DESENVOLVIMENTO DE ADSORVENTES MONOLÍTICOS

MACROPOROSOS COM ANILINA IMOBILIZADA PARA

PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS.

NASCIMENTO RG1*, PORFÍRIO MCP¹, SANTOS LS¹, VELOSO CM¹, BONOMO RCF1,
FONTAN RCI1.
1
Laboratório de Engenharia de Processos, Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia,
Itapetinga, BA,
*E-mail para contato: rui3091@hotmail.com

RESUMO – A demanda das indústrias alimentícias por proteínas purificadas está

aumentando. Por conta disso, o desenvolvimento de novos adsorventes é promissor.
Dentre eles, destacam-se os criogéis. Os criogéis requerem modificações de estrutura
por incorporação de grupos funcionais para aumentar a eficiência dos processos de
purificação. Dentre essas modificações, uma técnica de grande interesse é a inserção de
ligantes que reagem especificamente com a parte apolarizada das proteínas, gerando
produtos com alto grau de pureza, por meio da interação hidrofóbica. A caracterização
desses materiais é de grande importância para a otimização das condições operacionais
e adequação do seu uso às necessidades de pesquisadores e indústrias. Diante do
exposto, o objetivo deste trabalho é a produção e caracterização de um criogel
supermacroporoso ativado com glutaraldeído e anilina, visando à purificação de
proteínas.
Palavras-chave: Adsorvente; Criogel; Hidrofobicidade; Proteína.

DEVELOPMENT OF MACROPOROUS MONOLITHIC ADSORBENTS

WITH IMMOBILIZED ANILINE FOR PROTEIN PURIFICATION.

ABSTRACT – The demand of the food industries for purified proteins is increasing.
Because of this, the development of new adsorbents is promising. Among them, cryogels
stand out. Cryogels require structural changes by incorporating functional groups to
increase the efficiency of purification processes. Among these modifications, a technique
of great interest is the insertion of ligands that react specifically with the non-polarized
part of proteins, generating products with a high degree of purity, through hydrophobic
interaction. The characterization of these materials is of great importance for the
optimization of operational conditions and the adequacy of their use to the needs of
researchers and industries. Given the above, the objective of this work is the production
and characterization of a supermacroporous cryogel activated with glutaraldehyde and
aniline, aiming at the purification of proteins.
Keywords: Adsorbents, Cryogel, Hydrophobicity, Protein

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 1. INTRODUÇÃO
O desenvolvimento de novas estratégias de bioseparação e processos biotecnológicos têm
crescido bastante no campo industrial químico e alimentício. Dentre as estratégias existentes,
tem-se as técnicas cromatográficas (Mol et al., 2017). A cromatografia é um processo físico-
químico utilizado para a separação de biomoléculas e possui o objetivo de isolar e purificar um
ou mais compostos de interesse em relação aos demais presentes em uma determinada solução,
levando à pureza adequada para o seu uso específico. Essa separação e purificação podem
ocorrer de diversas formas, incluindo interações hidrofóbicas. A cromatografia de interação
hidrofóbica (CIH) é uma das metodologias de cromatografia mais utilizada. Baseada na
interação reversível entre as zonas hidrofóbicas da superfície de biomoléculas e o ligante
hidrofóbico de uma resina cromatográfica, a CIH alcança separações rápidas com pequenas
degradações do produto, baixas exigências de solventes e níveis de purificação muito bons
(Zhou et al.,2020).

As características benéficas da CIH, juntamente com a demanda crescente das indústrias

farmacêutica e de alimentos por proteínas com elevado grau de pureza, fazem com que
pesquisadores busquem desenvolver técnicas que mantenham ao máximo a bioatividade das
mesmas (Zhou et al., 2020). Na vanguarda desse processo está a produção de monólitos,
estruturas porosas altamente interconectadas formadas em corpo único, considerados a quarta
geração dos materiais cromatográficos (Fontan et al., 2018).

Dentre estes, destacam-se os criogéis, obtidos a partir do congelamento de uma mistura

reativa de polímeros. Entre os possíveis polímeros empregados na síntese dos criogéis,
destacam-se os monólitos macroporosos de poliacrilamida, obtidos da polimerização de
moléculas de acrilamida (Aam) com o agente formador de ligações cruzadas N,N’-metileno-
bis-acrilamida (BAam) adicionados ou não de outros monômeros (como o alil-glicidil éter,
AGE), sob condições de congelamento moderado, pela técnica conhecida como
criogeleificação (Gonçalves et al., 2017). Estes possuem elevada porosidade, com grandes
poros interconectados, apresentando baixa resistência ao escoamento, permitindo o uso de
soluções mais viscosas, e essa característica traz consigo uma redução nos custos operacionais,
pois elimina etapas de pré-preparo das amostras como pré-concentração, sem afetar a eficiência
da purificação (Da Silva et al., 2019). Em contrapartida, os grandes poros e consequentemente
a elevada porosidade de sua estrutura fazem com que sua área superficial seja menor se
comparada a de uma coluna cromatográfica tradicional, levando a uma menor eficiência teórica.
Para contornar esse problema, surge a necessidade de modificar quimicamente ou fisicamente
tais colunas (Da Silva et al., 2019)

Modificações químicas e/ou físicas podem ser feitas na matriz do criogel para aumentar
a sua seletividade conforme o produto de interesse a ser purificado, proporcionando o aumento
da eficiência dos processos de separação (Veríssimo et al., 2017). Com a introdução de novas
estruturas químicas (grupos hidrofóbicos) na superfície, é possível obter fases estacionárias que
interajam mais ou menos especificamente com uma proteína em particular. Entre os possíveis
radicais ligantes hidrofóbicos estão aqueles contendo radicais etil, butil, octil, phenil, anilina e
etc (Zhou et al., 2020). A anilina é um composto aromático aminado, com características de
interesse. O anel aromático confere hidrofobicidade ao composto, enquanto que o seu radical
amina presente confere polaridade suficiente para que o mesmo seja solúvel em água, além de
permitir a formação de uma base de Schiff com os sítios aldeído ativados existentes na estrutura

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previamente ativada do criogel.

Para se ter certeza que os radicais estão ligados à coluna cromatográfica e

consequentemente adquirir conhecimento a respeito do comportamento da interação das
moléculas presentes em solução, a caracterização das propriedades físico químicas dos criogéis
é de grande importância (Veríssimo et al., 2017).

Dessa forma, o objetivo do trabalho foi desenvolver um novo adsorvente monolítico

macroporoso voltado para o processo de purificação de proteínas por cromatografia interação
hidrofóbica e caracteriza-lo com relação a aspectos, físicos e operacionais.

2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1. Reagentes
Todos os reagentes necessários para o desenvolvimento desse trabalho possuíam, no
mínimo, grau analítico PA-ACS, sendo descritos ao longo do detalhamento das metodologias.
Foi utilizada água destilada e os equipamentos e materiais também foram descritos na
sequência, nos momentos em que foram usados.

2.2. Síntese dos criogéis monolíticos

Para síntese dos criogéis foram adaptadas metodologias propostas por Kumar et al. (2006)
e Yao et al. (2006). 4,4 g de AAm, 1,2 g de BAAm e 1,4 g de AGE foram solubilizadas em um
volume total de 100 mL de água destilada. Em seguida, em banho de gelo, foram adicionados
140 µL de solução de persulfato de amônio (APS) na concentração de 0,5 g/mL e 91 µL de
N,N,N’,N’-tetrametiletilenodiamino (TEMED. Após rápida homogeneização da solução, a
mesma foi imediatamente vertida em seringas plásticas de 5mL, sendo as mesmas fechadas e
mergulhadas em banho termostático à - 12,0 °C por 24 h. Decorrido esse tempo, as seringas
foram deixadas à temperatura de 4°C por 4 h para o descongelamento da água existente.
Posteriormente, as seringas contendo os criogéis foram colocadas em estufa a 60°C até os
criogéis estarem completamente secos. Em seguida, os criogéis tiveram as extremidades
cortadas para retirar partes defeituosas. Os criogéis foram então lavados com 200 mL de água
destilada, utilizando-se uma bomba peristáltica na vazão de 1,5 mL.min-1 e foram secos em
estufa e as massas foram medidas em balança analítica. Em seguida, os criogéis estavam prontos
para serem submetidos ao método de funcionalização.

2.3. Funcionalização dos criogeis

Para o processo de modificação da superfície, foi adotado o método do gluteraldeído em
batelada adaptado por Da Silva et al. (2019). Os criogeis secos, com cerca de 3cm de altura,
1cm de diâmetro e peso médio de 300 mg, foram colocados sob agitação rotativa à 25 rpm em
todas as etapas do processo, utilizando seringas fechadas de 20 mL. A cada etapa realizada os
criogeis foram gentilmente comprimidos manualmente, para a retirada do excesso de solução
da etapa anterior.

Inicialmente, os criogeis foram colocados em contato com 20 mL de álcool metílico por

2 horas. Posteriormente, foram mantidos em contato com 20 mL de água destilada, seguidos de
contato com tampão fosfato de sódio 0,05 mol/L pH 6 (20 mL), ambos com tempo de contato

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de 1 hora. Em seguida, os mesmos foram imersos em 20 mL de etilenodiamina 0,05 mol/L em
tampão fosfato de sódio 0,05 mol/L pH 6 e mantidos sob agitação por 14 horas à temperatura
ambiente. Em seguida, os criogeis foram lavados com água destilada e depois imersos em 20
mL de tampão fosfato de sódio 0,05 mol/L pH 6, cada etapa com 1 hora de duração. Então, os
criogeis foram colocados em contato com 20 mL de soluções de glutaraldeído (concentração
de 5%), à temperatura controlada (12ºC), por 5 horas. Em seguida, os criogeis foram
enxaguados duas vezes com 20 mL água destilada por 30 minutos, para remoção do excesso de
glutaraldeído. Na sequência os criogeis aldeído-ativados foram expostos a 20mL da solução de
anilina 10mg/mL no tampão fosfato de sódio pH 6,0 durante 14 horas.

Feito isso, imergiu-se as colunas em 20 mL de tampão fosfato de sódio pH 6,0 durante

1 hora e em seguida, expôs-se a 20 mL de solução de borohidreto de sódio 0,1 mol/L em tampão
fosfato de sódio pH 6, por 60 minutos. Por fim, os criogeis foram lavados com 20 mL de água
destilada, seguido de 20 mL de etanolamina 0,1 mol/L no tampão fosfato de sódio pH 6 e
novamente 20 mL de água destilada, as três últimas etapas com 1 hora de duração cada. Após
a ativação os criogeis foram colocados em estufa a 60°C e após a secagem obteve-se uma coluna
adsorvente monolítica supermacroporosa de interação hidrofóbica.

2.4. Caracterização Dos Criogeis

Para a caracterização dos criogíes produzidos e posteriormente funcionalizados, foram
realizadas as análises seguindo as metodologias propostas por Savina et al. (2005) para
capacidade de inchamento (S), Fontan et al. (2018) para grau de expansão (ED), e Plieva et al.
(2004) para porosidade. A microscopia eletrônica de varredura (MEV) foi realizada utilizando
as metodologias propostas por Da Silva et al. (2019).

3. RESULTADOS E DISCUSSÕES
Os adsorventes foram sintetizados e resultou-se em criogeis de estrutura esponjosa,
coloração esbranquiçada, forma cilíndrica, uniforme e rígida quando desidratados. Por se tratar
de uma estrutura altamente porosa, quando hidratados apresentaram estrutura macia e elástica
(Veríssimo et al.,2017; Gonçalves et al., 2017; Fontan et al.,2018). Os criogéis sintetizados
(controle) foram então funcionalizados a partir da imobilização de anilina. O criogel
funcionalizado apresentou uma coloração amarela (Figura 1). Esta coloração se deve à
formação de bases de Schiff do glutaraldeído com a etilenodiamina e a anilina.

Figura 1. Imagem dos criogeis controle e ativado produzidos no experimento.

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 Informações sobre a caracterização das matrizes produzidas são apresentadas na Tabela
1. Verifica-se uma redução nos valores dos parâmetros avaliados, exceto para a fração de
micro/mesoporos que apresentou elevação.

Tabela 1- Valores médios obtidos para capacidade de inchamento (S) e grau de

expansão (ED) e frações de poros das matrizes produzidas

Parâmetro Controle Funcionalizado

S (kg/kg) 18.77 ± 0.95 12.66 ± 0.81
ED (L/kg) 18.55 ± 2.10 16.12 ± 2.40
Fração de macroporos 0.828 ± 0.019 0.786 ± 0.022
Fração de micro/mesoporos 0.103 ± 0.020 0.129 ± 0.021
Porosidade total 0.941 ± 0.003 0.905 ± 0.002

A capacidade de inchamento é uma medida da expansão da matriz do criogel, e quanto

maior o seu valor, mais maleáveis são as matrizes após o inchamento e menores pressões elas
suportam antes de sofrerem deformações (Gonçalves et al., 2017). O grau de expansão (ED) é
importante por fornecer uma relação entre a massa do criogel seco e o volume que o mesmo
ocupa em condições operacionais (hidratado) (Fontan ., 2018). A redução nos valores de S e
ED confirmam a funcionalização com anilina, que tornou a superfície do adsorvente mais
hidrofóbica, diminuindo consequentemente a capacidade de retenção de água das matrizes
produzidas (Bonomo et al., 2006). Os valores de S e ED obtidos neste trabalho estão dentro das
faixas reportadas para criogéis de poliacrilamida em diversos trabalhos da literatura (Fontan et
al., 2018, Mol et al., 2017)

A partir da metodologia usada, foram avaliadas duas frações de poros distintas nas
matrizes. Os macroporos (diâmetro acima de 1 µm) são de tamanho grande se comparados aos
poros de coluna cromatográfica tradicionais. Formam canais interconectados por onde a fase
móvel é facilmente deslocada. Representam a maior parte de colunas dessa natureza e são
responsáveis pela elevada permeabilidade deste tipo de leito, assim como as suas tortuosidades
e capacidade de constrição. Na fração macroporosa os processos convectivos de transferência
de massa dentro do leito são favorecidos. A outra fração é composta por micro e mesoporos
com predomínio de processos difusivos de transferência de massa (Veríssimo et al., 2017;
Nascimento et al., 2019).

Com a funcionalização houve uma redução na fração de macroporos e porosidade total,

com uma pequena elevação na fração de poros menores. No entanto a porosidade total manteve-
se elevada, correspondendo a cerca de 90% da estrutura das matrizes produzidas. Atribui-se tal
alteração na dinâmica de distribuição das frações de poros à inclusão dos braços espaçadores,
devido ao potencial de polimerização do glutaraldeído empregado nesse processo, fazendo com
que alguns dos macroporos passassem a se comportar como micro e mesoporos por estarem
parcialmente obstruídos afetando a dinâmica de escoamento em seu interior. Os valores
encontrados são consistentes com os observados em outros trabalhos na literatura em que se
trabalhou com criogéis de poliacrilamida (Bonomo et al., 2006; Gonçalves et al., 2017; Da
Silva et al., 2019).

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 A avaliação morfológica das matrizes produzidas foi realizada através da análise de
microscopia de varredura (MEV), sendo as imagens obtidas apresentadas na Figura 2. Observa-
se que as matrizes apresentaram estrutura homogênea, com poros grandes e interconectados.
Verifica-se o predomínio de macroporos com diâmtro entre 30 e 70µm, em acordo com o
reportado por diversos autores (Mol et al., 2017; Nascimento et al., 2019). As dimensões de
poros observada permitem a passagem tanto de macromoléculas, como de células microbianas,
fragmentos celulares e até mesmo soluções concentradas e particuladas, facilitando processos
de purificação com um menor número de etapas (Plieva et al., 2004).

Verifica-se também a diferença entre as imagens das matrizes controle (A a C) e

funcionalizada (D a F). Observa-se na matriz funcionalizada a existência de pontos de
rugosidade na superfície dos poros, que pode ser atribuída à inclusão dos braços espaçadores
de glutaraldeído nos sítios epóxi ativados da superfície dos criogéis, e posterior funcionalização
com anilina, indicando que a mesma foi bem-sucedida.

Figura 2 – Micrografias de MEV das matrizes controle (A e B) e funcionalizadas (C e D).

4. CONCLUSÃO

Foi produzida uma matriz polimérica macroporosa funcionalizada com anilina para o uso
na captura de proteínas por interação hidrofóbica. Tal funcionalização foi confirmada a partir
das imagens de MEV. Foram avaliadas algumas modificações no processo de produção e
caracterização de criogéis. A enxertia ocorreu de modo dinâmico, ao invés do estático, com as
soluções ativadora e de AMPSA sendo bombeadas em circuito fechado através dos criogéis.
Tal alteração não provocou mudanças consideráveis na capacidade de inchamento (S) e no grau
(G) e densidade (D) de enxertia, mas o rendimento (E) da mesma foi inferior ao reportado na
literatura. Dessa forma, a matriz produzida apresenta potencial para utilização em processos de
captura de proteínas por interação hidrofóbica.

6. REFERÊNCIAS
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adsorption of whey proteins: Effect of temperature and salt concentration and thermodynamic

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