DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE ADSORVENTES

MONOLÍTICOS MACROPOROSOS COM COBRE IMOBILIZADO.

NASCIMENTO RG1*, PORFÍRIO MCP¹, SANTOS LS¹, VELOSO CM¹, BONOMO RCF1,
FONTAN RCI1.
1
Laboratório de Engenharia de Processos, Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia,
Itapetinga, BA,
*E-mail para contato: rui3091@hotmail.com

RESUMO – Criogéis supermacroporosos com metal imobilizado são suportes eficazes

na separação por afinidade de biomoléculas. Neste trabalho, criogel de poliacrilamida
foi desenvolvido e funcionalizado com íons de Cu2+ utilizando ácido iminodiacético
(IDA). Este adsorvente de afinidade foi produzido com o objetivo de capturar proteínas
que tenham resíduos de histidina e triptofano em sua estrutura. A matriz de criogel foi
analisada por microscopia de varredura eletrônica (MEV para confirmação da ativação
Além disso, a caracterização desses materiais é de grande importância para a otimização
das condições operacionais e adequação do seu uso às necessidades de pesquisadores e
indústrias. Diante do exposto, o objetivo deste trabalho é a produção e caracterização
de um criogel supermacroporoso ativado com glutaraldeído e anilina, visando à
purificação de proteínas.
Palavras-chave: Adsorvente; Criogel; Afinidade; Proteína.

DEVELOPMENT OF MACROPOROUS MONOLITHIC ADSORBENTS

WITH IMMOBILIZED ANILINE FOR PROTEIN PURIFICATION.
ABSTRACT – Supermacroporous cryogels with immobilized metal are effective supports
for affinity separation of biomolecules. In this work, polyacrylamide cryogel was
developed and functionalized with Cu2 + ions using iminodiacetic acid (IDA). This
affinity sorbent was produced with the objective of capturing proteins that have histidine
and tryptophan residues in its structure. The cryocomputer matrix was analyzed by
scanning electron microscopy (SEM to confirm activation. In addition, the
characterization of these materials is of great importance for the optimization of
operational conditions and the adequacy of their use to the needs of researchers and
industries. the objective of this work is the production and characterization of a
supermacroporous cryogel activated with glutaraldehyde and aniline, aiming at the
purification of proteins.
Keywords: Adsorbents, Cryogel, affinity, Protein.

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 1. INTRODUÇÃO
A cromatografia de afinidades por íons metálicos (IMAC), se baseia na afinidade
diferencial que íons metálicos imobilizados em uma matriz sólida apresentam por grupamentos
expostos na superfície de uma molécula em solução. Esta afinidade resulta de ligações de
coordenação reversíveis formadas entre um íon metálico quelatado (o centro de adsorção) e
resíduos de aminoácidos, tais como imidazol da histidina, tiol da cisteína e indol do triptofano,
os quais doam elétrons para o íon metálico (Bresolin et al., 2009). A técnica de IMAC vem
sendo muito utilizada na purificação de proteínas de origem natural ou recombinante, pois
alcança separações rápidas com pequenas degradações do produto, e níveis de purificação
muito bons (Uygun et al., 2015, Carvalho et al., 2016).

As vantagens presentes na IMAC, juntamente com a necessidade das indústrias

farmacêutica e de alimentos em obter proteínas com elevado grau de pureza, fazem com que
pesquisadores busquem desenvolver técnicas que mantenham ao máximo a bioatividade das
mesmas (Trang et al., 2019). Dentre as várias técnicas, vem se destacando o desenvolvimento
de materiais monolíticos poliméricos supermacroporosos, utilizados na cromatografia, que
permitem a separação de grandes biomoléculas e até mesmo de células inteiras em materiais
não clarificados (Fontan et al., 2018).

Dentre os monólitos utilizados como colunas cromatográficas, os criogéis poliméricos

de poliacrilamida vêm apresentando destaque. Estes possuem elevada porosidade, com grandes
poros interconectados, apresentando baixa resistência ao escoamento, permitindo o uso de
soluções mais viscosas, além apresentarem baixo custo, se comparados a matrizes tradicionais
utilizadas em cromatografia. Entretanto, como desvantagem, tais estruturas possuem uma
menor área superficial, acarretando em uma menor capacidade de ligação, o que acaba
diminuindo a eficiência da purificação. Diante disso, modificações podem ser realizadas na
estrutura dos criogéis visando aumentar sua capacidade de purificação (Gonçalves et al., 2017,
Da Silva et al., 2019).

Uma das possíveis modificações é transformar os criogéis poliméricos em matrizes de

cromatografia de afinidade com íons metálicos imobilizados, por meio da enxertia com grupos
ligantes de interesse. Para que isso ocorra, é necessária a escolha de um agente quelante e
posteriormente a coordenação com um íon metálico. A via mais comumente para tal é utilizando
matrizes poliméricas que contenham radicais epóxi em sua estrutura, aproveitando-se da
reatividade dos mesmos. Tais radicais são inseridos nas matrizes cromatográficas no momento
da sua síntese, utilizando-se por exemplo o alil-glicidil éter ou glicidil metacrilato, ou ainda em
um momento posterior, como no uso da epicloridrina (Carvalho et al., 2016).

O agente quelante usualmente empregado é o ácido iminodiacético (IDA), capaz de

fazer, ligações coordenadas com os íons metálicos. A escolha do íon metálico varia em função
da biomoléculas-alvo, variando de íons divalentes (Co2+, Cu2+, Ni2+, Zn2+, Ca2+, Mg2+)
quando se objetiva a interação, por exemplo com os aminoácidos histidina, cisteina e triptofano
a íons tri e tetravalentes( Al3+, Fe3+, Zr4+) quando se quer purificar fosfoproteinas e
fosfopeptídeos (Bresolin et al., 2009, Uygun et al., 2015).

As particularidades anteriormente descritas parecem ser um suporte adequado para

separação de proteínas utilizando IMAC, mas não é suficiente para a compreensão do

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mecanismo de afinidade entre os íons metálicos e as proteínas (Uygun et al., 2015). Para isso,
a caracterização das propriedades inerentes aos criogéis, serão de grande importância para se
adquirir conhecimento a respeito do processo que envolve a adsorção de proteínas (Da Silva et
al., 2019).

Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi desenvolver um adsorvente monolítico

macroporoso voltado para o processo de purificação de proteínas por cromatografia de afinidade
por íons metálicos imobilizados e caracteriza-lo com relação a aspectos, físicos e operacionais.

2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1. Reagentes
Todos os reagentes necessários para o desenvolvimento desse trabalho possuíam, no
mínimo, grau analítico PA-ACS, sendo descritos ao longo do detalhamento das metodologias.
Foi utilizada água destilada e os equipamentos e materiais também foram descritos na
sequência, nos momentos em que foram usados.

2.2. Síntese dos criogéis monolíticos

Para síntese dos criogéis foram adaptadas metodologias propostas por Kumar et al. (2006)
e Yao et al. (2006). 4,4 g de AAm, 1,2 g de BAAm e 1,4 g de AGE foram solubilizadas em um
volume total de 100 mL de água destilada. Em seguida, em banho de gelo, foram adicionados
140 µL de solução de persulfato de amônio (APS) na concentração de 0,5 g/mL e 91 µL de
N,N,N’,N’-tetrametiletilenodiamino (TEMED. Após rápida homogeneização da solução, a
mesma foi imediatamente vertida em seringas plásticas de 5mL, sendo as mesmas fechadas e
mergulhadas em banho termostático à - 12,0 °C por 24 h. Decorrido esse tempo, as seringas
foram deixadas à temperatura de 4°C por 4 h para o descongelamento da água existente.
Posteriormente, as seringas contendo os criogéis foram colocadas em estufa a 60°C até os
criogéis estarem completamente secos. Em seguida, os criogéis tiveram as extremidades
cortadas para retirar partes defeituosas. Os criogéis foram então lavados com 200 mL de água
destilada, utilizando-se uma bomba peristáltica na vazão de 1,5 mL.min-1 e foram secos em
estufa e as massas foram medidas em balança analítica. Em seguida, os criogéis estavam prontos
para serem submetidos ao método de funcionalização.

2.3. Funcionalização dos criogeis

Para o processo de modificação da superfície, foi adotado o sistema em batelada adaptado
por Carvalho et al. (2016), no qual os Monólitos de criogéis secos, com cerca de 3cm de altura,
1cm de diâmetro e peso médio de 250 mg, foram colocados sob agitação rotativa à 25 rpm em
todas as etapas do processo, utilizando seringas fechadas de 20 mL. A cada etapa realizada os
criogéis foram suavemente comprimidos manualmente, para a retirada do excesso de solução
da etapa anterior.

Inicialmente uma solução de Na2CO3 (20 mL, 0,5 M) foi agitada juntamente com o com
o monolito por 1 hora, seguida da solução de Na2CO3 1M (20 mL) na mesma quantidade de
tempo. Posteriormente, uma solução de IDA (0,5 M em 1,0 M de N a2C O3, pH 10,0) foi
colocada em contato com a coluna, durante 24 h à temperatura ambiente. Após estas etapas, o
criogel modificado foi lavado com Na2CO3 0,5 M (20 mL) por uma hora e em seguida com

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água deionizada até atingir o pH 8,0. Depois de atingido o pH ideal, o criogel entrou em contato
com uma solução de 0,1 M do sulfato de cobre, durante 2 horas para a ligação do metal na
matriz. Finalmente, o criogel foi lavado com água deionizada para remover o metal não ligado
e, em seguida, com tampão de imidazol (15 mM em HEPES e 0,2 M de NaCl, pH 7,0) para
remoção do metal fracamente ligado.

Após a ativação os criogeis foram colocados em estufa a 60°C e após a secagem obteve-
se uma coluna adsorvente monolítica supermacroporosa de afinidade por ions metálicos
imobilizados..

2.4. Caracterização Dos Criogeis

Para a caracterização dos criogíes produzidos e posteriormente funcionalizados, foram
realizadas as análises seguindo as metodologias propostas por Savina et al. (2005) para
capacidade de inchamento (S), Fontan et al. (2017) para grau de expansão (ED), e Plieva et al.
(2004) para porosidade. A microscopia eletrônica de varredura (MEV) foi realizada utilizando
as metodologias propostas por Da Silva et al. (2019).

3. RESULTADOS E DISCUSSÕES
Imagens dos criogéis produzidos e posteriormente funcionalizados com cobre são
apresentados na Figura 1. Os criogéis supermacroporosos de poliacrilamida apresentaram
estrutura esponjosa e elástica quando hidratados, conforme relatado em diversos trabalhos
(Carvalho et al.,2017; Gonçalves et al., 2017; Fontan et al.,2018). Devido à alta elasticidade,
tais monólitos podiam ser suavemente comprimidos mantendo a integridade de sua estrutura.
Além disso, as matrizes também apresentaram boa estabilidade aos processos de secagem e
hidratação, características que fazem dos criogéis de poliacrilamida um material promissor para
ser utilizado em processos de purificação (Fontan et al.,2018). As matrizes funcionalizadas
apresentaram coloração específica para o íon metálico utilizado, diferentemente do criogel base
(sem ativação e imobilização). Esta coloração se ao íon metálico, que é imobilizado ao agente
quelante por ligações de coordenação formadas entre o íon metálico e átomos de nitrogênio,
oxigênio ou enxofre presentes na estrutura do agente quelante.

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 Figura 1. Imagem dos criogeis controle e ativado produzidos no experimento.

Informações sobre a caracterização das matrizes produzidas são apresentadas na Tabela

1. Verifica-se uma redução nos valores dos parâmetros avaliados, exceto para a fração de
micro/mesoporos que apresentou elevação.

Tabela 1- Valores médios obtidos para capacidade de inchamento (S) e grau de

expansão (ED) e frações de poros das matrizes produzidas

Criogel
Parâmetro Controle Funcionalizado
Capacidade de inchamento (kg/kg) 18.77 ± 0.950 18.93 ± 1.590
Grau de expansão (L/kg) 18.55 ± 2.101 19.53 ± 0.980
Fração de macroporos 0.828 ± 0.019 0.782 ± 1.024
Fração de meso/microporos 0.103 ± 0.020 0.169 ± 0.021
Fração de água ligada 0.023 ± 0.001 0.011 ± 0.001
Fração de polímero seco 0.046 ± 0.002 0.044 ± 0.002
Porosidade total 0.941 ± 0.003 0.931 ± 0.002

Verifica-se que os valores relacionados aos criogeis controle e ativados com cobre, pouco
diferiram para as variáveis estudadas, exceto para fração de macroporos que apresentou
elevação. A capacidade de inchamento é um parâmetro que mede a expansão da matriz do
criogel, e quanto maior o seu valor, maior é a quantidade de água que pode ser absorvida na
estrutura dos criogéis (Gonçalves et al., 2017). Os valores encontrados nesse trabalho
demonstram então a alta capacidade de absorção de água apresentada pelos criogéis produzidos.
Outra medida útil para avaliação da expansão do criogel é o grau de expansão. Esse parâmetro
fornece uma relação entre a massa do criogel seco (em condição de armazenamento) e o volume
que o mesmo ocupa em condições operacionais (Fontan et al., 2018). Os valores obtidos para
o grau de demonstram que uma pequena massa de criogel seco ocupa um grande volume quando
hidratado, o que reforça a natureza porosa de sua estrutura (Da Silva et al., 2019). Já O valor
encontrado para fração de macroporos do criogel hidratado variou entre 78,2% para o criogel
contendo cobre e 82.8% para o criogel controle. Essa diferença provavelmente se deve ao alto
potencial de polimerização do agente quelante IDA, que atua como braço espaçador e diminui
o tamanho dos poros formados. Assim mesmo, a porosidade dos criogéis ativados apresentou-
se relativamente alta.

A partir da metodologia usada, foram avaliadas duas frações de poros distintas nas
matrizes A porosidade total dos monólitos variou entre 93,1% para o criogel ativado com cobre
e 94,1% para o criogel controle, indicando que a água presente nos criogéis saturados com água
representa mais de 93% de sua massa total.

A avaliação morfológica das matrizes produzidas foi realizada através da análise de

microscopia de varredura (MEV), sendo as imagens obtidas apresentadas na Figura 3. Observa-
se que as matrizes apresentaram estrutura homogênea, com poros grandes e interconectados.
Verifica-se o predomínio de macroporos com diâmtro entre 30 e 70µm, em acordo com o

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reportado por diversos autores (Da Silva et al., 2019, Plieva et al., 2004). As dimensões de
poros observada facilita os processos de purificação com um menor número de etapas, pois
permitem a passagem de macromoléculas, células microbianas, fragmentos celulares e até
mesmo soluções concentradas e particuladas. (Gonçalves et al., 2017, Fontan et al., 2018)
Verifica-se também a diferença entre as imagens das matrizes controle (A a B) e
funcionalizada (C e D). Observa-se na matriz funcionalizada a existência de pontos de
rugosidade na superfície dos poros, que pode ser atribuída à inclusão dos braços espaçadores
de IDA nos sítios ativados da superfície dos criogéis, e posterior funcionalização com o metal
de interesse (Cu2+), indicando que a mesma foi bem-sucedida.

Figura 2 – Micrografias de MEV das matrizes controle (A e B) e funcionalizadas (C e D).

4. CONCLUSÃO

Foi produzida uma matriz polimérica macroporosa funcionalizada com anilina para o uso
na captura de proteínas por interação hidrofóbica. Tal funcionalização foi confirmada a partir
das imagens de MEV. Foram avaliadas algumas modificações no processo de produção e
caracterização de criogéis. A enxertia ocorreu de modo dinâmico, ao invés do estático, com as
soluções ativadora e de AMPSA sendo bombeadas em circuito fechado através dos criogéis.
Tal alteração não provocou mudanças consideráveis na capacidade de inchamento (S) e no grau
(G) e densidade (D) de enxertia, mas o rendimento (E) da mesma foi inferior ao reportado na
literatura. Dessa forma, a matriz produzida apresenta potencial para utilização em processos de
captura de proteínas por interação hidrofóbica.

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