OTIMIZAÇÃO DO MEIO DE CULTIVO SUBMERSO DE Pseudomonas

aeruginosa UTILIZANDO RESÍDUOS AGROINDUTRIAIS PARA

PRODUÇÃO DE LIPASE
Jéssyca Cipriano Barbosa Vasconcelos1*; Ândria Aline Pojo Ribeiro2; Alex Fernando de Almeida3;
Claudia Cristina Auler do Amaral Santos4
1
Graduação em Engenharia de Alimentos, Mestranda no Programa de Pós-graduação em Ciência e
Tecnologia de Alimentos-PPCGTA, Fundação Universidade Federal do Tocantins-UFT, Palmas,
Tocantins, Brasil.
2
Graduanda do curso de Engenharia de Alimentos, Fundação Universidade Federal do Tocantins-UFT,
Palmas, Tocantins, Brasil.
3
Doutor, Pesquisador e Professor do Programa de Pós-graduação em Ciência e Tecnologia de
Alimentos-PPCGTA, Fundação Universidade Federal do Tocantins-UFT, Gurupi, Tocantins, Brasil.
4
Doutora, Pesquisadora e Professora do Programa de Pós-graduação em Ciência e Tecnologia de
Alimentos-PPCGTA, Fundação Universidade Federal do Tocantins-UFT, Palmas, Tocantins, Brasil.
*E-mail jessyca.cipriano123@gmail.com

Resumo
Várias abordagens econômicas e eficientes estão sendo testadas para aumentar a produção de lipases a
partir de cepas microbianas e seus potenciais de aplicações. Este trabalho tem como objetivo selecionar
resíduos agroindustriais como indutores para produção de lipase a partir de Pseudomonas aeruginosa
(TCMK 71) autóctone isolada de fruto amazônico e otimizar o meio de cultivo utilizando um
delineamento composto central rotacional (DCCR). Foram testados como indutores, a milhocina,
glicerol bruto, óleo de algodão e efluente do biodiesel, separadamente, em concentração de 1%. Os
meios de cultivo estéreis foram inoculados com 2 mL da suspensão de células (8,0 x 10 4 UFC/mL) e
mantidos a 150 rpm, 30 °C por 48 horas. No DCCR foram utilizadas quatro variáveis independentes,
sendo a concentração do indutor como fonte de carbono (efluente do biodiesel), fonte de nitrogênio
(extrato de levedura), temperatura e pH. A variável resposta utilizada para a seleção do melhor meio de
cultivo foi a atividade de lipase (U/mL). Obteve-se como parâmetros otimizados, a utilização de 30 g/L
de fonte de carbono, 1 g/L de fonte de nitrogênio, 30° C e pH= 7,0, atingindo produção de 3,09 U/mL
de atividade enzimática. Espera-se com este trabalho promover impacto significativo na exploração e
valorização da biodiversidade microbiana brasileira, mitigação de problemas ambientais e redução de
custos na produção de lipase.
Palavras-chaves: Lipases microbianas; resíduos agroindustriais; DCCR.
Abstract
Several economical and efficient approaches are being tested to increase the production of lipases from
microbial strains and their potential applications. This work aims to select agro-industrial residues as
inducers for lipase production from autochthonous Pseudomonas aeruginosa (TCMK 71) isolated from
Amazonian fruit and to optimize the culture medium using a central rotational composite design
(DCCR). Maize, crude glycerol, cottonseed oil, and biodiesel effluent were tested as inducers,
separately, at a concentration of 1%. Sterile culture media were inoculated with 2 mL of the cell
suspension (8.0 x 104 CFU/mL) and kept at 150 rpm, 30 °C for 48 hours. In the DCCR, four independent
variables were used, being the concentration of the inducer as carbon source (biodiesel effluent),
nitrogen source (yeast extract), temperature, and pH. The response variable used to select the best culture
medium was lipase activity (U/mL). It was obtained as optimized parameters, the use of 30 g/L of carbon
source, 1 g/L of nitrogen source, 30° C and pH= 7.0, reaching a production of 3.09 U/mL of enzymatic
activity. This work is expected to promote a significant impact on the exploration and valorization of
Brazilian microbial biodiversity, mitigation of environmental problems, and cost reduction in lipase
production.
Keywords: Microbial lipases; agro-industrial waste; DCCR
Introdução
Lipases (triacilglicerol acil hidrolase, E.C. 3.1.1.3) são enzimas que catalisam reações de
hidrólise em triglicerídeos convertendo-os em ácidos graxos e glicerol. Também podem catalisar, na
ausência de água, reações de esterificação, transesterificação, acidólise, sendo amplamente difundidas
e de grande importância nos setores industriais de alimentos (panificação, queijos, manteiga, chás);
têxteis (removedor de lubrificantes no tecido); detergentes (aditivos); farmacêuticos (octalactinas,
nonanolídeos); energia e cosméticos. (BALDO et al., 2020).
Lipases microbianas são enzimas amplamente utilizadas no setor alimentício devido sua
estabilidade em solventes orgânicos, capacidade funcional em uma vasta faixa de temperaturas,
capacidade funcional em diferentes faixas de pH e por serem quimio, régio e enantio-seletivas
(GEOFFRY & ACHUR, 2018; SÁ et al., 2017). As lipases microbianas podem ser utilizadas como
aditivos em alimentos para modificar e realçar as propriedades organolépticas, em detergentes para
hidrolisar gorduras, no tratamento de efluentes oleosos, e ainda, nas indústrias farmacêuticas, de
cosméticos, agroquímicas e oleoquímicas, por isso é necessária em grande quantidade (METHA et al.,
2021).
As bactérias são potenciais candidatas à produção de lipase, pois são microrganismos
encontrados em diferentes habitas, sendo assim promissores para identificação de novas fontes de lipases
que possam favorecer novas propriedades catalíticas (SALIHU et al., 2016; OLIVEIRA et al., 2014).
Os principais gêneros de bactérias produtoras de lipases são Bacillus, Pseudomonas, Burkholderia e
Staphylococcus (LIU & KOKARE, 2017).
Os custos de produção são um grande obstáculo para a aplicação industrial de lipases. Uma
alternativa para diminuir estes custos seria a utilização de resíduos ou subprodutos industriais como
fonte alternativa de nutrientes para o crescimento microbiano e produção de enzimas. Além disso, a
utilização dos resíduos agroindustriais pode minimizar os problemas ambientais relacionados ao seu
descarte (BALDO et al., 2020). Resíduos agroindustriais como a milhocina, que é um subproduto de
beneficiamento de milho, também chamado de “corn steep liquor”, glicerol bruto, efluente do biodiesel
e óleo de algodão são substratos ricos em lipídio que podem ser utilizados como alternativa de indutores
para a produção de lipase microbiana, tornando-se subprodutos com valor agregado e em substituição
de substratos comumente estudados na literatura como azeite de oliva (BALDO et al., 2020); óleo de
mostarda e torta óleo de canola (REHMAN et al., 2019); óleo de palma (SILVEIRA et al., 2016); óleo
de soja (PRABANINGTYAS et al., 2018).
Para que o microrganismo aumente a produção de lipase, é necessário então, que seja fornecido
a eles condições ótimas de cultivo para seu desenvolvimento, desde condições físicas (aeração, agitação,
temperatura, pH), até as condições nutricionais (fonte de carbono, fonte de nitrogênio)
(VITTALADEVARAM, 2017). Para se fornecer as melhores condições aos microrganismos, visando o
aumento no rendimento enzimático, o uso de estratégias estatísticas se mostra como uma eficiente
ferramenta que conseguira prever as melhores condições, a partir de experimentos iniciais, para o
aumento na resposta analisada.
A partir do exposto acima, os objetivos desse trabalho são estudar a produção de lipase por
bactéria autóctone selvagem isolada do fruto amazônico tucumã-do-Brasil (Astrocaryum vulgare Mart)
usando resíduo agroindustrial como indutor e otimização do meio de cultivo.

Material e Métodos
Microrganismo e preparo do Inóculo

A linhagem de bactéria P. aeruginosa (TCMK71) foi isolada do fruto amazônico Tucumã-do-

Brasil (Astrocaryum vulgare Mart), em fermentação espontânea (LIMA, 2021). A bactéria está sendo
preservada na coleção de cultura do Laboratório de Microbiologia de Alimentos da Universidade
Federal do Tocantins - UFT, em criotubos contendo meio Luria-Bertani Broth (LB) [(g/L): triptona, 10;
extrato de levedura, 5; cloreto de sódio, 5], e glicerol a 40%, na proporção de 1:1 e permanecem a -80
ºC até o momento da reativação. A bactéria foi reativada em ágar LB e incubada a 30° C por 48 h, após
esse período, uma colônia isolada foi inoculada diretamente em 10 mL de caldo LB e mantida a 150
rpm, 30 °C por 24 horas. A técnica de microgotas foi utilizada para mensurar a população celular total
do cultivo (DA SILVA,1996).

Seleção de indutores para produção de lipase: milhocina, glicerol bruto, óleo de algodão e efluente de
biodiesel

A milhocina e o azeite de oliva extravirgem da marca Gallo foram adquiridos no comércio local
da cidade de Palmas /TO. O óleo de algodão era oriundo da empresa QuimisulSC, localizada em
Joinville/SC. O efluente do biodiesel e glicerol bruto foram doados pela Granol Indústria Comércio e
Exportação S/A, localizada em Porto Nacional/TO, e consistem em subprodutos da produção de
biodiesel.
A seleção de indutor foi realizada em frascos Erlenmeyers (125 mL) contendo 18 mL de meio
de cultivo adaptado de Rapp e Backaus (1992), composto por (g/L): sulfato de amônio, 2; fosfato de
potássio, 1,5; fosfato de sódio, 3,5; sulfato de magnésio, 0,2; extrato de levedura, 1. O pH foi ajustado
a 7,0 com solução de NaOH (2 M). Foram testados 4 tipos diferentes de fonte de carbono,
separadamente, em concentração de 1%: milhocina, glicerol bruto, óleo de algodão, efluente do
biodiesel, o azeite de oliva foi utilizado como controle. Os meios foram esterilizados em autoclave por
20 minutos, a 121°C e inoculados com 2 mL da suspensão de células (8,0 x 104 UFC/ml) e mantidos a
150 rpm, 30 °C por 48 horas. O experimento foi realizado com triplicata. O extrato enzimático foi obtido
após o cultivo e o sobrenadante foi utilizado para quantificar a atividade enzimática da lipase.
Os dados foram submetidos a análise de variância (ANOVA) e teste de médias através do teste
de Tukey a 5% (p<0,05)

Determinação da atividade de lipase

A atividade da lipase foi determinada segundo descrito por Almeida et al. (2018), com o uso do
ρ-nitrofenil palmitato (ρNPP) a 0,5mM (tampão Mcllvaine, pH 7,0 contendo 0,5% de Triton X-100, 40
°C ± 2 °C). A liberação de p-nitrofenol, indica a hidrolise do p-NPP pela ação da enzima lipase. Uma
unidade de enzima (U) foi definida como a quantidade de enzima que libera 1 μmol de p-nitrofenol por
minuto.

Otimização do meio de cultura

Foi utilizado um Delineamento Composto Central Rotacional (DCCR) para otimizar o meio de
cultivo segundo metodologia descrita por Rodrigues e Iemma (2014). Foram utilizadas quatro variáveis
independentes (concentração do indutor efluente do biodiesel como fonte de carbono previamente
selecionado, extrato de levedura como fonte de nitrogênio, temperatura e pH. A variável resposta
utilizada para a seleção do melhor meio de cultivo foi a atividade de lipase (U/mL). O DCCR foi
realizado com 27 ensaios, sendo três destes no ponto central a um nível de significância de 5%. Os
valores reais e codificados estão descritos na tabela 1.

Tabela 1. Variáveis selecionadas e seus níveis atribuídos pelos DCCR

Variáveis Independentes Código -2 -1 0 1 2
Fonte de Carbono (g/L) X1 6 12 18 24 30
Fonte de Nitrogênio (g/L) X2 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0
Temperatura (°C) X3 20 25 30 35 40
pH X4 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5
Fonte: Próprio Autor
 Cada experimento foi realizado com duas repetições. As análises estatísticas dos ensaios foram
realizadas no programa computacional STATISTICA (versão 10), usando a ferramenta de
desejabilidade matemática, a análise de variância (ANOVA) foi utilizada para estimar os parâmetros
estatísticos e avaliar se o modelo matemático gerado foi capaz de predizer os valores experimentais de
forma adequada.
Validação

Foi realizado um ensaio com três repetições no ponto ótimo descrito pelo modelo matemático
proposto pelo DCCR, para reconhecer se o modelo foi capaz de prever a produção enzimática de lipase,
utilizando as variáveis nas condições otimizadas. O valor predito e os valores experimentais observados
foram confrontados para validação.
Resultados e Discussão

Lima (2021), avaliou a produção de lipase por P. aeruginosa (TCMK 71) em cultivo submerso
pH 7,0, utilizando azeite de oliva como fonte de carbono, mantido a 150 rpm, 30 °C por 48 horas.
Obtendo atividade enzimática de 4,33 U/mL. Comparando os resultados obtidos com o azeite de oliva
(controle) observou-se que a P. aeruginosa (TCMK 71) apresentou maior produção de lipase bruta em
meio contendo efluente do biodiesel (2,46 ± 0,01 U/mL) e óleo de algodão (1,98 ± 0,03 U/mL), enquanto
a menor produção de lipase foi encontrada quando se utilizou a milhocina (0,29 ± 0,02 U/mL) (Tabela
2).

Tabela 2. Produção de lipase por P. Aeruginosa (TCMK 71) utilizando diferentes fontes de carbono
Fonte de Carbono Atividade enzimática (U/mL)
Azeite de oliva 4,07 a ± 0,01
Efluente do biodiesel 2,46 b ± 0,08
Óleo de algodão 1,98 b ± 0,03
Glicerol bruto 0,94 c ± 0,11
Milhocina 0,29 d ± 0,02

Fonte: Próprio Autor. Valores da atividade enzimática foram apresentados em média e ± desvio padrão:
triplicata/amostra. Foi aplicado o Teste de Tukey ao nível de 95 % de confiança. As médias seguidas pela mesma
letra na coluna (minúscula) não diferem estatisticamente entre si.

Para a atividade enzimática num intervalo de 95% de confiança, os cultivos realizados com o
efluente do biodiesel e óleo de algodão não apresentaram diferenças significativas. Já as outras fontes
de carbono testadas, apresentaram diferenças estatísticas entre si. Ao analisar diversas fontes de carbono
(óleo de soja, rícino, mostarda e algodão) como indutores em cultivo submerso para produção de lipase
por Pseudomonas spp., Tembhurkar et al. (2012) constataram que a maior produção foi observada com
óleo de mostarda (2,76 U/mL), seguida de óleo de algodão (1,23 U/mL).
Segundo Awadallak (2018), o efluente do biodiesel possui 4,18x105 mg de O2/L de demanda
química de oxigênio (DQO); 4,43x105 mg de O2/L de demanda bioquímica de oxigênio (DBO); 87,5
mg/L sólidos totais (ST); 2.678 mg/L óleos e graxas (O&G) e um pH de 6,45. Rocha (2010) realizou um
pré-tratamento biológico da água residuária de lavagem do biodiesel por microrganismo Klebsilla
oxytoca produtor de lipase. A linhagem dessa bactéria foi cultivada à 35 °C, 48 h e 180 rpm num agitador
rotativo. A autora verificou uma redução de 60 % de O&G após 48 h de tratamento com os
microrganismos e uma atividade lipolitica de 1,06 U/mL.
O efluente do biodiesel que é um resíduo gerado no processo de produção do biodiesel contém
diversos interferentes que ocasionariam um alto grau de poluição caso fossem descartados no meio
ambiente. Uma indústria com uma produção diária de 900 m3 de biodiesel gera 43,74 m3 de efluente e
custo mensal de tratamento R$ 8.804,86 (DA SILVA, 2021). Assim despertando a necessidade de uma
alternativa de destinação para o mesmo, buscando uma maior praticidade e diminuição dos gastos.
Diante disso, a fonte de carbono como indutor escolhida para prosseguir com o trabalho foi o
efluente do biodiesel que além de potencializar a produção pode tornar assim o produto final mais viável,
uma vez que produzir lipase com óleo de algodão em escala industrial como indutor sendo ele um
produto de alto valor, pode ocasionar um aumento do valor do produto final.
Na Tabela 3 estão apresentados os resultados do delineamento composto central rotacional
(DCCR). As atividades variaram de 0,27 a 3,09 U/mL, os pontos centrais para os valores do rendimento
apresentaram uma variação de 1,45 a 1,58 U/mL indicando uma boa repetibilidade do processo. Com
base nestes resultados, pode-se observar que a maior produção de atividade enzimática foi encontrada
no ensaio 18, no qual a lipase apresentou 3,09 U/mL.

Tabela 3. Atividade de lipase de P. Aeruginosa (TCMK 71) nos ensaios do DCCR 24 após 48h de
incubação.

Ensaios Atividade enzimática (U/ml) Ensaios Atividade enzimática

(U/mL)

1 1,33 ± 0,03 15 0,81 ± 0,03

2 0,64 ± 0,14 16 1,34 ± 0,00

3 0,76 ± 0,08 17 1,14 ± 0,13

4 0,76 ± 0,01 18 3,09 ± 0,01

5 0,60 ± 0,08 19 2,11 ± 0,02

6 0,27 ± 0,12 20 0,83 ± 0,29

7 0,74 ± 0,00 21 0,47 ± 0,03

8 1,19 ± 0,05 22 0,60 ± 0,04

9 2,50 ± 0,04 23 0,80 ± 0,21

10 1,61 ± 0,07 24 0,58 ± 1,02

11 1,55 ± 0,11 25C 1,58 ± 0,03

12 1,68 ± 0,13 26C 1,45 ± 0,03

13 1,07 ± 0,04 27C 1,47 ± 0,02

14 0,65 ± 0,03

Fonte: Próprio Autor. Nota: C: experimentos conduzidos no ponto central do modelo. Valores da atividade
enzimática foram apresentados em média e ± desvio padrão: duplicata/amostra.

Pelo nível de significância de 5% (valor de p < 0,05), observa-se que a fonte de carbono (X1)
teve um efeito significativo positivo sobre a produção de lipase, ou seja, o aumento dessa variável
acarreta aumento no rendimento de lipase. A fonte de nitrogênio (X2), temperatura (X3) e pH (X4)
tiveram influência significativa, porém com efeito negativo, indicando que o seu aumento no meio
provoca diminuição na produção de lipase. A interação X1 e X2 também apresentou um efeito
significativo negativo sobre a produção de lipase, indicando que a interação entres eles têm influência
no meio para produção da enzima. As interações X2 e X3, X2 e X4, X3 e X4 tiveram um efeito significativo
positivo sobre a produção de lipase.
Pela análise de variância (ANAVA), que está expressa na Tabela 4. O coeficiente de
determinação para este modelo foi de R² = 97,39% e o Rajustado = 94,35%. Com isso, o delineamento
proposto indica que 97,39% da variabilidade na resposta pode ser explicada pelo modelo matemático
utilizado.

Tabela 4. Análise de variância (ANAVA) pelo delineamento DCCR (p≤0,05).

Fonte de Variação Soma dos Graus de Quadrado Fcalculado Ftabelado
quadrados liberdade médio
Regressão 10,809 14 0,772 32,16 2,53
Resíduos 0,289 12 0,024
Erro Puro 0,290 12
Total 11,098 26
Fonte: Próprio Autor. FTAB regressão/resíduo (14:12:0,05): 2,53. R²:97,39 % Rajust: 94,35%.

O Fcalculado regressão/resíduos foi de 32,16, sendo superior ao Ftabelado 2,53. A partir da ANAVA
é observado que o modelo se aplica, ou seja, não há falta de ajuste num intervalo de confiança de 95%.
A falta de ajuste não significativa sugeriu que as respostas experimentais obtidas se encaixavam
suficientemente com o modelo. A produção de lipase é maximizada utilizando-se 30 g/L de fonte de
carbono, 1g/L de fonte de nitrogênio, temperatura 30 °C e pH 7,0, obtendo nestas condições 3,09 U/mL.
O efeito da composição do meio, temperatura, pH, umidade conteúdo, concentração de inóculo e
porosidade do substrato são de importância essencial para o desenvolvimento de bioprocessos. De forma
geral, o aumento da produtividade está relacionado à otimização do meio (RIGO et al., 2009).
De acordo com Huda et. al (2014), a produção de lipase por Pseudomonas putida 922 foi
otimizada testando diferentes fontes de nitrogênio e carbono, o maior valor de produção de lipase foi
obtido com extrato de levedura e torta de oleo de mostarda ( 48 U/mL), após 48 horas a 40°C e pH 10.
As lipases são consideradas enzimas induzíveis (THAKUR, 2012), e os óleos e gorduras são bons
indutores na elevação dos índices de produtividade de enzimas lipolíticas (Rigo, 2009). Por isso, com o
aumento na concentração do efluente houve também um aumento na disponibilidade de substrato
lipídico presente no meio, o que induziu uma maior produção de lipase pela bactéria, justificando os
resultados obtidos.
Normalmente, as lipases bacterianas de Pseudomonas apresentam pH ótimo neutro ou alcalino,
e temperatura ótima na faixa de 30-60 °C. Por exemplo, as lipases de Pseudomonas
fluorescens MC50, Pseudomonas aeruginosa YS7 e Pseudomonas fluorescens AFT36 tem uma
temperatura ótima de 30-40, 30 e 35°C, respectivamente (LOU et. al, 2018).
O resultado experimental obtido foi de 3,57 ± 0,23 U/mL e o previsto pelo modelo foi de 3,09
± 0,31 U/mL. Ao se comparar os resultados experimentais com o resultado previsto pelo modelo, é
possível afirmar que este delineamento foi validado, e a existência de uma faixa ótima de produção para
as condições testadas mostrou um aumento de 15,53 % das triagens iniciais.

Conclusão
A integração de novas linhagens com resíduos agroindustriais adequados pode surgir como um
aspecto importante para melhorar a produção de lipases, uma vez que essas enzimas apresentam uma
ampla gama de aplicações industriais. Uma nova linhagem de Pseudomonas aeruginosa (TCMK 71)
autóctone produziu lipase utilizando efluente do biodiesel, mostrando-se uma alternativa aos indutores
já utilizados para a produção de lipases, por ser um resíduo industrial promissor e mais acessível. A
otimização do meio e condições de cultivo submerso de P. aeruginosa (TCMK 71) aumentou em
25,61% a produção de lipase em comparação com as condições originais.
 REFERÊNCIAS

ALMEIDA, A. F., TERRASAN, C. R. F., TERRONE, C. C., TAUK-TORNISIELO, S. M.,

CARMONA, E. C. Biochemical properties of free and immobilized Candida viswanathii lipase on octyl-
agarose support: Hydrolysis of triacylglycerol and soy lecithin. Process biochemistry, v. 65, p. 71-80,
2018.

AWADALLAK, Aline Danielly et al. Biorremediação da água de biodiesel utilizando lipase fúngica
de Penicillium sumatrense. 2018.

BALDO, Cristiani et al. Use of agro-industrial by-products for the production of lipase by a new strain
of Pseudomonas sp. Scientific seminar biol. health, p. 165-176, 2020.

DA SILVA, Carmem Cícera Maria; CARVALHO, Núbia Luiza Corrêa; FONSECA, Gustavo Graciano.
Industrias produtora de biodiesel: Destinação correta aos efluentes através de implantação de politicas
de produção mais limpa (P+ L). RECIMA21-Revista Científica Multidisciplinar-ISSN 2675-6218, v.
2, n. 4, p. e24265-e24265, 2021.

DA SILVA, R. Técnica de Microgota para contagem de células bacterianas viáveis em uma

suspensão, 1-7. Universidade Federal de Viςosa, Viςosa, Minas Gerais, Brazil, 1996.

GEOFFRY, K; ACHUR, R.; N. Screening and production of lipase from fungal organisms. Biocatalysis
and Agricultural Biotechnology, v. 14, p. 241- 253, 2018.

HUDA, F. et al. Produção e caracterização parcial de lipase de Pseudomonas

putida. Fermentar. Technol , v. 4, p. 1-7, 2014.

LIU, X., & KOKARE, C. (2017). Microbial enzymes of use in industry. In Biotechnology of microbial
enzymes (pp. 267-298). Academic Press.

LOU, Lan-Lan et al. Lipase imobilizada covalentemente em um polímero termorresponsivo com uma
temperatura de solução crítica superior como um catalisador assimétrico eficiente e reciclável em meio
aquoso. ChemCatChem , v. 10, n. 5, pág. 1166-1172, 2018.

METHA, A.; Guleria, S.; Sharma, R.; Gupta, R. (2021). The lipases and their applications with emphasis
on food industry. Microbial Biotechnology in Food and Health, https://doi.org/10.1016/B978-0-12-
819813-1.00006-2.

OLLIVEIRA, A. C. D., Fernandes, M. L., & Mariano, A. B. (2014). Production and characterization of
an extracellular lipase from Candida guilliermondii. Brazilian Journal of Microbiology, 45(4), 1503-
1511.

PRABANINGTYAS, R. K. et al. Production of immobilized extracellular lipase from Aspergillus niger

by solid state fermentation method using palm kernel cake, soybean meal, and coir pith as the substrate.
Energy Procedia, v. 153, p. 242-247, Oct. 2018. http://dx.doi.org/10.1016/j.egypro.2018.10.010.

RAHMAN, W. U., FATIMA, A., ANWER, A. H., ATHAR, M., KHAN, M. Z., KHAN, N. A., &
HALDER, G. (2019). Biodiesel synthesis from eucalyptus oil by utilizing waste egg shell derived
calcium based metal oxide catalyst. Process Safety and Environmental Protection, 122, 313–319

RAPP, P.; BACKHAUS, S.; Formation of cellular lipases by filamentous fungi, yeasts, and bactéria.
Enzyme and Microbial Technology. v. 14, p. 938-943, 1992.
RODRIGUES, M. I.; IEMMA, A. F. Planejamento de experimentos e otimização de processos.
Campinas: Casa do Pão Editora, 2014.

SÁ, A. G. A.; MENESES, A. C.; ARAÚJO, P. H. H.; OLIVEIRA, D. A review on enzymatic synthesis
of aromatic esters used as flavor ingredients for food, cosmetics and pharmaceuticals industries. Trends
in Food Science & Technology, v. 69, p. 95-105, 2017.

SALIHU, A., Bala, M., & Alam, M. Z. (2016). Lipase production by Aspergillus niger using sheanut
cake: An optimization study. Journal of Taibah University for Science, 10(6), 850- 859.

SILVEIRA, Erick A.; TARDIOLI, Paulo W.; FARINAS, Cristiane S. Valorização de resíduos
industriais de óleo de palma como matéria-prima para produção de lipase. Bioquímica Aplicada e
Biotecnologia , v. 179, n. 4, pág. 558-571, 2016.

THAKUR, S. 2012. Lipases, its sources, properties and applications: a review. Int J Sci Eng Res,
3(7), 1-29.

TEMBHURKAR, VR; KULKARNI, MB; PESHWE, SA Otimização da Produção de Lipase por

Pseudomonas spp. em processo descontínuo submerso em cultura de frasco de agitação. Science
Research Reporter , v. 2, n. 1, pág. 46-50, 2012.

VITTALADEVARAM, Viswanath. Produção fermentativa de enzimas microbianas e suas aplicações:

situação atual e perspectivas futuras. Journal of Applied Biology and Biotechnology , v. 5, n. 4,
pág. 0-9, 2017.