Introdução às Ciências Biológicas (ICB)

TL4 - A diversidade microbiana no Mundo que nos rodeia

Ficha de Registo de resultados e relatório

Data de realização do trabalho 28 / 03 / 2023

Curso / Turno / Grupo Licenciatura Engenharia do Ambiente (terça-feira 2D)
Elementos do grupo:
Nº106118 Bernardo Carola
Nº107011 Catarina Gonçalves
Nº107003 Sara Brandão

RESUMO

A atividade laboratorial realizada teve como objetivo ficar a conhecer processos introdutórios
relativos à metodologia experimental associada aos laboratórios de Microbiologia, em especial a
detenção e caracterização de comunidades microbianas. Assim, foram realizados procedimentos
básicos de preparação de meios de cultura líquidos e sólidos, de esterilização de materiais na
autoclave, manipulação de micróbios em condições de assépsia, e isolamento de colónias de bactérias
e fungos em diferentes meios sólidos.

Neste trabalho foram efetuados 3 processos distintos onde inicialmente foi realizada uma
preparação de meios de cultura líquidos e sólidos, inoculação de meios de culturas e repicagem de
culturas (Parte A). De seguida, foi efetuado o isolamento e enumeração de colónias de bactérias e
fungos a partir de amostras ambientais, e efeito de agentes antimicrobianos no crescimento
microbiano (Parte B). E, por fim, o mundo microscópico que habita a superfície da nossa pele:
isolamento de colónias microbianas e efeito da lavagem ou desinfeção das mãos (Parte C).

Após alguns dias de incubação pudemos verificar que na generalidade das amostras utilizadas na
atividade laboratorial houve crescimento considerável das comunidades microbianas notando-se, na
sua maioria, facilmente a sua presença. No entanto, na parte B9 e C2 do trabalho verificamos que,
efetivamente não houve crescimento de colónias microbianas devido, possivelmente, ao tempo
insuficiente de incubação ou às condições do laboratório e à lavagem/desinfeção das mãos,
respetivamente.

TL4-A INOCULAÇÃO DE MEIOS DE CULTURA

A.1 – Registe na Tabela 1 a evolução da turbidez no meio líquido inoculado, recorrendo à
escala qualitativa indicada no guia de trabalhos laboratoriais (TL4-A) e a fotografias
ilustrativas.

Tabela 1 – Evolução da turbidez no meio líquido inoculado com células da espécie microbiana S.
cerevisial durante a incubação da cultura a 30ºC.

Tempo (h) Turbidez (escala Fotografias ilustrativas

qualitativa)

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0h Pouco turvo

Aproximadamente Consideravelmente
56h turva

A.2 - Interprete os resultados apresentados na Tabela 1, indicando se ocorreu crescimento

da cultura microbiana durante o período de incubação indicado e justificando a sua
conclusão.

Tendo em conta os resultados apresentados na Tabela 1 podemos verificar que

ocorreu um crescimento considerável da cultura microbiana durante o período de incubação
a 30ºC. Verificou-se ainda que as leveduras se encontravam no fundo do balão Erlenmeyer,
devido ao peso das suas células. Quando misturámos o líquido este ficou ainda mais turvo.

TL4-B. ISOLAMENTO E ENUMERAÇÃO DE BACTÉRIAS HETEROTRÓFICAS E FUNGOS A PARTIR

DE AMOSTRAS AMBIENTAIS, E EFEITOS DE AGENTES ANTIMICROBIANOS NO SEU
CRESCIMENTO
B.1 – Descrição da amostra
□ Tipo de amostra e local da colheita: Folhas em decomposição (Sintra)
□ Data / hora da colheita: 27/03/2023
□ Modo de armazenamento até à realização da análise: Tubo de Falcon
□ Data e hora da análise: 28/03/2023
□ Massa de amostra analisada (g): 8,0 g
□ Volume total de suspensão inicial obtido (mL): 15 mL

B.2 - Observe a diversidade das colónias isoladas nos meios de cultura (onde não aplicou
discos com agentes antimicrobianos) e registe o número de tipos morfológicos diferentes de
colónias que encontrou em cada um dos meios de cultura:
- No meio PDA+CT (meio “Potato Dextrose Agar” suplementado com o antibiótico
clortetraciclina): 5 tipos morfológicos diferentes de colónias
- No meio TSA (meio “Tryptic Soy Broth” agarizado): 10 tipos morfológicos diferentes de
colónias
(Nota: para cada um dos meios de cultura, considere todas as colónias observadas no conjunto
das várias placas de Petri que contenham colónias isoladas).

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B.3. – Relativamente às placas de Petri referidas em B.2, designe cada tipo diferente de
colónia com um número ou um letra, registe-a na Tabela 2 e descreva a sua morfologia.
(Sugestão: Registe e descreva até 5 colónias com morfologias diferentes em cada meio)

Tabela 2 – Descrição sumária da morfologia dos diferentes tipos de colónias isoladas nos meios PDA+CT
e TSA.
Meio Designação Descrição sumária da colónia Existe indício de
de da (ver instruções indicadas no atividade com possível interesse industrial
cultura colónia Guia / TL4-B) ou comercial?
(com letra ou Se sim, indique qual.
número) (ver Guia / TL4-B)
A Branca, brilhante e mucosa, circular, aplicação potencial como espessante,
margem inteira, convexa e lisa gel, etc.
TSA B Branca, brilhante e mucosa, irregular, aplicação potencial como espessante,
margem inteira, convexa e lisa gel, etc.
C Branca, baça, pontiforme, margem
inteira, plana e lisa
D Amarela, brilhante e mucosa, circular, aplicação potencial como espessante,
margem inteira, convexa e lisa gel, etc. e aplicação potencial como
antioxidante ou corante, para a
indústria de materiais, alimentos, etc.
E Amarela, brilhante e mucosa, aplicação potencial como espessante,
irregular, margem inteira, convexa e gel, etc. e aplicação potencial como
lisa antioxidante ou corante, para a
indústria de materiais, alimentos, etc.
F Amarela, baço, irregular, aplicação potencial como
PDA + margem inteira, plana e lisa antioxidante ou corante, para a
indústria de materiais, alimentos, etc.
CT G Preta, baço, circular, aplicação potencial como antioxidante ou
margem inteira, plana e lisa corante, para a indústria de materiais,
alimentos, etc.
H Preta, baço, pontiforme, aplicação potencial como antioxidante ou
margem inteira, plana e lisa corante, para a indústria de materiais,
alimentos, etc.
I Creme, baço, irregular,
margem inteira, plana e lisa
J Branca, baço, circular,
margem inteira, plana e lisa

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(Não é possível verificar o brilho nas figuras abaixo devido à má qualidade das fotografias)

Figura 1 - Amostra folhas em Figura 2 - Amostra folhas em decomposição Figura 3 - Amostra folhas em Figura 4 - Amostra folhas em decomposição
decomposição B em meio TSA, incubada B1 (diluição 1:10) em meio TSA, incubada decomposição B2 (diluição 1:100) em meio B3 (diluição 1:1000) em meio TSA, incubada
durante 2 dias a temperatura ambiente. durante 2 dias a temperatura ambiente. TSA, incubada durante 2 dias a durante 2 dias a temperatura ambiente.
temperatura ambiente.

Figura 5 - Amostra folhas em Figura 6 - Amostra folhas em Figura 7 - Amostra folhas em decomposição
decomposição B em meio PDA+CT, decomposição B1 (diluição 1.10) em meio B2 (diluição 1.100) em meio PDA+CT,
incubada durante 2 dias a temperatura PDA+CT, incubada durante 2 dias a incubada durante 2 dias a temperatura
ambiente. temperatura ambiente ambiente

B.4.- Registe na tabela seguinte o número total de colónias contadas nas placas de meio
TSA e de meio PDA+CT onde espalhou as suspensões de amostra ambiental.

Tabela 3 – Número total de colónias contadas na superfície de meio sólido TSA ou PDA+CT onde
foram espalhadas a “suspensão inicial” e as “diluições” B1 (1:10), B2 (1:100) e B3 (1:1000), após
incubação à temperatura ambiente durante o período de tempo indicado.

Meio de Tempo de incubação Suspensão Número total de

cultura (dias) colónias
B incontável
TSA 2 dias B1 incontável
B2 420
B3 40
B incontável
PDA+CT 2 dias B1 58
B2 10

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B.5 - Calcule o número total de Unidades Formadoras de Colónias (UFCs) por g de solo das
comunidades microbianas de bactérias heterotróficas (meio TSA) e de fungos (meio PDA+CT)
presentes na amostra ambiental que analisou.
Explique os cálculos realizados (veja orientações no Guia do TL4-B) e registe os valores
obtidos na Tabela 4. Faça uma explicação detalhada do raciocínio usado nos cálculos para o
caso do meio TSA, incluindo uma análise crítica quanto aos critérios usados na seleção dos
resultados experimentais obtidos (Tabela 3).

Em seguida a calcular a quantidade de amostra presente nos 50 µL de suspensão

utilizados devemos, nas suspensões diluídas, dividir essa quantidade pelo grau de diluição e
posteriormente dividir o número total de colónias contadas (Tabela 3) por este mesmo valor.

Para calcular o número total de Unidades Formadoras de Colónias por g de amostra das
comunidades de bactérias heterotróficas (meio TSA) só conseguimos utilizar número de colónias das
suspensões B2 e B3, já que as da B e B1 eram incontáveis. É fundamental realçar que os números
totais de colónias podem não ser exatos devido a erros experimentais na contagem dos mesmos. No
entanto, podemos concluir que a contagem foi relativamente precisa, uma vez que os números totais
de Unidades Formadoras de Colónias por g de amostra são aproximadamente semelhantes. Por fim
devemos calcular a média entre estes dois valores e assim obtemos a concentração média de UFC na
amostra.

Tabela 4 – Concentração de Unidades Formadoras de Colónia (UFC) das comunidades microbianas

isoladas em cada meio de cultura a partir da amostra ambiental descrita em B.1.

Meio de Grupo/tipo de microrganismos Concentração média de UFC na amostra

cultura isolados (número de UFC / g de amostra)
(em notação científica)
TSA Bactérias heterotróficas 1,6 × 106 𝑈𝐹𝐶/𝑔

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PDA+CT Fungos 2,9 × 104 𝑈𝐹𝐶/𝑔

B.6. - Compare os resultados que obteve nos meios PDA+CT com os obtidos no meio TSA
termos da diversidade (tendo em conta diferenças na morfologia das colónias como as
apresentadas em B.2 e B.3) e de quantidade (com base nos resultados de concentração de
UFC obtidos em B.5) das diferentes comunidades microbianas presentes na amostra que
analisou.
Para além disso, pesquise* informação publicada sobre bactérias e fungos presentes em
amostras de tipo semelhante à analisada no trabalho e compare com os resultados obtidos
pelo grupo (caso tenha pesquisado e não tenha obtido nenhuma informação relevante,
refira-o na mesma aqui).

Tal como foi descrito em B.2 e B.3 o meio TSA apresenta maior diversidade na
morfologia das suas colónias em comparação com o meio PDA+CT. Uma vez que o meio TSA
apresenta 10 tipos de colónias morfologicamente diferentes, enquanto o meio PDA+CT
apresenta apenas 5 tipos de colónias morfologicamente diferentes. No entanto, é de notar que
embora existam menos tipos diferentes de colónias no meio PDA+CT estas mesmas colónias
diferem mais entre si (tem cores e tamanhos mais contrastantes) do que as colónias no meio
TSA (variam mais na sua forma e brilho).
Através dos cálculos realizados em B.5 podemos concluir que o meio TSA apresenta
uma maior quantidade das diferentes comunidades microbianas do que o meio PDA+CT, com
base nas suas concentrações médias de UFC/g, 1,6 × 106 𝑈𝐹𝐶/𝑔 e 2,9 × 104 𝑈𝐹𝐶/𝑔,
respetivamente.
A nossa amostra era de folhas em decomposição de Sintra e não conseguimos
encontrar informação publicada sobre amostras de tipo semelhante à mesma e desta forma
não encontramos informação relevante.

B.7 – Pesquise (em literatura científica disponível, em papel e/ou online, seguindo as
orientações indicadas em “*Nota” na questão B.6) para indicar um exemplo de
microrganismo (género ou espécie) que é frequente encontrar no tipo de amostra que
analisou e, se possível, indique atividade(s) desse microrganismo nesse habitat/ambiente.

É comum encontrar o género Pseudomonas spp. em vários ambientes, nomeadamente

no solo em matéria vegetal em decomposição. São rizobactérias cuja principal atividade neste
ambiente é promover o crescimento vegetal através das hormonas que produzem (Melo, 1998).

B.8 – Estime a quantidade (em mg ou mL, consoante os casos) de cada agente antimicrobiano
(ampicilina, gentamicina, fluconazole, etanol e hipoclorito de sódio) presente nos discos de
papel, e discuta o seu efeito antimicrobiano nas diferentes comunidades microbianas (de
bactérias heterotróficas ou de fungos), que caracterizam a sua amostra (Nota: recorra ao
registo fotográfico das placas de Petri, com legendas suficientemente informativas, para
mostrar esses resultados).

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Utilizamos cerca de 1,0 × 10−2 𝑚𝐿 de cada agente antimicrobiano (ampicilina,

gentamicina, fluconazole, etanol e hipoclorito de sódio), cada um no seu disco de papel
respetivo, contendo assim 5 discos cada placa de Petri.
Tal como podemos observar na Figura 8, os agentes antimicrobianos que causam
algum efeito nas bactérias heterotróficas, no meio TSA sem diluição, são o etanol e a lixivia
que apresentam ao seu redor um halo circular com ausência de crescimento de colónias. No
entanto, na Figura 9, no meio TSA com diluição 1:10, para além do etanol e a lixivia, a
gentamicina também causa efeito antibiótico, já que existe uma ausência de bactérias
heterotróficas ao seu redor. Não podemos tirar conclusões a partir das Figuras 10 e 11, já que
devido à suspensão estar mais diluída, as bactérias encontram-se mais afastadas e por isso não
é possível perceber se, em redor aos discos, existe um halo circular com ausência de
crescimento de bactérias heterotróficas.
No meio PDA+CT o agente que apresenta maior efeito antimicrobiano é a lixivia, como
observamos na Figura 12, embora o fluconazole também tenha algum efeito apresentando um
menor halo circular com ausência de fungos ao seu redor. As Figuras 13 e 14 são pouco
conclusivas mais uma vez porque são tão poucos fungos, que não conseguimos perceber se
existe um halo em redor aos discos.

Figura 8 - Amostra folhas em Figura 9 - Amostra folhas em Figura 10 - Amostra folhas em Figura 11 - Amostra folhas em
decomposição B em meio TSA, com discos decomposição B1 (diluição 1:10) em meio decomposição B2 (diluição 1:100) em meio decomposição B3 (diluição 1:1000) em
com agentes antimicrobianos, incubada TSA, com discos com agentes TSA, com agentes antimicrobianos, meio TSA, com agentes antimicrobianos,
durante 2 dias a temperatura ambiente antimicrobianos incubada durante 2 dias a incubada durante 2 dias a temperatura incubada durante 2 dias a temperatura
temperatura ambiente ambiente ambiente

Legenda:
A- Ampicilina
G- Gentamicina
F- Fluconazole
E- Etanol
L- Lixivia

Figura 12 - Amostra folhas em Figura 13 - Amostra folhas em Figura 14 - Amostra folhas em

decomposição B em meio PDA+CT, com decomposição B1 (diluição 1.10) em meio decomposição B2 (diluição 1.100) em meio
agentes antimicrobianos, incubada durante PDA+CT, com agentes antimicrobianos, PDA+CT, com agentes antimicrobianos,
2 dias a temperatura ambiente incubada durante 2 dias a temperatura incubada durante 2 dias a temperatura
ambiente ambiente

B.9 - Mostre fotografias das colónias isoladas nas placas de meio TSA ou PDA+CT a partir do
“swab” realizado sobre a superfície sólida. Escreva, por debaixo da(s) figura(s), uma legenda
que seja explícita em relação ao que está a mostrar (por exemplo, superfície onde foi
recolhida a amostra, meio de cultura, temperatura e tempo de incubação).

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Discuta se encontra algumas semelhanças macroscópicas entre as colónias isoladas a partir

da superfície sólida e algumas das colónias isoladas a partir da amostra ambiental (descritas
em B.3), indicando descrições resumidas de características morfológicas das colónias
isoladas que lhe pareçam mais relevantes e sim, dê pelo menos uma razão plausível.

Figura 15 – “swab” da superfície Figura 16 - “swab” da superfície

de uma torneira, em meio TSA, de uma torneira, em meio
incubada a 30º durante 2 dias. PDA+CT, incubada a 30º durante
2 dias.

Tal como podemos observar nas Figuras 15 e 16 não ocorreu o crescimento de

colónias, tanto no meio TSA como no meio PDA+CT, ou seja, não houve a proliferação celular
das unidades formadoras da colónia. Este fenómeno pode se dever ao tempo de incubação
não ter sido suficiente para a taxa de crescimento dos micróbios isolados. Existe também a
possibilidade de as unidades celulares não serem capazes de se adaptar às condições artificiais
(os meios de cultura, temperatura, etc.) do laboratório, as suas necessidades nutricionais e
ambientais podem não ser satisfeitas ou então podem depender de interações metabólicas
com outros micro- ou macro-organismos que não foram replicadas no contexto de laboratório,
e por isso não são detetáveis.
Deste modo, não podemos fazer uma comparação com as colónias isoladas a partir da
amostra ambiental, já que não obtivemos colónias isoladas a partir da superfície sólida.

TL4-C) O MUNDO MICROSCÓPICO QUE HABITA A SUPERFÍCIE DA NOSSA PELE: ISOLAMENTO

DE COLÓNIAS MICROBIANAS E EFEITO DA LAVAGEM OU DESINFEÇÃO DAS MÃOS

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C.1 - Insira fotografias das placas de Petri (vistas de cima; tiradas através da tampa) de modo
a mostrar as colónias que isolou nesta parte do trabalho. Numere a(s) figura(s) e escreva ao
lado do número, por baixo da figura, uma legenda adequada, i.e., que descreva
sucintamente o que é mostrado. Nessas imagens, indique (com setas ou outra forma que
prefira) exemplos de colónias com tipos morfológicos diferentes, e descreva-as sucintamente
na legenda da imagem (use os critérios usados na Tabela 2 para descrever a morfologia das
colónias).

Figura 17 – Amostra após a Figura 18 – Amostra antes da

lavagem das mãos. Nesta figura lavagem das mãos. Nesta figura
podemos observar colónias podemos observar colónias
brancas, baças, circulares com brancas, baças, circulares com
margens inteira e superfície lisa (B) margens inteira e superfície lisa e
e colónias brancas, baças, colónias brancas, baças,
pontiformes com margens inteira e pontiformes com margens inteira e
superfície lisa. superfície lisa (A).

C.2 – Tendo em conta o conjunto de resultados obtidos, qual a situação onde observou maior
diversidade microbiana? Explique, fazendo referência às fotos que mostrou em C.1, e sugira
explicação(ões) plausível(eis).

Tendo em conta os resultados obtidos, ambos as situações têm iguais diversidades

microbianas, sendo que antes da lavagem das mãos (Figura 18) existe uma quantidade
significativamente maior de ambas as colónias, enquanto que depois da lavagem das mãos
(Figura 17), há uma menor quantidade de colónias, resultante da sua remoção através da
lavagem e/ou desinfeção das mãos.

C.3 - Pesquise (em literatura científica disponível, em papel e/ou online, seguindo as
orientações indicadas em “*Nota:” na questão B.6) para indicar dois exemplos de
microrganismos que fazem parte da microbiota usual da pele humana (microrganismos
residentes) ou que podem ser transientes na superfície da pele (pode escolher indicar um
exemplo de cada tipo). Escreva um pequeno texto (por exemplo, 6 linhas) sobre cada um dos
microrganismos que indicou, referindo qual(is) o(s) seu(s) papel(is) / impacto(s) na pele e, se
possível, qual a sua proveniência previsível (no caso de micróbios transientes na pele).

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A pele é o maior órgão do corpo humano e está diariamente em contacto com uma
infinidade de microrganismos, mas devido ao seu pH ácido de 5,6 impede a sobrevivência
destes. As principais espécies bacterianas presentes na pele são Gram+. Dois exemplos destes
microrganismos são a bactéria Staphylococcus epidermidis e o fungo Malassezia. A primeira é
uma bactéria que faz parte da microbiota residente da pele e ajuda a prevenir a colonização
de microrganismos perigosos. Já a segunda é um fungo que faz parte da microbiota transiente
da pele e pode causar problemas de saúde se houver uma proliferação excessiva, como
dermatite seborreica (Fajardo, 2015).

D. BIBLIOGRAFIA
Melo, I. S. (1998). ECOLOGIA MICROBIANA. Embrapa Meio Ambiente. pp.87-88

Fajardo, A. C. (2015). CARACTERIZAÇÃO DO MICROBIOMA HUMANO.

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