021; Aceito em 29 de maio de 2021
Disponível online em 4 de junho de 2021
0301-4797/© 2021 Elsevier Ltd. Todos os direitos reservados.
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o substrato, semelhantes aos gerados pelas indústrias agropecuária, alimentícia e
florestal (Rodríguez-Couto, 2018). Tais resíduos agroindustriais podem servir como
suporte para a SSF e como fonte de nutrientes (Naidu et al., 2020). Os processos que
utilizam resíduos oriundos da agroindústria são de fundamental interesse econômico para
países em desenvolvimento, onde são gerados altos níveis desses subprodutos.
No México, em particular, devido à extensão das terras cultivadas em certas regiões
agrícolas, a quantidade de resíduos derivados de materiais orgânicos tornou-se uma
fonte problemática de poluição ambiental (Corredor e P´erez, 2018). O grande volume de
resíduos gerados supera a capacidade de biodegradação da natureza, causando um
acúmulo desses resíduos. Tornam-se, assim, um risco para o equilíbrio do ecossistema,
pois são depositados em campo aberto ou queimados no local, causando ainda mais
poluição (Corredor e P´erez, 2018).
uma solução crioprotetora contendo glicerol (20% v/v) e leite desnatado (20% v/v). Para
a preparação do inóculo, 1 mL de solução crioprotetora foi inoculado em Erlenmeyer de
250 mL contendo 50 mL de meio BDA (pH 5,6 ± 0,2). A cepa foi inoculada nos frascos
antes da solidificação do meio, então o frasco foi agitado suavemente para garantir que o
fungo crescesse homogeneamente em toda a superfície. Os frascos foram incubados a
30 ÿC por 5 dias. Após esse intervalo de tempo, os esporos foram retirados da superfície
do PDA usando uma agitação magnética esterilizada e água estéril. A suspensão de
esporos foi observada ao microscópio (40 X, Carl Zeiss®) e a concentração foi medida
usando uma câmara de Neubauer (Fischer Scientific ltd) após diluições apropriadas.

Esforços consideráveis foram feitos para avaliar diferentes resíduos 2.3. Desenho experimental estatístico

que poderiam ser potencialmente utilizados para a produção de enzimas ligninolíticas

(Akpinar e Ozturk Urek, 2012; Gassara et al., 2010, 2011; Xu et al., 2020; Yasmeen et Aplicamos o método Taguchi para determinar o efeito individual e combinado de

al., 2013). No entanto, devido à natureza do processo, quando um novo resíduo está quatro fatores diferentes sobre o SSF projetado para maximizar a produção de Lignina

sendo testado, não é aconselhável definir as condições para a produção dessas enzimas peroxidase (LiP), Manganês Peroxidase (MnP) e Lacase (Lac). Os fatores avaliados,

a partir de recomendações da literatura para diferentes suportes. seus níveis e códigos atribuídos são apresentados na Tabela 1. Os fatores selecionados
são fatores importantes para o crescimento do organismo em SSF. A suplementação,

A SSF depende de um grande número de variáveis operacionais, como temperatura, como o uso de indutores, não foi considerada porque não se desejava aumentar os

umidade, pH, densidade compactada e aeração (Singhania et al., 2009). Esses fatores custos de produção. Os estudos preliminares incluíram a triagem de diversos resíduos

irão interagir ativamente com as características específicas do resíduo utilizado e do da agroindústria que promoveram tanto o crescimento de microrganismos quanto a

fungo, gerando assim rendimentos de produção específicos. A identificação do conjunto produção de enzimas ligninolíticas sem a necessidade de adição de cofatores.

ótimo de condições para todas as enzimas ligninolíticas exigiria um número excessivo de

testes experimentais para varrer todo o espaço da solução (combinando níveis de fatores
operacionais dentro de uma faixa viável).

2.4. Condições de cultura para melhoria de processos

Dentre os métodos de otimização disponíveis, o método Taguchi requer apenas um
mínimo de ensaios experimentais para otimização e melhoria do processo; além disso,
A fermentação em estado sólido foi realizada para produzir enzimas por Phanerchaete
não requer o ajuste de um modelo matemático aos dados experimentais (RanjitK, 2001).
chrysosporium ATX usando sabugo de milho como suporte e substrato.
Na prática industrial, a aplicação de um projeto experimental adequado e a análise de
O material carreador foi impregnado com o meio de suplementação mineral e a umidade
resultados para melhoria do processo tem se tornado um método cada vez mais popular
foi ajustada de acordo. Todos os experimentos foram realizados em colunas de leito
para reduzir a variabilidade do processo. Sempre que um novo suporte/substrato está
empacotado (tubo de polipropileno autoclavável) com diâmetro interno de 2,85 cm e
sendo avaliado para sintetizar essas enzimas, é fundamental selecionar um desenho
altura de 12 cm. A temperatura ótima relatada para Phanerchaete chrysosporium é em
experimental apropriado que minimize os recursos necessários para identificar os níveis
torno de 30–37 ÿC; no entanto, a temperatura do processo foi fixada em 30 ÿC para evitar
operacionais ideais.
a degradação das enzimas pelo calor gerado em maior escala (Rodríguez-Couto et al.,
2006). Outras condições de processo foram variadas de acordo com a matriz experimental
Portanto, este estudo tem como objetivo identificar os parâmetros críticos para a
L9 Taguchi (Tabela 2).
síntese simultânea de enzimas ligninolíticas por Phanerochaete chrys osporium ATX em
SSF utilizando sabugo de milho como substrato e melhorar o processo pelo método de
Taguchi.

2.5. Condições de cultivo em uma coluna de leito empacotado

2. Materiais e métodos

As condições de processo otimizadas foram validadas em uma coluna de leito

2.1. Matéria prima e mídia
empacotado em escala (1:10) (Material suplementar, Figura S1). A coluna consistia em
´ um recipiente de vidro cilíndrico (500 mL) conectado a um umidificador de ar para
A espiga de milho foi coletada de um agricultor local (Torreon, Coahuila). O resíduo
fornecer ar (umidade relativa de 95-100%) no fundo da coluna para manter a umidade
foi moído em moinho de corte (Retsch SM 100, Alemanha) e seco a 60 ÿC em estufa de desejada dentro da coluna. A coluna foi preenchida com sabugo de milho suficiente para
convecção (CEB-2600, México). O resíduo foi caracterizado quanto à lignina, celulose,
atingir a densidade de compactação desejada e foi umedecida com o meio de
hemicelulose, ponto crítico de umidade (CHP) e índice de absorção de água (IAA) suplementação (ambas as condições obtidas nos experimentos de Taguchi). O volume
(Goering e Van Soest, 1970; Horwitz, 1980). Partículas de 1–3 mm foram usadas para os de trabalho máximo permitido foi de 90% do volume total. As temperaturas de entrada e
experimentos SSF.
saída do ar foram monitoradas continuamente e a temperatura ambiente foi ajustada
para manter a temperatura da cultura em 30 ÿC.
O meio de suplementação mineral para SSF consistiu em (% p/p): 20,0 KH2PO4, 5,0
MgSO4, 1,0 CaCl2, 0,5 MnSO4, 1,0 NaCl, 0,1 FeSO4, 0,1 CoCl2, 0,1 ZnSO4, 0,1 CuSO4,
0,001 AlK(SO4)2, 0,001 H3BO3 (Tien e Kirk, 1988). O ágar batata dextrose foi usado
Tabela
para a preparação do inóculo (meio ATCC 336, PDA, BD 213400, 39 g/L).
1 Fatores avaliados, seus níveis e códigos atribuídos.
Fatores Códigos

ÿ1 0 1
2.2. Preparação de fungos e inóculo
Umidade (A, %) 60 70 80

Phanerochaete chrysosporium ATX adquirido da Coleção de Culturas de Tipo Inóculo (B, esporos/mL) 7,5 × 105 1,0 × 106 2,5 × 106
Densidade compactada (C, g/mL) 0,14 0,16 0,18
Microbiano do CINVESTAV (Cidade do México, México) foi usado para sintetizar enzimas
Tempo (D, dias) 6 8 10
ligninolíticas. A tensão foi mantida a -20 ÿC em

2
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Tabela valor para cada resposta foi transformado em um valor de desejo adimensional, d. A
2 Desenho experimental e resultados médios (> 10 réplicas) de LiP, MnP, Lac e desejabilidade variou de zero (resposta inaceitável) a um (alvo ideal). Neste estudo, todas
desejabilidade global. as respostas foram quanto maiores, melhor. A função normalizada (dRi) pode ser expressa
Fatores de execução Respostas
como:

AB C D LiP (U/mL) MnP (U/mL) Lac (U/ DG ÿ 0,

mL) XRi = min[XRi ]
XRi ÿ min[XRi ]
1 ÿ 1 ÿ 1 ÿ 1 ÿ 1 5,52 ± 2,50 ± 1,19 ± 0,19 ± dRi = min[XRi ] ÿ XRi ÿ max[XRi ] (1)
ÿÿÿÿÿ

max[XRi ] ÿ min[XRi ]
2,35 0,80 0,42 0,06 XRi = max[XRi ]
2 - 10 0 0 5,33 ± 4,16 ± 3,45 ± 0,48 ± ÿÿÿÿÿ
1,
1,89 1,54 1,47 0,11
3 ÿ11 1 1 3,86 ± 3,45 ± 2,37 ± 0,33 ±
onde X(Ri) foi o valor obtido em cada nível de cada fator examinado, max[X(Ri)] representa
1,46 1,46 0,91 0,04
4 0 ÿ1 0 1 5,79 ± 2,62 ± 1,21 ± 0,28 ± um valor maior que o máximo obtido em todo o conjunto de dados e min[X(Ri)] representa
1,93 0,71 0,62 0,08 um valor inferior ao mínimo obtido em todo o conjunto de dados. A função de desejabilidade
5 0 0 1 ÿ 1 3,62 ± 1,06 ± 0,33 ± 0,09 ±
global (DG) foi definida como:
1,46 0,46 0,09 0,06
6 0 1 ÿ1 0 4,93 ± 4,21 ± 0,53 ± 0,17 ±
1,70 1,38 0,06 0,06
dwi
7 1 ÿ1 1 0 0,17 ± 4,81 ± 0,76 ± 0,06 ± (2)
0,04 1,54 0,17 0,02 DG = (ÿn i=1
R)
8 1 0 ÿ1 1 2,24 ± 0,67 ± 0,50 ± 0,05 ±
0,31 0,26 0,16 0,03
onde i representa cada resposta, n o número total de respostas, wi, é definido pelo analista
9 1 1 0 ÿ 1 0,08 ± 1,16 ± 0,26 ± 0,01 ±
0,01 0,40 0,03 0,00 para representar a importância de cada resposta, satisfazendo o

condições 0< wi < 1 e ÿn wi = 1 (Vera Candioti et al., 2014).

eu

2.6. Métodos analíticos

2.7.2. Influência relativa de fatores e respostas estimadas

A extração e quantificação das enzimas foram realizadas de acordo com métodos
As respostas simples (LiP, MnP e Lac) e DG foram inicialmente analisadas com uma
previamente relatados com pequenas modificações (Kuwahara et al., 1984; Niku-Paavola
análise de variância (ANOVA) de duas vias (Morales-Oyervides et al., 2017). Se todas as
et al., 1990; Tien e Kirk, 1988), ) é definida como a quantidade da enzima este
interações forem desprezíveis, então o nível para cada fator capaz de maximizar a resposta
1
em que 1 U (ÿmol minÿ catalisa
alvo foi escolhido independentemente, e foi aquele com o subconjunto de dados que rendeu
a conversão de 1 ÿmol de substrato por minuto sob as condições especificadas do método
a maior média de resposta (Morales-Oyervides et al., 2017):
de ensaio. Resumidamente, as amostras foram extraídas com tampão acetato (50 mM, pH
4,5, 1:5 w/v) e misturado a 200 rpm por 60 min em um agitador orbital à temperatura
ambiente. Os sólidos foram então separados por centrifugação a 6654g por 15 min. O ilj = i| (3)
Max( Ri,j )
sobrenadante foi filtrado através de papéis de filtro de 0,50 ÿm. O filtrado do substrato foi
analisado para determinação da atividade da enzima ligninolítica.
onde ilj é o nível selecionado do fator j e i| a configuração i de
Max(Ri,j)
A atividade de LiP foi medida conforme descrito por Tien e Kirk em 1988 (Tien e Kirk, fator j que apresentou a maior média de cada resposta em cada fator entre os níveis
1988): 1 U de atividade é definido como 1 ÿmol de álcool veratrílico oxidado em aldeído avaliados (Ri,j).
veratril por minuto. Cada mistura de reação (1 mL) continha 0,2 mL de tartarato de sódio As respostas estimadas (Repouso) foram obtidas usando adição de médias marginais
(100 mM, pH 3,0), 0,1 mL de álcool veratrílico (10 mM) substituído pelo mesmo volume de (Morales-Oyervides et al., 2017):
tartarato de sódio na mistura de controle, 0,65 mL de extrato enzimático e 0,05 mL de H2O2
(10 mM). A reação foi iniciada com H2O2, e a formação do veratraldeído foi monitorada em (4)
Resto = R +ÿnf
j=1
310 nm (espectrofotômetro Genesys 100 UV-visible, EUA). ( Rilj - R )

A atividade de MnP foi medida pela oxidação de 2,6-dimetoxifenol (2,6-DMP),
monitorando o aumento da absorbância em 568 nm; uma unidade (U) de MnP foi definida
como um ÿM de 2,6-DMP oxidado por minuto (Kuwahara et al., 1984). 1 mL de mistura de
reação continha 0,1 mL de MnSO4 (15 mM), 0,2 mL de tartarato de sódio (50 mM, pH 5,0),
0,1 mL de DMP (15 mM), 0,5 mL de extrato enzimático e 0,1 mL de H2O2 (10 mM ).
onde R é a média de cada resposta de todas as réplicas obtidas em todas as nove corridas
(grande média), nf é o número de fatores, Rilj é a média das réplicas obtidas com o fator j
na configuração escolhida ilj (Mais de 10 réplicas para cada tentativa). O intervalo de
confiança das previsões para um nível de confiança de 90% foi calculado conforme relatado
anteriormente (Butler, 2003).

A reação foi iniciada pela adição de H2O2.
A atividade de Lac foi medida usando 2,2'- azino bis (ácido 3-etilbenztiazo linha-6-
sulfônico) (ABTS) como um substrato que é oxidado ao cátion radical ABTS+ indicado por
um aumento na absorbância em 436 nm: uma unidade ( U) de Lac foi definido como um ÿM
ABTS oxidado por minuto (Niku-Paavola et al., 1990). 1 mL de mistura de reação continha
0,3 mL de tampão acetato (50 mM, pH 5,0), 0,6 mL de extrato enzimático e 0,1 mL de ABTS
(1 mM). A reação foi desencadeada pela adição de ABTS.
2.7.3. Ensaios de validação e identificação de efeitos interativos
Em toda abordagem de otimização, é recomendado realizar um teste de validação das
condições ótimas, principalmente se o método aplicado não varrer todo o espaço da
solução. Assim, os níveis escolhidos para condições melhoradas (Eq. (3)) foram ainda
validados. Se os resultados experimentais dos testes de validação estiverem dentro do
intervalo de confiança das previsões (Eq. (4)), pode-se aceitar as condições melhoradas
determinadas com a análise de Taguchi L9. Se os resultados estiverem fora do intervalo de
confiança, algumas interações entre os fatores podem ser significativas.

2.7. Análise de dados Foi proposto identificar potenciais interações significativas entre os fatores, analisando
os dados de projeto saturado como um projeto fatorial completo, a fim de obter um modelo
2.7.1. Melhoria de várias respostas de superfície em que apenas dois dos fatores são relevantes (Morales-Oyervides et al.,
As respostas avaliadas (LiP, MnP e Lac) foram reduzidas a uma única resposta pela 2017). Para cada par de fatores, um modelo de superfície é aplicado para estimar a resposta:
aplicação de uma “função de desejabilidade”, que nos permitiu obter uma solução global
(Vera Candioti et al., 2014). O medido

3
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m + a4,m,nil2n + a5,m,nilmiln
Descanso,m,n = a0,m,n + a1,m,nil + a2,m,niln + a3,m,nil2 3.2. Otimização das condições de cultura

+ a6,m,nil2 miln + a7,m,nilmil2n + a8,m, nil2 mil2n (5)

Estudos de fermentação em estado sólido sob as condições experimentais descritas
acima revelaram um efeito significativo na produção final de enzimas das três enzimas
onde Rest,m,n é a resposta estimada obtida atribuindo os resultados exclusivamente aos
avaliadas. Um arranjo ortogonal Taguchi L-9 com respostas médias é apresentado na Tabela
efeitos principais e interativos dos fatores m e n, ilm e iln são as configurações de seleção
2. Nas condições examinadas, o Ensaio 1 registrou a produção máxima de LiP (5,79 ±
utilizadas para as tentativas de validação para os fatores m e n, respectivamente. Os
coeficientes a para o par de fatores são obtidos via regressão não linear. Análises estatísticas
1,93 U/mL), o MnP máximo (4,81 ± 1,54 U/mL) foi observado no Ensaio 7, e o Ensaio 2
e ajustes de modelos foram realizados com o STATISTICA 7.1. (StatSoft, Inc., 2005; EUA) e
apresentou o Lac máximo (3,45 ± 1,47 U/mL). Os fatores em estudo exerceram um efeito
Excel (Microsoft, 2010; EUA).
diferente nas três enzimas avaliadas: para determinar a importância relativa de cada fator
nas respostas, foi realizada uma análise de variância (ANOVA). Não é aconselhável concluir

3 Resultados e discussão apenas a partir de um conjunto de dados como o apresentado na Tabela 2.

3.1. Triagem de resíduos agrícolas

Os resultados da ANOVA são incluídos como material suplementar (Tabela S2).
Para todas as respostas, um erro da ordem de ÿ35% explica uma proporção considerável do
Vários resíduos agrícolas foram selecionados para a produção de enzimas ligninolíticas
desempenho do processo. Nós, portanto, assumimos que outros fatores não controlados
sem a adição de qualquer cofator e ajuste de pH. De fato, a adição de cofatores ou ajuste de
podem estar na raiz da variabilidade do sistema, ou interações entre os fatores podem estar
pH pode aumentar a produção de enzimas; mas, nosso objetivo foi selecionar um resíduo
ocorrendo. De qualquer forma, se os efeitos interativos são desprezíveis, então a influência
que exigisse o mínimo de tratamentos e adição de outros nutrientes, cofatores ou mediadores
relativa dos fatores nas respostas avaliadas foi diferente.
para evitar o aumento dos custos de processamento. A composição e os resultados dos
resíduos utilizados podem ser vistos como material complementar (Tabela S1; Figuras S2-
A umidade é o fator mais importante que afeta a produção de LiP (51,3%). Os demais
S5). As atividades ligninolíticas (LiP, MnP e Lac) variaram com os substratos estudados. A
fatores são significativos, mesmo que seu efeito combinado seja da ordem de 11,2%. No
espiga de milho foi um dos resíduos com
caso do MnP, o fator que dominou o desempenho do processo foi o tempo (46,6%), seguido
da concentração do inóculo (10,3%). O efeito combinado de umidade e densidade de
o maior potencial para ser utilizado como suporte e substrato na cultura sólida por P.
compactação explica apenas 9,7% da produção de MnP. No caso da produção de Lac, a
chrysosporium para a síntese simultânea das três enzimas ligninolíticas. Entretanto, dentre
umidade foi o fator que exerceu maior efeito (40,8%), seguido do tempo (10,7%) e da
os resíduos avaliados, o sabugo de milho não foi o resíduo com maior teor de lignina (lignina,
densidade de compactação (8,1%). Para esta enzima, a porcentagem de inóculo apresentou
9,73%; celulose, 16,20%; hemicelulose, 43,74%). Há muito se considera que P. chrysosporium
um efeito quase desprezível (1,9%). A partir desses resultados, só se pode concluir que, em
utiliza celulose como substrato para o crescimento; porém, entra no metabolismo secundário
grande medida, os fatores examinados exerceram um efeito diferente em cada um dos
na presença de lignina, secretando uma mistura de enzimas que degradam a lignina
avaliados.
(Wymelenberg et al., 2009). Assim, apesar do baixo teor de lignina, o sabugo de milho
favoreceu a expressão do complexo enzimático ligninolítico possivelmente devido a outros
respostas.
aspectos relacionados ao substrato, como condições de cultura deficientes em nutrientes,
A Fig. 1 mostra o efeito médio de fatores individuais em LiP, MnP e Lac. A umidade
metais traço e cofatores naturais (Gassara et al., 2010; Korripally et al . ., 2015).
exerceu um efeito negativo nas três respostas. Para LiP, um nível de produção mais alto
pode ser alcançado em 60–70% da umidade inicial, e a produção diminui drasticamente
quando um nível de umidade de 80% é aplicado. A umidade exerce um efeito linear negativo
Por exemplo, altos níveis de produção de enzimas foram relatados na produção de
na produção de MnP, embora este varie apenas entre 3,37 e 2,21 U/mL aumentando o nível
enzimas ligninolíticas por P. chrysosporium utilizando resíduos com diferentes composições
de umidade de 60 a 80%. A produção de Lac diminuiu drasticamente quando a umidade foi
de lignina, como palha de arroz (6-10%) e semente de girassol (24-28%) (Postemsky et al. ,
superior a 70%. O nível mínimo de umidade promoveu a maior atividade enzimática entre
2017). Apesar dos diferentes teores de lignina nesse estudo, ambos os resíduos foram
todas as respostas (60%). Na literatura, o teor de umidade ideal inicial para a produção de
promissores para a produção de enzimas ligninolíticas. Assim, em geral, as lignoceluloses
SSF de enzimas ligninolíticas por Phanerochaete chrysosporium usando resíduos
podem ser utilizadas por P. chrysosporium como suporte, fonte de nutrientes e também como
agroindustriais varia significativamente de 60% a 80% (Gassara et al., 2010, 2011; Li et al.,
indutor do metabolismo secundário (produção de enzimas). De fato, deve-se considerar que
2015; Zeng et al . ., 2015), contrastando assim com o teor de umidade inicial (40-60%)
a composição do substrato influencia diretamente a expressão de certos genes de P.
recomendado para o crescimento de fungos em fermentação em estado sólido (Singhania et
chrysosporium, bem como a síntese de cofatores e mediadores no processo de degradação
al., 2009).
da lignina (Kamesh war e Qin, 2017; Skyba et al., 2016 ).

Consequentemente, é crucial estudar o efeito da umidade inicial quando um novo material

Além disso, o teor de água é um fator crítico que afeta um processo SSF; portanto,
de suporte (resíduo) está sendo avaliado.
características como ponto crítico de umidade (CHP) e índice de absorção de água (WAI)
Em relação ao efeito da concentração do inóculo, o nível mínimo foi ótimo para LiP e
são cruciais para a seleção de um material para a cultura sólida (Orzua et al., 2009). Corncob
MnP, e um nível intermediário foi ótimo para Lac. Em SSF, geralmente é recomendado um
apresentou CHP de 7,69 ± 0,86% e ICT de 6,96 ± 0,40%.
tamanho de inóculo grande para manter o crescimento homogêneo, o que pode impactar
profundamente o resultado do processo (Manan e Webb, 2018). Com relação à produção de
CHP representa a quantidade de água vinculada ao suporte. Normalmente, um processo
enzimas ligninolíticas por Phanerochaete chrysosporium, não é fácil extrapolar um nível ótimo
SSF é ajustado para níveis de umidade de 30 a 80%, que dependerão do tipo de substrato
de inóculo da literatura.
utilizado; desde que o teor de umidade do resíduo seja inferior a 30%, é possível ajustá-lo ao
nível desejado (Orzua et al., 2009). Substratos com alto teor de água não são viáveis para
Alguns estudos relatam uma concentração de inóculo em uma faixa de 1 × 106 - 1 × 107
SSF (Mansour et al., 2016). Respeitando os resultados do WAI, este valor indica a quantidade
esporos/mL (Gassara et al., 2010; Zeng et al., 2015), enquanto outros estudos usam apenas
de água que é absorvida pelo substrato.
uma certa quantidade de plugs (Li et al. ., 2015) ou usar micélio como inóculo em vez de
esporos (Asgher et al., 2006). Em nosso estudo, entretanto, o nível de concentração do
O suporte deve absorver o máximo de água possível para realizar uma fermentação sólida;
inóculo exerceu um efeito mínimo sob os níveis examinados. Atribuímos isso à distribuição
desta forma, o metabolismo do fungo pode ser mantido (Orzua et al., 2009).
totalmente homogênea dos esporos desde o início do processo (Manan e Webb, 2018).

O efeito da densidade compactada é totalmente diferente para cada um dos três

4
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J. Sosa-Martínez et al.
Fig. 1. Desempenho dos fatores individuais em diferentes níveis para cada
resposta avaliada.
enzimas. Exerceu efeito linear negativo sobre LiP, foi oposto para MnP (efeito
linear positivo) e o efeito sobre Lac foi quadrático. Assim, os níveis ótimos para o
fator de densidade compactada também foram diferentes para todas as respostas.
Os níveis ótimos de densidade compactada foram o mínimo para LiP, o nível
mais alto para MnP e um nível intermediário para Lac.
A densidade compactada e o carregamento da coluna estão relacionados à área
disponível para troca de calor e massa: o espaço reduzido entre as partículas
pode resultar em uma transferência inadequada de calor e massa; portanto, para
ampliar o procedimento, deve-se considerar o uso de um mecanismo de agitação
(Singh nee' Nigam e Pandey, 2009). Neste processo, no entanto, o efeito da
densidade compactada é inferior a 10% para todas as enzimas; portanto, dentro
da faixa estudada, um nível pode ser selecionado com alguma confiança de que
não impactará negativamente as atividades enzimáticas esperadas.
O fator tempo exerceu um efeito linear positivo sobre LiP, enquanto um efeito
quadrático foi observado para MnP e Lac. Os níveis ótimos foram de 10 dias
para as enzimas LiP e 8 dias para as enzimas MnP e Lac. Isso implica que se
MnP ou Lac são os alvos, o processo deve ser interrompido antes que a
concentração máxima de LiP seja alcançada. O tempo tem um impacto
significativo no MnP (>45%): após 8 dias de fermentação, a atividade da enzima
diminui consideravelmente. Períodos de incubação prolongados de 7 a 22 dias
são geralmente necessários para sintetizar enzimas ligninolíticas via
Phanerochaete chrysosporium na fermentação em estado sólido usando
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Revista de Gestão Ambiental 293 (2021) 112966
resíduos agroindustriais (Asgher et al., 2006; Gassara et al., 2010, 2011; Li et al.,
2015; Zeng et al., 2015). A cinética do processo tende a ser altamente dependente
do substrato e das condições do processo.
Em resumo, as condições para altas atividades enzimáticas foram as
seguintes: LiP (A = ÿ 1, B = ÿ 1, C = ÿ 1, D = 1), MnP (A = ÿ 1, B = ÿ 1, C = 1, D
= 0) e Lac (A = ÿ 1, B = 0, C = 0, D = 0). Pode-se notar que os níveis ótimos para
maximizar as respostas foram diferentes para LiP, MnP e Lac. Além disso, o
único nível ótimo que é igual para todos os fatores avaliados é a umidade. Se o
objetivo deste estudo consistisse apenas em aumentar a produção de uma única
enzima, então as condições ideais para essa enzima em particular precisariam
ser selecionadas. Nosso objetivo, no entanto, era aumentar as três enzimas
simultaneamente e, portanto, seguimos uma abordagem diferente.
3.3. Melhoria do processo multi-resposta
Em processos de fermentação, é comum visar condições ótimas para
múltiplas respostas. Quando essas condições conflitam umas com as outras, é
útil aplicar uma função de desejabilidade para acoplar todas as respostas em
direção ao alcance de um objetivo específico (Vera Candioti et al., 2014). Em
nossa análise, todas as respostas foram consideradas como “quanto maior,
melhor”. Os valores mínimos (min[X(Ri)] nas eqs. (1) e (2)) foram definidos abaixo
do resultado mínimo obtido em todo o conjunto de dados, e os valores máximos
(max[XRi ] nas eqs. (1) e (2)) foram definidos mais altos para evitar valores de
desejabilidade (dRi) iguais a 0 e, assim, afetar a desejabilidade global (DG).
Todas as respostas foram atribuídas com o mesmo peso (wi na eq. (2)) para
análise. Os valores médios das Desejabilidades obtidas também são mostrados
na Tabela 2. Um GD maior significa que o processo é mais eficiente em termos
de todas as respostas avaliadas.
A contribuição dos fatores avaliados (ANOVA) para o desempenho geral do
processo (DG) também é mostrada na Tabela 3. Os resultados mostram que a
umidade foi o fator mais significativo exercendo influência no desempenho do
processo (49,4%), seguido pelo tempo (13,8% ) e densidade compactada (8,6%).
A concentração de inóculo não exerceu efeito significativo sobre a desejabilidade
global em todos os níveis avaliados.
As condições ótimas obtidas na análise de DG foram umidade de 60%,
concentração de inóculo de 1,0 × 106 esporos/mL, densidade compactada de
0,16 g/mL e intervalo de tempo de 8 dias. Estas foram as configurações
intermediárias para concentração de inóculo, densidade compactada e tempo, e
a configuração de umidade mínima. Uma configuração de umidade inferior ao
mínimo escolhido não foi avaliada, dados os resultados de estudos preliminares
(dados não apresentados). As condições que minimizam o desempenho geral do
processo foram um nível de umidade de 80%, concentração de inóculo de 2,5 ×
106 esporos/mL, densidade compactada de 0,14 g/mL e um intervalo de tempo
de 6 dias.
Vários estudos sobre a otimização das condições do processo para a síntese
simultânea de LiP, Lac e MnP por diferentes microrganismos são relatados na
literatura (Asgher et al., 2016; dos Santos et al., 2017; Yasmeen et al., 2013).
Entretanto, nesses estudos, a otimização simultânea das três enzimas não foi
realizada apesar dos diferentes efeitos dos fatores avaliados nas respostas.
3.4. Ensaios de validação
As melhores condições para atingir o maior e o menor DG são apresentadas
na Tabela 3. As atividades previstas para cada enzima sob essas condições e
seus respectivos intervalos de confiança também são mostrados. Isto
é recomendável realizar um teste de validação nessas condições, principalmente
quando as condições selecionadas não estiverem entre as nove combinações
inicialmente avaliadas (Taguchi L9).
Uma validação extra com configurações diferentes do ótimo é proposta para
confiar nos efeitos principais identificados e nas configurações ótimas com
confiança. Neste estudo, selecionamos para executar os ensaios de validação
sob duas condições de processo diferentes: a melhor (Ensaio 1) e a pior (Ensaio
2). O objetivo era desafiar a capacidade da equação (4) de prever um resultado
em duas regiões do espaço de projeto com um oposto.
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J. Sosa-Martínez et al.
Tabela 3
Configurações do teste de validação, contribuição dos fatores para as respostas, resultados esperados dentro de um intervalo de confiança e resultados experimentais.
Fatores Teste 1
Nível Contribuição
Lábio MnP
UMA ÿ1 1,40 0,63
B 0 0,22 - 0,77
C 0 0,23 - 0,09
D 0 - 0,03 1,66
Mínimo esperado (U/mL) 4,58 3,60
Máximo esperado (U/mL) 6,07 4,73
uma
Resultados experimentais (U/mL) 6,84 ± 0,75 6,20 ± 0,68
uma
Resultados experimentais médios para LiP, MnP e Lac obtidos para cada ensaio de validação (15 réplicas).
atuação.
Na maioria dos estudos de otimização, as condições consideradas ótimas são
as únicas validadas. No entanto, quando um processo multi-resposta é otimizado,
as validações podem oferecer apenas uma previsão correta para uma região
específica de todo o espaço. Por exemplo, se alguém fosse selecionar as condições
que maximizam apenas LiP, então o resultado esperado de MnP e Lac estaria em
uma região intermediária do espaço de projeto. Se estivermos confiantes de que a
adição de meios marginais é capaz de prever o resultado das piores para as
melhores condições para todas as respostas, então, no futuro, podemos selecionar
quaisquer condições que decidirmos enquanto confiamos nas previsões. Por
exemplo, se os resultados dos ensaios de validação estiverem dentro do intervalo
de confiança dos resultados esperados (eq. (4)), então pode-se aceitar as
conclusões tiradas da análise de Taguchi.
No entanto, se este não for o caso, pode haver interações que afetam o desempenho
do processo.
Os resultados obtidos dos dois ensaios de validação são mostrados na Tabela 3
(a média apresentada na Tabela 3 é a média de mais de 10 réplicas para cada
tentativa). Em relação à produção de enzimas em condições que maximizam o
rendimento (Ensaio 1), pode-se observar que a produção média de LiP foi 12%
superior ao máximo esperado com adição de médias marginais. No entanto, o
desvio padrão mostra que algumas das réplicas ficaram dentro do intervalo de
confiança mostrado na Tabela 3. Para MnP, por outro lado, a produção foi 31%
superior aos resultados esperados.
Além disso, mesmo com o desvio padrão, todas as réplicas ficaram fora do intervalo
de confiança. A síntese de Lac estava dentro do intervalo de confiança previsto pela
adição de médias marginais.
Em relação aos resultados do Ensaio 2 de validação, a produção de todas as
enzimas avaliadas foi baixa como esperado, e o resultado experimental do ensaio
de validação ficou dentro do intervalo de confiança da predição para as três
respostas.
Condições melhoradas (Ensaio 1) foram aplicadas para a produção de enzimas
ligninolíticas em maior escala (coluna descrita na seção “Condições de cultivo em
uma coluna de leito empacotado”). A Fig. 2 mostra os resultados experimentais
versus os resultados esperados previstos pela adição das médias marginais. Inclui
os resultados obtidos em escala de laboratório (Ensaio 1 e Ensaio 2) e os resultados
obtidos usando uma coluna de leito empacotado ampliada em diferentes alturas de
coluna (inferior, central e superior). As tendências descritas acima estão agora
claramente ilustradas: os resultados do Teste 2 (triângulos) estão dentro do intervalo
de confiança, enquanto os resultados do Teste 1 (losangos) estão fora. Em relação
aos resultados em uma escala maior (círculos), pode-se observar que a posição na
coluna afetou os resultados. As atividades enzimáticas ficaram dentro dos resultados
esperados no centro e no topo da coluna.
No entanto, os níveis de produção obtidos na parte inferior da coluna foram muito
inferiores ao esperado. Atribuímos esse comportamento aos possíveis gradientes
de umidade na coluna; ao final da fermentação, o substrato apresentou menor teor
de umidade no fundo. Esse problema pode ser melhorado implementando sensores
online para controlar a umidade ou otimizando a taxa de fluxo de ar ou a posição
da entrada de ar (Krishania et al., 2018). É importante mencionar que a temperatura
não aumentou drasticamente na coluna neste nível de escala. É bem conhecido
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Revista de Gestão Ambiental 293 (2021) 112966
Teste 2
Nível Contribuição
Laca Lábio MnP Laca
1,16 1 - 2,67 - 0,52 - 0,67
0,25 1 - 0,55 0,20 - 0,12
0,46 ÿ1 0,72 - 0,28 - 0,44
0,40 ÿ1 - 0,43 - 1,17 - 0,58
3,08 - 0,17 0,41 - 1,00
3,81 1,32 1,54 ÿ 0,27
3,77 ± 0,81 0,31 ± 0,33 0,16 ± 0,17 0,14 ± 0,08
que a remoção de calor produzida pela ação metabólica dos micro-organismos é
um problema para fins de escalonamento de SSF (Krishania et al., 2018). Nesse
sentido, o extrato enzimático bruto produzido em condições ótimas foi utilizado
posteriormente para a degradação de diversos corantes (Sosa-Martínez et al.,
2020), apresentando altos níveis de degradação em temperaturas elevadas (ÿ50
ÿC ).
A maioria dos resultados experimentais foram bastante semelhantes aos
calculados; entretanto, alguns ficaram fora da margem de erro do intervalo de
confiança. Em alguns casos, os resultados foram superiores ao esperado, o que é
aceitável para otimizar o processo. Em outras palavras, a metodologia Taguchi
provou ser bem sucedida em melhorar o desempenho do processo; no entanto, não
conseguiu prever o resultado esperado ao variar as condições do processo.
Isso sugere que a suposição de negligenciar efeitos interativos não pode ser
inteiramente aceitável se alguém quiser evitar ser direcionado para regiões
subótimas, negligenciando interações que podem ser relevantes.
3.5. Avaliação de efeitos interativos
Em seguida, avaliamos o possível impacto dos efeitos interativos descritos no
material e métodos (Análise de dados) devido aos resultados obtidos durante os
ensaios de validação. Os ajustes para cada par de fatores e as respectivas
previsões para cada enzima não são mostrados. No entanto, uma possível interação
será identificada se a previsão pelo modelo de superfície (eq. (5)) com qualquer par
de fatores estiver mais próxima da resposta obtida durante os ensaios de validação
experimental do que a obtida com a adição de médias marginais (eq. (4)).
Esses resultados indicaram que algumas interações entre os fatores B e D para
LiP podem estar ocorrendo, bem como entre os fatores A e B para MnP. Esses
resultados sugerem que esses dois pares de fatores foram os únicos que se
aproximaram dos dados experimentais obtidos. Uma análise de variância foi
realizada sobre essas combinações de fatores para avaliar se uma interação foi
significativa (assumindo um planejamento fatorial completo).
Em relação ao efeito dos fatores B e D sobre o LiP, os resultados mostraram
que a interação entre eles foi significativa (p < 0,05), enquanto os efeitos lineares e
quadráticos de ambos os fatores não foram (fig. 3a). Curiosamente, de acordo com
a análise anterior, eles apresentaram um efeito combinado inferior a 5%. Se os
índices de gravidade tivessem sido aplicados para avaliar possíveis interações, as
interações entre B e D poderiam ter sido descartadas, pois, na maioria dos casos,
os índices de gravidade para fatores relevantes tendem a ser altos (Morales-
Oyervides et al., 2017). A interação entre esses dois fatores pode ser facilmente
observada no gráfico de resposta da superfície quando o tempo de processo é
ajustado no nível mínimo; uma atividade ótima também pode ser encontrada no
nível mínimo de concentração de inóculo. Quão
sempre, se o tempo de processamento for ajustado para o nível máximo, então é
necessária uma concentração máxima de inóculo para obter uma alta atividade de
LiP. Uma interação semelhante entre a concentração do inóculo e o tempo foi
relatado para a síntese de LiP por Pleurotus eryngii WC 888 usando caules de ba
nana como substrato (Asgher et al., 2016); uma concentração mais alta de inóculo
exigiu um período de incubação mais prolongado para atingir alta atividade de LiP,
enquanto uma concentração mais baixa de inóculo produziu o
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J. Sosa-Martínez et al.
Fig. 2. Valores experimentais de a) LiP, b) MnP ec) Lac versus valores previstos
usando adição de médias marginais (U/mL). Cruzes (resultados de réplicas do projeto
Taguchi L9), losangos (resultados do Ensaio 1), triângulos (resultados do Ensaio 2)
e círculos (resultados da coluna de leito compactado ampliada em diferentes alturas;
branco, inferior; cinza, centro ; preto, superior).
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Revista de Gestão Ambiental 293 (2021) 112966
efeito oposto. De acordo com as conclusões extraídas da equação (4), os níveis
ótimos de B e D foram ÿ 1 e 1, respectivamente.
As configurações selecionadas para o Ensaio 1 corresponderam a níveis
intermediários (níveis para aumentar a conveniência global). De acordo com a
análise de Taguchi, se uma configuração intermediária for selecionada para o fator
D, sua contribuição seria negativa (Tabela 3). No entanto, essa contribuição não é
tão alta se uma configuração intermediária for selecionada para o fator B. Portanto,
os resultados serão superiores aos previstos pela adição de médias marginais, que,
de fato, foram os resultados experimentais obtidos. De qualquer forma, a região
ótima determinada pelo modelo de superfície para LiP foi a mesma obtida pela
adição de médias marginais (B, ÿ 1; D, 1). Portanto, não é recomendável analisar
mais a fundo essa interação.
Em relação a uma possível interação entre A e C no MnP, essa interação foi de
fato o fator mais significativo que afetou a produção (p < 0,05), seguido pelo efeito
linear do fator A (Fig. 3b). O gráfico de resposta da superfície mostra claramente a
interação entre esses dois fatores, ou seja, quando um nível mínimo de densidade
compactada é selecionado, a umidade exerce um efeito linear negativo na produção
de MnP. Por outro lado, quando uma densidade de compactação mais alta é
aplicada, a umidade tem o efeito oposto. Como dito anteriormente, a densidade
compactada está relacionada à área disponível para troca de calor e massa: uma
densidade compactada mais alta pode resultar em transferência inadequada de
calor e massa, exigindo níveis mais altos de umidade (Singh nee' Nigam e Pandey,
2009). O gráfico de superfície também mostra duas regiões abaixo do ideal: uma
configurando ambos os fatores no nível mínimo e a outra configurando ambos os
fatores no nível máximo.
Conforme mostrado pela análise de Taguchi, a região ótima usa um nível
máximo de densidade compactada e um nível mínimo de umidade. Assim, neste
caso, os resultados mostram que fomos mal direcionados para uma região subótima
ao negligenciar os efeitos interativos entre os fatores. No entanto, se o objetivo é
aumentar a síntese das três enzimas simultaneamente, um alto nível de umidade
deve ser evitado, pois é o fator mais significativo para LiP e Lac, e sua produção
diminui drasticamente quando um nível tão alto é aplicado . A solução preferível é
selecionar uma densidade de empacotamento mais baixa, que é, de fato, o que
fizemos para atender à conveniência do processo. Isso poderia explicar por que os
resultados experimentais foram maiores do que o esperado no Ensaio 1.
Quanto ao Lac, as previsões obtidas por meio da adição de médias marginais
foram melhores do que as obtidas com os modelos de superfície. É, portanto,
seguro supor que, na resposta Lac, não ocorreram efeitos interativos entre os
fatores avaliados. Esses resultados concordam com os obtidos para a otimização
da produção de enzimas ligninolíticas por Chyzophyllum commune utilizando palha
de milho: não foram encontradas interações entre as condições do processo para a
síntese de Lac (Yasmeen et al., 2013).
Por fim, a desejabilidade global (GD) do processo foi aumentada em 237%
sobre a média geral do GD observado anteriormente, que é o valor com maior
probabilidade de ser escolhido por uma simples seleção das configurações dos
quatro fatores em estudo. Em condições melhoradas, a produção de enzimas
ligninolíticas obtidas (Tabela 3, resultados experimentais Ensaio 1) foi superior à
produção previamente relatada para Phanerochaete chrysosporium utilizando
sabugo de milho (Cabaleiro et al., 2002; Rodríguez Couto et al., 1999). Nesses
estudos, a produção foi realizada em frasco Erlenmeyer com adição de indutores
(Tween 80 e álcool veratrílico); no entanto, as condições não foram otimizadas. O
exposto acima demonstra que com a otimização do processo, enzimas de alta
ligninolítica podem ser obtidas sem a adição de cofatores que poderiam aumentar
os custos do processo. Em outro estudo, o sabugo de milho foi usado para produzir
enzimas ligninolíticas usando diferentes configurações de biorreator, mas em cultivo
em estado semi-sólido (Couto et al., 2001). Nesse estudo, a produção máxima de
LiP (700 U/L) foi ligeiramente superior à obtida neste estudo; por outro lado, a
produção de MnP (292 U/L) e Lac (Não detectado) foram consideravelmente
menores. Novamente, é importante mencionar que uma otimização simultânea de
todas as três enzimas ainda não foi feita até onde sabemos.
Por fim, o extrato enzimático bruto (0,2 g/mL) produzido em condições
otimizadas sem a adição de cofatores foi suficiente para atingir uma alta porcentagem
de degradação de vários corantes (Sosa-Martínez
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J. Sosa-Martínez et al. Revista de Gestão Ambiental 293 (2021) 112966

Fig. 3. Gráficos de resposta de superfície e gráfico de Pareto dos efeitos linear (L), quadrático (Q) e interativo entre dois fatores (B por D e A por C). a) efeitos dos fatores
B e D sobre LiP eb) efeitos dos fatores A e C sobre MnP.

e outros, 2020). O uso bem sucedido do extrato bruto poderia mitigar os altos custos
relacionados às etapas de purificação.
4. Conclusões
O desempenho do processo para todas as respostas foi transferido para uma zona
mais favorável no espaço de projeto. Assim, a abordagem que seguimos permitiu-nos
identificar e compreender formas e meios pelos quais as condições de processo avaliadas
afetaram a síntese de enzimas ligninolíticas em fermentação em estado sólido utilizando
resíduos agrícolas. O processo foi aprimorado ainda mais e o desempenho do processo
foi mantido em uma escala maior. Nossos resultados podem então servir como base para
ampliar o processo de produção de enzimas lignocelulolíticas e desenvolver um processo
econômico para sua aplicação na degradação de corantes.
o espaço de design (maior e menor produção) e em diferentes escalas de processo.
Esses resultados contribuem para estabelecer um bioprocesso de baixo custo para
produção de enzimas ligninolíticas, reduzindo o custo das matérias-primas e eliminando
os altos custos relacionados às etapas de purificação.
Contribuições do autor
J Sosa-Martínez: Experimentos realizados, redação-rascunho inicial. N
Balagurusamy: Redação - revisão e edição. JR Benavente-Valdes´ : Visualização,
˜
redação - revisão e edição. J Montanez : Recursos, redação - revisão e edição.
Morales-
L
Oyervides: Conceituação, análise formal, supervisão.

Também demonstramos que é possível superar a grande desvantagem do método de Declaração de interesse concorrente
Taguchi, que é o uso de delineamentos ortogonais saturados quando se assume que as
interações entre os fatores são desprezíveis. Isso foi alcançado realizando mais de uma Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes conhecidos
validação experimental: realizamos uma em condições ótimas e outra em um cenário ou relacionamentos pessoais que possam ter influenciado o trabalho relatado neste artigo.
completamente diferente. Para resumir, as condições de validação selecionadas previram
com sucesso um resultado em duas regiões diferentes de

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J. Sosa-Martínez et al. Revista de Gestão Ambiental 293 (2021) 112966

Agradecimentos Biotecnologia e Bioengenharia. Elsevier, pp. 83-96. https://doi.org/10.1016/

A autora Jazel Sosa-Martínez agradece ao CONACyT M´exico pelo apoio financeiro
fornecido para seus estudos de pós-graduação.
Apêndice A. Dados Suplementares
Dados complementares a este artigo podem ser encontrados online em https://doi. org/10.1016/
j.jenvman.2021.112966.
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Seleçãododas
processo
melhores
decondições
produção de
de preparação
pigmentos por
do inóculo
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