MAYKON CÉSAR GONÇALVES DE ANDRADE

CARACTERÍSTICAS E APLICAÇÕES INDUSTRIAIS DAS ENZIMAS

ALCALASE 2.4L E FAVOURZYME 1000L
Londrina

2020
 MAYKON CÉSAR GONÇALVES DE ANDRADE

CARACTERÍSTICAS E APLICAÇÕES INDUSTRIAIS DAS ENZIMAS

ALCALASE 2.4L E FAVOURZYME 1000L.

Monografia apresentada ao curso de

Especialização em Biotecnologia da Universidade
Estadual de Londrina, como requisito parcial à obtenção
do título de Especialista em Biotecnologia do
Departamento de Bioquímica e Biotecnologia da
Universidade Estadual de Londrina.

Orientadora: Profa. Dra. Fabiana Guillen Moreira

Gasparin
Londrina
2020
 MAYKON CÉSAR GONÇALVES DE ANDRADE

CARACTERÍSTICAS E APLICAÇÕES INDUSTRIAIS DAS ENZIMAS

ALCALASE 2.4L E FAVOURZYME 1000L.

Monografia apresentada ao programa de Pós-Graduação em Biotecnologia da

Universidade Estadual de Londrina como requisito parcial à obtenção do título de
Especialização em Biotecnologia.

BANCA EXAMINADORA

________________________
Profa. Dra. Fabiana Guillen Moreira Gasparin
UEL – Londrina – PR

________________________
?
UEL – Londrina – PR

________________________
?
UEL-Londrina-PR

Londrina, 18 de Fevereiro de 2020.

 AGRADECIMENTOS

Primeiramente a Deus pela graça que ele tem nos dado de possibilitar a
conclusão de mais essa etapa na minha formação profissional.

A minha orientadora Fabiana Gasparin, por toda a compreensão, por toda a

ajuda fornecida e que sem essa ajuda não teria sido possível a conclusão dessa
etapa.

Aos docentes da especialização que sempre fizeram das aulas algo muito
proveitoso e leve.

A Universidade Estadual de Londrina , pela confiança e oportunidade.

Aos colegas de sala, pela ajuda, companherismo e amizade durante a

especialização.

Aos meus pais e familiares que sempre me apoiaram, me incentivaram e

guiaram-me para que alcançasse mais esta conquista em minha vida.
 6

ANDRADE, MAYKON CÉSAR GONÇALVES DE. Xxxx. 2020. 111 f.

Dissertação (Especialização em Biotecnologia), Universidade Estadual de
Londrina, Londrina, 2020.

RESUMO
7

Palavra-chave : proteases, alimentos, industrias, Bacillus sp.

 8

ANDRADE, MAYKON CÉSAR GONÇALVES DE. Xxxx. 2020. 111 f.

Dissertação (Especialização em Biotecnologia), Universidade Estadual de
Londrina, Londrina, 2020.

ABSTRACT
9

Keyword: proteases, food, industrial, Bacillus sp

 10

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Separação e mecanismo de ação das enzimas(NOVOZYMES

A/S, 2016)...........................................................................................................19

Figura 2 - Mecanismo de hidrólise de um ácido

carboxílico(NOVOZYMES A/S, 2016)................................................................20
 11

LISTA DE QUADROS

Quadro 1- pH ótimo de algumas proteases microbianas. 20

Quadro 2: - Temperatura ótima de algumas proteases microbiológicas.

22

Quadro 3: Inibidores de proteases de acordo com as classes de

proteases 23

Quadro 4: Inibidores de proteases de origem microbiológica24

Quadro 5: – Constante de Michaelis-Menten (Km) e Velocidade máxima

(Vmax) de algumas proteases microbiológicas 26

Quadro 6: Microrganismos proteolíticos 30

 12

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Valores de temperaturas ideais para produção máxima de

proteases por microrganismos. 33

Tabela 2: Fontes de proteases para cada seguimento alimentício. 35

13

LISTA DE ABREVIAÇÕES E SIGLAS

Asp/D Ácido Aspártico

Cys/C Cisteína

E.C Enzyme Commission of the

EDTA Ácido Etileno Diaminotetracético

EGTA Ácido Etileno Glicol Tetra Acético

IUBMB International Union of Biochemistry and Molecular Biology

OP Ortofenantrolina

pI Ponto Isoelétrico

pH Potencial Hidrogeniônico

Ser/S Serina

Zn+2 Zinco
14

Sumário
1 INTRODUÇÃO......................................................................................14

2 OBJETIVOS..........................................................................................15

2.1 Objetivo Geral.................................................................................15

2.3 Objetivos Específicos.....................................................................15

3 METODOLOGIA...................................................................................17

4 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA.................................................................18

4.1 CLASSIFICAÇÃO DAS ENZIMAS E MECANISMOS DE AÇÃO...18

4.1.1 Flavourzyme 1000L..................................................................20

5 CONCLUSÃO.......................................................................................20

6 REFERÊNCIAS.....................................................................................21
 15

1 INTRODUÇÃO

As enzimas têm grande importância na indústria de alimentos, elas têm

uma variedade de aplicações comerciais. Enzimas são capazes de manipular
com especificidade diversos tipos de biomoléculas, proteínas, carboidratos,
lipídios e ácido nucléico, e também pequenas moléculas tais como os
aminoácidos, açucares e vitaminas(OLSEN, 2008).

Os hidrolisados proteicos gerados a partir de reações enzimáticas são

muito versáteis em relação a aplicações industriais. Dentre as aplicações
temos as indústrias de detergentes, couro, e a indústria alimentícia entre
outras. Na indústria de alimentos estes hidrolisados são utilizados para
fornecer suporte nutricional para pacientes com diferentes necessidades, ou
então fornecer alimentos para crianças hipoalérgicas(MERZ et al., 2015a).

Para estes processos industriais as enzimas comumente utilizadas são

as peptidases que geralmente são derivadas de bactérias láticas, Aspergillus
sp., Bacillus sp. ou de plantas, a Flavourzyme é uma dessas peptidase e como
seu nome comercial sugere, é uma enzima que produz compostos que geram
sabor a partir de fontes de proteínas(MERZ et al., 2015b).

Outra enzima bastante empregada nos processos de hidrólise de

proteína é a enzima de nome comercial Alcalase 2.4L que é uma enzima
produzida pela fermentação submersa do microrganismo Bacillus
Licheniformis, sendo que essa enzima foi primariamente desenvolvida pela
Nordis para a indústria de detergente e hoje é comercializada por outras
empresas e para outros tipos de aplicações(SCHMIDT; SALAS-MELLADO,
2009).
16

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

 Realizar um estudo de revisão bibliográfica sobre as

enzimas flavourzyme e alcalase 2.4L.

2.3 Objetivos Específicos

 Classificar as enzimas e detalhar a ação das mesmas

 Detalhar os processos produtivos para obtenção das

enzimas flavourzymes e alcalase 2.4L e quais os
microrganismos responsáveis pela sua produção;

 Detalhar características das enzimas tais como pH de

estabilidade, temperatura de estabilidade e outras
características bioquímicas importantes dessas enzimas;

 Descrever em quais processos industriais são aplicadas

as enzimas flavourzymes e alcalase 2.4L e destacar a
importância delas na indústria de Biotecnologia;
 17

3 METODOLOGIA

O presente estudo compreende uma revisão bibliográfica, que aborda o

tema: " CARACTERÍSTICAS E APLICAÇÕES INDUSTRIAIS DAS ENZIMAS
ALCALASE 2.4L E FAVOURZYME 1000L.".

Para se alcançar os objetivos propostos foram realizadas pesquisas em

literatura científica específica, por meio de periódicos indexados, livros e
revistas virtuais.
 18

4 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

4.1 CLASSIFICAÇÃO DAS ENZIMAS E MECANISMOS DE AÇÃO

O conceito que temos hoje de enzimas sendo utilizadas como

biocatalizadores se iniciou em 1833 quando foi descoberta a conversão de
amido em açucares pela ação da distasse. Porém só tivemos o uso do
potencial das enzimas no século 20 quando cientistas se deram conta das
potenciais aplicações nos campos da tecnologia e da medicina. Os maiores
marcos no ramo das enzimas foram o desenvolvimento de métodos para
isolamento e purificação das enzimas, a descoberta que se tratam de proteínas
com atividade bioquímica, e a caracterização das mesmas utilizando técnicas
de difração por raio x(MARTÍNEZ CUESTA et al., 2015).

A aplicação da tecnologia de enzimas na indústria alimentícia é

considerada uma técnica comum para extrair e aumentar a performance na
recuperação de extratos. A enzima executa a hidrólise e ela não só favorece o
aprimoramento nutricional como também gera diversos benefícios para a saúde
humana.(HOA et al., 2014).

Para que obtenhamos estes hidrolisados proteicos precisamos de

enzimas específicas de acordo com os produtos que queremos obter, como
podemos ver na Figura 1 as enzimas geralmente são produzidas em escala
industrial a partir de microrganismos e então temos um processo de separação
subsequente com o objetivo de que a formulação aja em um substrato
específico (NOVOZYMES A/S, 2016).
 19

Figura 1 - Separação e mecanismo de ação das enzimas(NOVOZYMES A/S, 2016)

Os hidrolisados proteicos têm sido reconhecidos como ingredientes

funcionais por conta de constituírem como uma fonte de peptídeos
biologicamente ativos e tecno-funcionais. O método mais comum para a
produção de hidrolisados proteicos é com um reator enzimático de batelada.
Entretanto, este processo possui um alto custo pois exige uma grande
quantidade de enzimas, grande quantidade de energia, mão de obra e custo de
capital. Somado a isso os processos em bateladas possuem curto período de
operação e uma grande variabilidade na qualidade do produto.(EWERT et al.,
2019)

Além do uso direto das enzimas na produção de alimentos há casos de

uso das enzimas Alcalase 2.4L e Flavourzyme 1000 na produção de ração para
peixes, estes tipos de aplicações contribuem para melhor desenvolvimento dos
animais e com isso temos aumento da produtividade.(SAADAOUI et al., 2019).

Nos próximos tópicos irão ser abordadas as enzimas que tem por nome
comercial Alcalase 2.4L e Flavourzyme 1000L, ambas têm entre os
distribuidores a Novozymes.
 20

4.1.1 Alcalase 2.4L

A alcalase 2.4 é uma preparação enzimática que se constitui

basicamente de subtilisin A, uma enzima cujo nome se deriva do primeiro
microrganismo no qual pesquisadores a conseguiram isolar, o Bacillus subtilis.

A Subtilisin é uma enzima que é classificada como Serine

endopeptidases extracelulares e também está relacionada com as enzimas
isoladas a partir de espécies de Bacillus relacionadas. A primeira enzima deste
tipo foi a subtilisin Carlsberg do Bacillus Licheniformis que é exatamente a
Subtilisin A principal componente da Alcalase 2.4L(RAWLINGS; BARRETT,
2013)

As aplicações nas quais a Alcalase 2.4L é utilizada são nas reações de

hidrólise seletiva de amino ésteres e de ésteres seletivos, estas reações
realizam a quebra de uma grande cadeia peptídica formada por amino ésteres
possibilitando dessa forma a formação de peptídeos de baixo peso molecular e
reações de transesterificação(NOVOZYMES A/S, 2016).

Podemos ver na Figura 2 a forma como as proteases agem em uma

cadeia peptídica formando a exemplo da figura dois aminoácidos menores.

Figura 2 - Mecanismo de hidrólise de um ácido carboxílico(NOVOZYMES A/S, 2016).

21

5 CONCLUSÃO
 22

6 REFERÊNCIAS

EWERT, J.; CLAASSEN, W.; STRESSLER, T.; FISCHER, L. An

innovative two-step enzymatic membrane bioreactor approach for the
continuous production of antioxidative casein hydrolysates with reduced
bitterness. Biochemical Engineering Journal, [s. l.], v. 150, n. May, p.
107261, 2019. Disponível em: <https://doi.org/10.1016/j.bej.2019.107261>

HOA, N. T.; HUONG, T. T. X.; MINH, N. P.; DAO, D. T. Investigation of

Enzymatic Optimization by Flavourzyme and Celluclast for Soy Protein
Hydrolysate Powder. International Journal of Advances in Pharmacy,
Biology and Chemistry, [s. l.], v. 3, n. 3, p. 563–574, 2014.

MARTÍNEZ CUESTA, S.; RAHMAN, S. A.; FURNHAM, N.; THORNTON,

J. M. The Classification and Evolution of Enzyme Function. Biophysical
Journal, [s. l.], v. 109, n. 6, p. 1082–1086, 2015.

MERZ, M.; EISELE, T.; BERENDS, P.; APPEL, D.; RABE, S.; BLANK, I.;
STRESSLER, T.; FISCHER, L. Flavourzyme, an Enzyme Preparation with
Industrial Relevance: Automated Nine-Step Purification and Partial
Characterization of Eight Enzymes. Journal of Agricultural and Food
Chemistry, [s. l.], v. 63, n. 23, p. 5682–5693, 2015. a.

MERZ, M.; EWERT, J.; BAUR, C.; APPEL, D.; BLANK, I.; STRESSLER,
T.; FISCHER, L. Wheat gluten hydrolysis using isolated Flavourzyme
peptidases: Product inhibition and determination of synergistic effects using
response surface methodology. Journal of Molecular Catalysis B:
Enzymatic, [s. l.], v. 122, p. 218–226, 2015. b. Disponível em:
<http://dx.doi.org/10.1016/j.molcatb.2015.09.010>

NOVOZYMES A/S. Proteases for biocatalysis. Novoenzymes, [s. l.], p.

1–6, 2016. Disponível em: <https://www.google.com/search?
q=protease+for+biocatalase+novoenzymes&oq=protease+for+biocatalase+nov
oenzymes&aqs=chrome..69i57.12735j0j4&sourceid=chrome&ie=UTF-8#>
 23

OLSEN, H. S. Enzymes in Food Processing. [s.l.] : Academic Press,

2008. v. 9–12

RAWLINGS, N. D.; BARRETT, A. Handbook of Proteolytic Enzymes.

[s.l: s.n.].

SAADAOUI, H.; ESPEJO-CARPIO, F. J.; GUADIX, E. M.; AMAR, R.

Ben; PÉREZ-GÁLVEZ, R. Bi-objective optimization of tuna protein hydrolysis to
produce aquaculture feed ingredients. Food and Bioproducts Processing, [s.
l.], v. 115, p. 26–35, 2019. Disponível em:
<https://doi.org/10.1016/j.fbp.2019.03.001>

SCHMIDT, C. G.; SALAS-MELLADO, M. Influência da ação das enzimas

alcalase e flavourzyme no grau de hidrólise das proteínas de carne de frango.
Química Nova, [s. l.], v. 32, n. 5, p. 1144–1150, 2009. Disponível em:
<http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0100-
40422009000500012&lng=pt&nrm=iso&tlng=pt>