Introdução às Ciências Biológicas

Ano Letivo 2022/2023

TL2 – EXTRAÇÃO DE DNA PLASMÍDICO SEGUIDO DE DIGESTÃO

COM ENZIMA DE RESTRIÇÃO E VISUALIZAÇÃO POR
ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE

Trabalho realizado por:

Bernardo Carola, nº 106118
Catarina Gonçalves, nº 107011
Sara Brandão, nº 107003

Entregue a: 26/03/2023

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Índice
Resumo ..............................................................................................................................3
Materiais e métodos .........................................................................................................3
Resultados e discussão .....................................................................................................5
Bibliografia ........................................................................................................................6

Resumo

A atividade laboratorial realizada teve como objetivo a extração de dois plasmídeos (o

vetor clonagem pUC19 e o plasmídeo recombinado pLM73-2) e dividiu-se em três grandes
procedimentos. Inicialmente procedeu-se à extração do DNA plasmídico de Escherichia Coli por
lise alcalina com purificação em coluna de afinidade (TL2A), seguida da digestão desse mesmo
DNA por ação de uma endonuclease por restrição (TL2B) e visualização do mesmo por
eletroforese em gel de agarose (TL2C).

Neste trabalho a lise alcalina foi feita de forma a promover a dissolução da membrana
plasmática e a desnaturação de macromoléculas (DNA) por adição de detergente SDS e de uma
solução de hidróxido de sódio, respetivamente. De seguida, pipetou-se ainda uma solução de
acetato de potássio de forma a gerar um precipitado do complexo de SDS. Devido às grandes
dimensões, o DNA não consegue voltar à sua estrutura inicial permanecendo sob a forma de
agregados que após centrifugação são cuidadosamente separados do sobrenadante.

Quanto ao processo de ação da endonuclease por restrição, neste trabalho foi utilizada
HindIII para linearizar os plasmídeos recolhidos e PstI para remover o fragmento do gene
pretendido clonado no vetor pUC19 (BCAM2418), obtendo-se dois fragmentos de restrição.

Relativamente à técnica de eletroforese utilizada, foi possível a separação de fragmentos

de DNA de acordo com seu tamanho/densidade, segundo uma corrente elétrica aplicada que os
faz avançar ao longo do gel. Tendo em conta a migração em pixéis (eixo dos xx) e o logaritmo do
tamanho das bandas padrão em pares de base (eixo dos yy) a equação da reta de calibração
obtida foi 𝑦 = −0,006𝑥 + 5,0096. Assim, foi possível determinar o tamanho dos fragmentos
(que está diretamente relacionado com o seu peso molecular), sendo comprovado que quanto
maior o seu tamanho, menor é a distância percorrida ao longo do gel.

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Material e Procedimento Experimental

Inicialmente, inoculou-se a estirpe E. coli αDH5 contendo os plasmídeos pUC19 pLM73-

2 em 5 mL de meio LB contendo 150 mg/L de ampicilina. Após esta preparação realizada pelo
professor deixaram-se as culturas incubadas durante a noite a 37°C, com agitação 250rpm, o que
provocou a lise celular. De seguida, e já realizado em aula, recolheu-se 1,5 mL da cultura para
um microtubo e centrifugou-se durante 2 min a 8000g. Removeu-se completamente o
sobrenadante e adicionou-se mais 1,5 mL da cultura. Voltou-se a centrifugar durante 2 min a
8000g, removeu-se completamente o sobrenadante e suspendeu-se novamente o sedimento
em 250 µL de solução A1 (solução comercial contendo lisozima). Consecutivamente, adicionou-
se 250 µL de solução A2 (solução comercial contendo hidróxido de sódio e detergente SDS) que
permitiu a dissolução da membrana plasmática e a desnaturação de macromoléculas (DNA) e
misturou-se por inversão do microtubo. Adicionou-se ainda 300 µL de solução A3 (solução
comercial de acetato de potássio) de forma a gerar um precipitado do complexo de SDS e
misturou-se novamente por inversão do microtubo. Centrifugou-se durante mais 10 min a
16000g permitindo separar os precipitados de DNA. Em seguida recolheu-se o sobrenadante do
microtubo, com cuidado para evitar a recolha de sedimento, e colocou-se na coluna contendo
um tubo de recolha por baixo. Centrifugou-se durante 1 min a 16000g e descartou-se o líquido
do tubo de recolha. Adicionou-se 500 µL de tampão AY (tampão de lavagem comercial) à coluna,
centrifugou-se 1 min a 16000g e mais uma vez descartou-se o líquido do tubo de recolha.
Adicionou-se ainda 600 µL de tampão A4 (tampão de lavagem comercial contendo etanol) à
coluna, centrifugou-se por 1 min a 16000g e descartou-se o tubo de recolha. Colocou-se um tubo
de recolha novo e centrifugou-se durante 2 min à velocidade máxima para fosse possível a
secagem da coluna. Transferiu-se a coluna para um microtubo de 1,5 mL e adicionou-se 50 µL de
água desmineralizada, onde se aguardou alguns minutos à temperatura ambiente. De seguida
centrifugou-se por 1 min a 16000g e por fim, removeu-se a coluna e guardou-se o microtubo
contendo a solução do plasmídeo.

Na segunda etapa do trabalho linearizaram-se os plasmídeos pUC19 e pLM73-2 através

da endonuclease Hind III e removeu-se o fragmento do gene BCAM2418 clonado no vetor pUC19
com auxílio da endonuclease PstI. Com isto, obtiveram-se dois fragmentos de restrição um com
1911 pb e outro com 2686 pb. De seguida, prepararam-se três microtubos com o plasmídeo
pLM73-2 e dois com o plasmídeo pUC19 cada um com 5 µL com o respetivo plasmídeo. Ainda
nos microtubos com plasmídeo pUC19 adicionou-se 15 µL de água a um deles e 12,5 µL de água,
2 µL de tampão HindIII e 0,5 µL de enzima de restrição de Hind III ao outro. Nos microtubos de
pLM73-2 colocou-se 15 µL de água a um, 12,5 de água, 2 µL de tampão HindIII e 0,5 µL de enzima
de restrição de HindIII a outro e ainda, 12,5 de água, 2 µL de tampão de PstI e 0,5 µL de enzima
de restrição de PstI ao terceiro. Misturou-se tudo cuidadosamente e incubou-se a 37°C durante
1h (processo feito pelo professor com amostras de turnos anteriores).

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Na última etapa da atividade, novamente realizada pelo professor, preparou-se um gel

de agarose com concentração de 0,8% em tampão TAE (1x). Pesaram-se 0,8 g de agarose e
misturou-se com 100 mL de tampão TAE, aquecendo-se no micro-ondas até dissolver, mas sem
ferver. Durante o arrefecimento da agarose preparou-se um molde com um pente de 8 dentes
de modo a formar 8 câmaras com a possibilidade de aplicação de 20 µL da solução de DNA em
cada um deles. Após arrefecimento até aos 50°C, adicionou-se 1 µL de Green Safe a 50 mL da
solução de agarose e misturou-se. Este composto permitirá posteriormente a visualização dos
ácidos-nucleicos no gel. De seguida, deitou-se a mistura líquida dentro do molde e deixou-se
solidificar o gel durante 15 min. Removeu-se depois cuidadosamente o pente e as borrachas do
topo do molde do gel e colocou-se o gel (ainda sobre o molde) na tina horizontal de eletroforese.
Encheu-se a unidade com tampão TAE (1x) até que o nível do tampão cobrisse e ultrapassasse
em 1 mm a superfície do gel. A cada amostra de DNA plasmídico, adicionou-se 2 µL de loading
buffer com elevada densidade e aplicou-se em cada uma das câmaras presentes no gel cada uma
das amostras. Como referência, aplicou-se 5 µL de uma amostra contendo uma mistura de
fragmentos de DNA com tamanho conhecido (entre 200 e 10000 pares de bases). Por fim, e já
realizado durante a aula de laboratório, fechou-se a tina e ligou-se os elétrodos à fonte de
alimentação, tendo em conta as cores e não esquecendo que os ácidos nucleicos migram para o
ânodo (local que oxida). Iniciou-se a eletroforese por aplicação de um campo elétrico. Após
separação eletroforética, retirou-se o molde com o gel do tampão e visualizou-se o DNA pela
fluorescência emitida pelo Green Safe quando irradiado com radiação UV, utilizando um
equipamento Gel Doc. Por fim, fotografou-se o gel e analisaram-se os resultados.

Quanto aos materiais, foram utilizados ao longo de todo o procedimento microtubos,

pipetas, juntamente com as pontas adequadas às mesmas para a colocação e manejamento das
soluções, e ainda a centrifugadora para a mistura das mesmas. Foram ainda utilizadas luvas de
segurança e sempre que as soluções deixavam de ser utilizadas eram dispensadas para
recipientes próprios.

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Resultados e Discussão

Figura 1 - Migração das amostras no gel de agarose após a Figura 2 - Marcador dos tamanhos e pesos
conclusão da eletroforese. Moleculares (NZYDNA ladder III)

Tabela 1 – Relação entre a migração de cada banda padrão (kb ladder) da Figura 1, com o tamanho das bandas
padrão

Tamanho das bandas Log do tamanho das bandas Migração (pixéis)

padrão (bp) padrão (bp)
10000 4,000 160
7500 3,875 181
6000 3,778 203
5000 3,699 217
4000 3,602 237
3000 3,477 260
2500 3,397 275
2000 3,301 295
1400 3,146 322
1000 3,000 348
800 2,903 365
600 2,778 382
400 2,602 398
200 2,301 417

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Tabela 2 - Migração das bandas das amostras dos plasmídeos.

Puc19 + Hindlll PLM73-2 + Hindlll PLM73-2 + PstI PLM73-2 + PstI

(1ª banda) (2ª banda)
Migração 277 222 264 294
(pixéis)
Log do tamanho da banda (bp)

Figura 3 - Logaritmo do tamanho das bandas em relação à sua migração e respetiva reta de calibração.

Cálculo dos tamanhos das bandas

Substituindo os valores obtidos, organizados na Tabela 2, na reta de calibração da Figura 3,
𝑦 = −0,006𝑥 + 5,0096 é possível calcular o tamanho de cada uma das bandas dos plasmídeos.

pUC19 + Hindlll:

𝑦 = −0,006 × 227 + 5,0096 = 3,6476

Log (TB) = 3,6476 bp TB = 4442,2 bp
2686−4442,2
𝐸𝑟𝑟𝑜% = | 2686
|× 100 = 65,38%

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pLM73-2 + Hindlll:

𝑦 = −0,006 × 222 + 5,0096 = 3,6776 4597

Log (TB) = 3,6776 bp TB = 4759,9 bp
(2686+1911)−4759,9
𝐸𝑟𝑟𝑜% = | (2686+1911)
|× 100 = 3,54%

pLM73-2 + PstI (1ª banda):

𝑦 = −0,006 × 264 + 5,0096 = 3,4296

Log (TB) = 3,4296 bp TB = 2689,1 bp
2686−2689,1
𝐸𝑟𝑟𝑜% = | |× 100 = 0,12%
2686

pLM73-2 + PstI (2ª banda):

𝑦 = −0,006 × 294 + 5,0096 = 3,2456

Log (TB) = 3,2456 bp TB = 1760,4 bp
1911−1760,4
𝐸𝑟𝑟𝑜% = | |× 100 = 7,88%
1911

Embora os resultados dos tamanhos das bandas do PLM73-2 não tenham erros
significativos, quer para o PLM73-2 + Hindlll quer para as duas bandas de PLM73-2 + PstI, o
tamanho da banda de PUC-19 + Hindlll apresenta um erro imenso em relação ao valor tabelado,
que se pode dever a erros laboratoriais durante a execução do trabalho, por exemplo, erros de
medição, erros no manuseamento das amostras e contaminação das mesmas, dos quais não
sabemos, já que a Figura 1 não corresponde à eletroforese das amostras que preparamos. No
entanto, podem também ter sido cometidos erros aleatórios na medição dos pixéis das bandas,
uma vez que o método utilizado não foi o mais preciso e erros sistemáticos ao utilizar a reta de
calibração da Figura 3 para calcular os tamanhos das bandas, dado que é uma aproximação de
valores.

É de salientar que exceto o PLM73-2 + PstI todas as outras amostras deveriam apresentar
apenas uma banda, o que não aconteceu. O que se pode dever a erros laboratoriais que levaram
à heterogeneidade da resposta ao meio onde as amostras se encontram. Por isso, de modo a
calcular os seus tamanhos escolhemos as bandas que se destacavam mais. Tanto na primeira
como na quarta coluna podemos justificar a banda mais afastada devido às amostras não terem
reagido completamente com a enzima Hindlll. Devemos ainda notar que os grandes fragmentos
de DNA migram mais rápido do que os pequenos havendo formação de “rastros” que refletem a
má resolução dos fragmentos.

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Concluímos assim que quanto maior o tamanho das bandas, menor a sua migração, ou
seja, menos afastadas se encontram.

Bibliografia

Bibliografia
Guia de trabalhos laboratoriais TL1 e TL2.