UNIVERSIDADE CIDADE DE SÃO PAULO – UNICID

CURSO DE BIOMEDICINA

DANIELLE OLIVEIRA ALBUQUERQUE

RELATÓRIO DE ESTÁGIO
CURRICULAR SUPERVISIONADO

São Paulo
2022
UNIVERSIDADE CIDADE DE SÃO PAULO – UNICID
CURSO DE BIOMEDICINA

DANIELLE OLIVEIRA ALBUQUERQUE

RELATÓRIO DE ESTÁGIO
CURRICULAR SUPERVISIONADO

Relatório final de estágio curricular

supervisionado realizado no
laboratório de imunopatologia no
Instituto Butantan, a ser enviado à
Coordenação do Curso de
Biomedicina, para aprovação e
obtenção do título de Bacharel em
Biomedicina e habilitação em
Biologia molecular.

São Paulo
2022
 DANIELLE OLIVEIRA ALBUQUERQUE

ESTÁGIO EM BIOLOGIA MOLECULAR

Coordenadora: Marisa Laporta Chudo

Curso: Biomedicina
Número de matrícula: 21171122
Período: Noturno
Empresa concedente: Instituto Butantan
Supervisores: Dr. Geraldo Santana Magalhães
Período: 05/04/2021 à 30/06/2022
Carga horária total do estágio: 1.440 horas
Modalidade: Biologia Molecular

APROVADO EM ____/____/____

São Paulo
2022
 RESUMO

Esse relatório tem como objetivo registrar um resumo de aprendizagem teórica e

práticas obtidas durante o período de estágio no laboratório de imunopatologia voltado
para a área de biologia molecular sob a supervisão do Dr. Geraldo Santana Magalhães.
Incluindo metodologias, rotinas, funcionamento geral do laboratório, automações,
equipamentos e técnicas utilizadas visando ética, boas práticas laboratoriais e controle de
qualidade, contribuindo de forma positiva para adquirir experiências, vivência e
aprendizados que também foram abordados ao longo da graduação. O estágio foi
realizado no período de 05/04/2021 à 30/06/2022, no Laboratório de Imunopatologia –
Instituto Butantan – São Paulo - Brasil, para a obtenção do título de Bacharel no Curso
de Biomedicina da Universidade Cidade de São Paulo.
 LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Vetor de levedura pPCIZα, onde a sequência da hemocianina foi adicionada

entre os sítios de restrição EcoR I e Xba I. ..................................................................... 39

Figura 2:Gel de agarose 1% corado com gelRed® (Biotium) contento o vetor pPCIZα e
o produto de PCR da hemocianina. M – Marcador de DNA FastRuler®; 1 – pPCIZα
digerido com as enzimas de restrição EcoRI e XbaI; 2- Inserto PCR hemocianina digerido
com as enzimas de restrição EcoR I e Xba I. ................................................................. 40

Figura 3: Screening das colônias de leveduras com o vetor pPCIZα + inserto hemocianina.
Corado em gel de agarose 1% corado com gelRed® (Biotium). M- Marcador de DNA
FastRuler®. Os clones 5, 9 e 10 foram escolhidos para análise de restrição. ................ 41

Figura 4: Gel de agarose 1% corado com gelRed® (Biotium) contendo análise de restrição
dos vetores pPCIZα + hemocianina com as enzimas EcoRI e XbaI. M- Marcador de DNA
FastRuler®. Os clones 5, 9 e 10 foram escolhidos para análise de restrição. ................ 41

Figura 5: Análise do vetor pPCIZα com o inserto da hemocianina linearizado com a

enzima BstX I Gel de agarose 1% corado com gelRed® (Biotium). M- Marcador de DNA
FastRuler®; 1- vetor pPCIZα + hemocianina digerido com BstX I. .............................. 42

Figura 6: Colônias de leveduras Pichia pastoris GS115 em meio yeps com zeocina (100
mg/ml), transformadas com o vetor pPCIZα contendo o gene da hemocianina. As colônias
que foram escolhidas para fazer a seleção MutS e Mut+ estão circuladas. .................... 42

Figura 7: Triagem de fenótipo de P. pastoris GS115. (A) placa com meio MDH; (B) placa
com meio MMH. ............................................................................................................ 43

Figura 8: Corrida do sobrendantes das colônias transformadas com o vetor pPCIZα

contendo a hemocianina e o vetor vazio em gel de SDS-PAGE 12% corado com comassie
blue, M: marcador de massa molecular. As proteínas foram analisadas por SDS – PAGE
e western blot em membrana de nitrocelulose, foi incubada com anticorpo monoclonal
anti-6x His-Tag. Os números a esquerda correspondem à posição dos marcadores de
massa molecular (M); (1) Sobrenadante pPCIZα vazio; (2) Sobrenadante clone 2
hemocianina; (3) Sobrenadante clone 8 hemocianina. ................................................... 47

Figura 9: (A) SDS-PAGE 12 % corado com comassie blue mostrando pellet das
expressões dos clones contendo a toxina hemocianina e o vetor vazio. (M) Marcador de
massa molecular; (1) pPCIZα vazio; (2) Clone 1 da hemocianina; (3) Clone 2 da
hemocianina; (4) Clone 8 da hemocianina. (B) Western blot do gel onde as proteínas
foram separadas por SDS-PAGE, transferidas para membrana de nitrocelulose e
incubadas com anticorpo monoclonal anti-6x-HisTag. Os números a esquerda
correspondem à posição dos marcadores de massa molecular (M); (1) pPCIZα vazio; (2)
Clone 1 da hemocianina; (3) Clone 2 da hemocianina; (4) Clone 8 da hemocianina. ... 48

Figura 10: Análise de SDS-PAGE 12% corado em comassie blue mostrando a purificação
da toxina hemocianina. M: Marcador de peso molecular (kDa); 1: pCIZα vazio; 2:
Sobrenadante do sonicado clone Hemocianina 2; 3: Pós-binding clone Hemocianina 2; 4:
1ª lavagem clone Hemocianina 2; 5: Eluído clone hemocianina 2; 6: Sobrenadante do
sonicado clone Hemocianina 8; 7: Pós-binding clone Hemocianina 8; 8: 1ª lavagem clone
Hemocianina 8; 9: Eluído clone hemocianina 8. ............................................................ 49
 SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 35
2. OBJETIVO ................................................................................................................. 36
3. MATERIAIS E MÉTODOS...................................................................................... 36
3.1 Clonagem do vetor pPCIZα com o gene da hemocianina ........................................ 36
3.2 Transformação de P.pastoris .................................................................................... 37
3.3 Determinação de fenótipo Mut ................................................................................. 37
3.4 Expressão da toxina hemocianina............................................................................. 37
3.5 Análise por eletroforese em gel de SDS – Poliacrilamida........................................ 38
3.6 Western Blot ............................................................................................................. 38
3.7 Purificação da hemocianina ...................................................................................... 39
4. RESULTADO E DISCUSSÃO .................................................................................. 39
5. CONCLUSÃO ............................................................................................................ 45
6. REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 46
 35

1. INTRODUÇÃO

Atualmente, sistemas de expressão biológica são utilizados para a produção de

proteínas heterólogas e nas áreas industriais e médicas (Gomes, Byregowda,
Veeregowda, & Balamurugan). Já existem sistemas de expressão que incluem: bactérias,
leveduras, bolores, mamíferos, plantas e insetos (Torres e Moraes, 2002), sendo que o
sistema mais utilizado para expressão é a Escherichia coli (Gomes, et al., 2016). As
leveduras são microrganismos unicelulares, pertencentes à classe Ascomycetes ou
Basidiomycetes (Ingold e Hutchínson, 1696), que possuem grande potencial comercial
como sistema de expressão de proteínas heterólogas, pois compartilham características
bioquímicas com os eucariotos superiores, apresentam perfil fermentativo que favorece o
processo em alta escala, além de ter características moleculares e genéticas (Cregg,
Cereghino et al., 2000). Além disso, as leveduras possuem vantagens significativas que
incluem o dobramento adequado das proteínas, modificações pós-traducionais e
glicosilação de protéinas recombinantes nos locais corretos, o que é importante para a
estabilidade da proteína (Khan, 2013). As células de leveduras são também de fácil
manipulação genética, tem expressão secretora, velocidade no crescimento e modificação
pós-traducional (Daly & Hearn, 2005). A levedura Pichia pastoris é um microrganismo
metilotrófico modificado. Leveduras metilotróficas modificadas são capazes de utilizar o
metanol como única fonte de carbono e energia (Cereghino, Cereghino, IIgen & Cregg,
2002). A levedura P.pastoris possui várias cepas onde é possível realizar expressões. No
caso deste experimento a cepa escolhida foi GS115, que é uma das cepas mais popular
utilizadas como sistema de expressão nas indústrias e nos campos da medicina (Julien,
2006). Ela possui dois genes codificadores (AOX1 e AOX2), da enzima álcool oxidase
(AOX). O gene AOX1 é o responsável pela maior parte da atividade de álcool oxidase na
célula, a presença do metanol é essencial para induzir os seus elevados níveis, assim sendo
possível expressar o gene que é controlado em nível transcricional. O gene AXO2 é
expresso em níveis baixos (Cereghino e Cregg, 2000). A Pichia pastoris pode apresentar
três fenótipos, de acordo com a sua capacidade de metabolizar o metanol. No fenótipo
Mut+ (Methanol Utilization Positive), esse depende dos genes AOX1 e AOX2 que
crescem em níveis superiores e similares ao selvagem. O fenótipo MutS (Methanol
Utilization Slow) o metabolismo do metanol depende do gene AOX2, pois o AOX1 foi
reprimido, com isso o crescimento é mais lento. Por último, o fenótipo Mut- (Methanol
 36

Utilization Negative) não possui nenhum dos genes, por esse motivo não é possível
metabolizar metanol (Câmara et al., 2017). O vetor de escolhido para expressão foi o
pPCIZα, pois ele permite a expressão em alto nível do gene de interesse em Pichia sob o
promotor AOX1 que utiliza o metanol como fonte de indução. Além disso esse vetor
possui forte resistência ao antibiótico zeocina, permitindo a seleção as melhores colônias
de P.pastoris (Vassileva et al. 2001).

2. OBJETIVO

Expressar uma subunidade da hemocianina isolada de Cryptops iheringi e avaliar

sua atividade funcional in vitro.

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Clonagem do vetor pPCIZα com o gene da hemocianina

A sequência codificada da hemocianina foi amplificada a partir do plasmídeo pET

– 24b (+), usando o primer forward (5’ AGCACTGAATTCGAC
AAGTGCCCGAAAACC 3’) e primer reverse (5’ GGACCATGTAGAGCGCTG
CTTTTCTTCACATTGC 3’). O PCR foi realizado na Thermal cycler T100 Bio – Rad,
com as seguintes condições: desnaturação inicial da dupla fita a 95º C por 2 min, seguido
por 35 ciclos, (cada um a 94ºC por 30 s, a 55ºC por 30 s, a 72 por 60 s) e uma extensão
final a 72ºC por 5 min. O amplificado da hemocianina foi purificado com o kit Promega
Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System e posteriormente clivado com as enzimas
Xba I e EcoR I, assim como o vetor pPCIZα. Vetor e inserto foram então ligados e
transformados em bactéria E.coli Top 10 (Thermofisher). Posteriormente colônias foram
analisadas por PCR utilizando os primers F (5’ CGATCATTGCCACTGTGGT 3’) e
reverse (5’ ACGGGTATCATCACGATGG 3'). Uma colônia positiva foi escolhida, o
plasmídeo isolado e submetido ao sequenciamento.
 37

3.2 Transformação de P.pastoris

A levedura P. pastoris GS115 foi transformada por eletroporação, brevemente,

em um microtubo de 1,5 ml foi adicionado 80 ul da P. pastoris GS115 e 5ug do vetor
pPCIZα linearizado com a enzima BstXI. Após 5 minutos no gelo, as leveduras foram
transferidas para uma cubeta de eletroporação de 2 mm. A tranformação foi realizada com
(Sonics Vibra CellTM). Os parâmetros foram modo procarioto, com 1.500 V e 5 ms.
Depois da eletroporação foi adicionado imediatamente 1 ml de sorbitol 1M, em seguida
incubadas de 1 – 2 h à 29ºC com agitação de 200 a 250 rpm. Posteriormente, 300 ul de
células transformadas foram plaqueadas em placas de Ágar YEPDS – zeocina 100 mg/ml
e incubadas à 29º C durante 3 – 4 dias.

3.3 Determinação de fenótipo Mut

Utilizando ponteiras estéreis, 10 colônias de leveduras transformadas com

resistência a zeocina foram adicionadas em placa de MDH (13,4 g/L de YNB, 4 x 10-5
% de biotina, 20 g/L de dextrose, 10 g/L de histidina 100X, 15 g/L de ágar), outras 10
foram adicionadas em placa de MMH (13,4 g/L de YNB, 4 x 10- 5 % de biotina, 10 mL/L
de metanol, 10 g/L de histidina 100X, 15 g/L de ágar). Após isso as placas foram
incubadas à 29º C por 2 – 3 dias.

3.4 Expressão da toxina hemocianina

Para expressão da hemocianina cepas de P.pastoris foram utilizadas seguindo o

EasySelectTM Pichia Expression Kit (Termofisher). Para tal, o vetor pPCIZα contendo a
hemocianina e o vetor pPCIZα vazio foram transformados em transformação por
eletroporação da cepa GS115 Mut+ de P.pastoris cultivadas em meio Buffered Glycerol
Complex Medium (BMGY – extrato de levedura 1%; peptona 2%; fosfato de potássio
100 mM; YNB 1,34%; biotina 4,10- 5%; glicerol 0,5%; pH 6,0) por aproximadamente
16-18h, em agitador orbital (150 rpm), a 30ºC. Após atingir a D.O600 nm 2 – 6 (3,9 do
clone 2 da hemocianina, 3 do clone 8 da hemocianina e 5 do vetor pPCIZα vazio), o
cultivo foi centrifugado a 2.000 x g, por 5 minutos. O pellet de células obtido foi suspenso
para uma D.O 600nm de 1, em meio Buffered Methanol Complex Medium (BMMY-
 38

extrato de levedura 1%; peptona 2%; fosfato de potássio 100 mM; YNB 1,34%; biotina
4,10- 5%; metanol 0,5%; pH 6,0) e mantido à 30ºC, sob agitação. Posteriormente, o
cultivo obtido foi induzido com metanol 0,5% a cada 24 horas e amostras de sobrenadante
e pellets foram coletadas. Após 96 horas, o cultivo foi centrifugado a 2,000 x g por 5
minutos e o sobrenadante separado do pellet, os dois foram armazenados à -20º C.

3.5 Análise por eletroforese em gel de SDS – Poliacrilamida

Os sobrenadantes obtidos a partir da expressão foram suspensos em tampão de

amostra 6x com Dithiothreitol (DTT). Já os pellets foram suspensos com tampão de célula
PBS e ressuspendidos com tampão de amostra 6x com Dithiothreitol (DTT), ambos foram
aquecidos a 100º C por 5 minutos e submetidos à eletroforese em gel de poliacrilamida
(SDS-PAGE) 12%, a 130 V por 3 horas. O gel obtido foi corado com Coomasie brilhante
blue R-250 – amresco®.

3.6 Western Blot

As bandas que obtiveram maior concentração da proteína hemocianina foram

submetidas a eletroforese em gel de poliacrilamida 12% e transferidas para membranas
de nitrocelulose (Trans-Blot® Turbo TM RTA), seguindo as instruções do fabricante.
Após a transferência, as membranas foram coradas com ponceau (Solution - Sigma). Para
remover o corante as membranas foram lavadas com TBS Tween (20 mM Tris, 150 mM
NaCl, 0,05% de Tween 20, pH 7,5) até a remoção completa. Em seguida a membrana foi
bloqueada com tampão de incubação (Tris/NaCl, pH 7,5, com 5% de molico) por 2 horas
a temperatura ambiente e depois lavadas com TBS Tween por 3x durante 15 minutos.
Depois as membranas foram incubadas overnight a 4º C com anticorpo monoclonal 6x
His-Tag com diluição de 1:1000 em tampão de incubação. Após isso as membranas foram
lavadas com TBS Tween por 3x durante 15 minutos e incubadas por 2 horas com
anticorpo anti-mouse marcado com peroxidase (Sigma Life Science, Merck Corporation,
Darmstadt, Alemanha) a 1:1000 a diluição em tampão de incubação, após isso as
membranas foram lavadas novamente com TBS Tween. A revelação foi realizada com 4-
cloro-1-naftol.
 39

3.7 Purificação da hemocianina

O pellet foi ressuspendido em 4 mL com tampão de ligação, sonicado no gelo por

1 minuto e colocado em pausa no gelo por 4 minutos, esse procedimento foi realizado 3x.
Após isso colocamos 1 mL de cada clone em um tubo de 1,5 mL com esferas de vidro 0,5
mm (BeadBugTM sílica glass beads) e ressuspendemos por 1 minuto. Após isso o
sobrendante foi colocado em um tubo de 1,5 ml e centrifugado por 5 minutos a 10.000 x
g. O sobrenadante foi colocado sob a resina de níquel sefarose já equilibrada e
centrifugada, o mesmo foi incubado por inversão por 40 minutos. Após isso realizamos a
lavagem centrifugando a 900 x g por 4 minutos, descartando o sobrenadante e
completando o volume para 10 mL com tampão de lavagem 50mM de imidazol,
invertendo por 10 minutos, esse procedimento foi realizado3x. A toxina foi eluída em
tampão de eluição 1M de imidazol, incubada por inversão por 40 minutos, centrifugada
à 900 x g por 4 minutos e em seguida o sobrenadante foi coletado e armazenado a 4ºC.

4. RESULTADO E DISCUSSÃO

A partir do vetor bacteriano pET – 24b (+) onde estava previamente clonadoa
hemocianina, nós realizarmos um PCR para extrair a sequência da hemocianina utilizando
um primer que continha as enzimas de restrição EcoR1 e Xba I. Posteriormente, após
amplificação e purificação, digerimos o produto de PCR e também o vetor pPCIZα com
as enzimas EcoRI e XbaI (Fig. 1 e 2).

Figura 1: Vetor de levedura pPCIZα, onde a sequência da hemocianina foi adicionada entre os sítios de
restrição EcoR I e Xba I.
 40

Figura 2:Gel de agarose 1% corado com gelRed® (Biotium) contento o vetor pPCIZα e o produto de PCR
da hemocianina. M – Marcador de DNA FastRuler®; 1 – pPCIZα digerido com as enzimas de restrição
EcoRI e XbaI; 2- Inserto PCR hemocianina digerido com as enzimas de restrição EcoR I e Xba I.

Em seguida o vetor e o inserto foram ligados com a enzima ligase e transformada

em bactérias top10 (Thermo Fisher). Essas bactérias foram posteriormente selecionadas
e analisadas por PCR para identificar o inserto da hemocianina (Fig. 3). Observamos que
a maioria das colônias amplificaram e 3 delas (4, 8 e 9) foram escolhidas para extrair o
plasmídeo e submeter a clivagem para verificar a liberação do inserto hemocianina
(Fig.4), onde observamos que em todos os escolhidos, houve liberação do inserto. O clone
10 foi então selecionado para sequenciamento que mostrou que a sequência da
hemocianina estava correta (dados não mostrados). Portanto utilizamos este vetor para
transformar as leveduras.
 41

Figura 3: Screening das colônias de leveduras com o vetor pPCIZα + inserto hemocianina. Corado em gel
de agarose 1% corado com gelRed® (Biotium). M- Marcador de DNA FastRuler®. Os clones 5, 9 e 10
foram escolhidos para análise de restrição.

Figura 4: Gel de agarose 1% corado com gelRed® (Biotium) contendo análise de restrição dos vetores
pPCIZα + hemocianina com as enzimas EcoRI e XbaI. M- Marcador de DNA FastRuler®. Os clones 5, 9
e 10 foram escolhidos para análise de restrição.

Para que o DNA tenha um aumento de eficácia maior para integração do genoma
da levedura foi necessário linearizar o vetor pPCIZα contendo o gene da hemocianina
com enzimas Sac I, Pme I e BstX I. Portanto nosso vetor foi linearizado com enzima BstX
I (Fig.5).
 42

Figura 5: Análise do vetor pPCIZα com o inserto da hemocianina linearizado com a enzima BstX I Gel de
agarose 1% corado com gelRed® (Biotium). M- Marcador de DNA FastRuler®; 1- vetor pPCIZα +
hemocianina digerido com BstX I.

O vetor foi purificado após linearização e utilizado para transformar leveduras P.

pastoris GS115 por eletroporação. Posteriormente, a levedura 5000 2000 850 400 100
transformada foi plaqueada em placas de ágar yepds + zeocina 100mg/ml, após 4 dias
visualizamos a presença de 10 colônias (Fig.6 a – b -- c).

Figura 6: Colônias de leveduras Pichia pastoris GS115 em meio yeps com zeocina (100 mg/ml),
transformadas com o vetor pPCIZα contendo o gene da hemocianina. As colônias que foram escolhidas
para fazer a seleção MutS e Mut+ estão circuladas.

As colônias foram então passadas para placas com meio MDH e MMH (Fig.7 a -
b) para serem analisadas se eram MutS ou Mut+. Os resultados indicaram que todas as
 43

colônias selecionadas eram Mut+, pois, tiveram crescimento semelhante em ambas as

placas.

Figura 7: Triagem de fenótipo de P. pastoris GS115. (A) placa com meio MDH; (B) placa com meio MMH.

Após concentrar as amostras positivas e negativas (vetor vazio) no concentrador

a vácuo (speed vac), essas foram analisadas por SDS-PAGE e western blot (Fig.1). Como
podemos observar na figura, não apareceram bandas no gel de SDS-PAGE e também não
houve reconhecimento de nenhuma banda no western blot, indicando que a proteína não
foi expressa, ou não foi exportada para o sobrenadante.

Figura 8: Corrida do sobrendantes das colônias transformadas com o vetor pPCIZα contendo a hemocianina
e o vetor vazio em gel de SDS-PAGE 12% corado com comassie blue, M: marcador de massa molecular.
As proteínas foram analisadas por SDS – PAGE e western blot em membrana de nitrocelulose, foi incubada
com anticorpo monoclonal anti-6x His-Tag. Os números a esquerda correspondem à posição dos
marcadores de massa molecular (M); (1) Sobrenadante pPCIZα vazio; (2) Sobrenadante clone 2
hemocianina; (3) Sobrenadante clone 8 hemocianina.
 44

Decorrente deste resultado, decidimos então analisar os pellets das leveduras. No

gel SDS-PAGE, foi possível observar duas bandas que não estavam presentes na levedura
transformada somente com o vetor vazio (fig.2), indicando que estas poderiam ser a
proteína recombinante de interesse, visto que o peso molecular esperado seria de 76 kDa,
mas devido a glicosilações estas bandas poderiam aparecer acima do tamanho esperado.
Após o western blot, observamos reconhecimento de bandas nos clones 2 e 8 no tamanho
supostamente esperado, correspondentes a hemocianina recombinante.

Figura 9: (A) SDS-PAGE 12 % corado com comassie blue mostrando pellet das expressões dos clones
contendo a toxina hemocianina e o vetor vazio. (M) Marcador de massa molecular; (1) pPCIZα vazio; (2)
Clone 1 da hemocianina; (3) Clone 2 da hemocianina; (4) Clone 8 da hemocianina. (B) Western blot do gel
onde as proteínas foram separadas por SDS-PAGE, transferidas para membrana de nitrocelulose e
incubadas com anticorpo monoclonal anti-6x-HisTag. Os números a esquerda correspondem à posição dos
marcadores de massa molecular (M); (1) pPCIZα vazio; (2) Clone 1 da hemocianina; (3) Clone 2 da
hemocianina; (4) Clone 8 da hemocianina.

Após a análise do Western blot, decidimos então realizar a purificação dos clones
2 e 8 da hemocianina. Para tanto, sonicamos e rompemos a parede da levedura com
esferas de vidros e o sobrenandante do lisado foi submetido a purificação por
cromatografia de afinidade utilizando resina de sefarose carregada de níquel. Contudo,
após a purificação e eluição não foi possível observar as mesmas bandas, ou seja, não
houve purificação da proteína (fig.3). Este procedimento foi repetido mais de 2 vezes, e
 45

não conseguimos purificar a hemocianina recombinante, o que nos leva a crer que existe
uma possibilidade de a cauda de histidina estar dobrada e não acessível para se ligar a
resina.

Figura 10: Análise de SDS-PAGE 12% corado em comassie blue mostrando a purificação da toxina
hemocianina. M: Marcador de peso molecular (kDa); 1: pCIZα vazio; 2: Sobrenadante do sonicado clone
Hemocianina 2; 3: Pós-binding clone Hemocianina 2; 4: 1ª lavagem clone Hemocianina 2; 5: Eluído clone
hemocianina 2; 6: Sobrenadante do sonicado clone Hemocianina 8; 7: Pós-binding clone Hemocianina 8;
8: 1ª lavagem clone Hemocianina 8; 9: Eluído clone hemocianina 8.

5. CONCLUSÃO

O sistema de expressão em P. pastoris é considerado uma das ferramentas mais

populares para produção de proteínas recombinantes que necessitam de modificações pós
traducionais em biologia molecular. Durante todo o período foi testado meios de
expressão onde observamos que a proteína foi obtida somente dentro da levedura,
indicando que o peptídeo sinal não foi efetivo para enviar a proteína para o meio da
cultura. Decorrente disto, lisamos a levedura e verificarmos por anticorpo anti-cauda de
histidina, que a hemocianina foi expressa no espaço do citosol da levedura. Portanto,
seguimos com a purificação do sobrenadante lisado. Contudo, não conseguimos purificar
a proteína recombinante, sugerindo que a cauda de histidina pode estar escondida no
dobramento da molécula. Para solucionar este problema estamos inserindo uma pequena
 46

sequência entre a cauda de histidina e hemocianina de forma a evitar que a mesma fique
indisponível.

7. CONSIDERAÇÕES FINAIS

O estágio em si foi uma experiência incrível, onde foi possível ter uma vivência
com a prática laboratorial, aprendendo além do que é ensinado nas aulas teóricas. Além
disso o laboratório de imunopatologia disponibilizou ótimos profissionais como o Dr.
Geraldo Santana Magalhães e a Dra. Paula Calabria, que com amplos conhecimentos
técnicos laboratoriais e acadêmicos, ensinando as práticas no dia a dia em um laboratório
de biologia molecular.

6. REFERÊNCIAS

Câmara, E., Landes, N., Albiol, J., Gasser, B., Mattanovich, D., & Ferrer, P. (2017). O
aumento da dosagem de cassetes de expressão regulada pelo promotor AOX1 leva
à atenuação da transcrição do metabolismo do metanol em Pichia pastoris.
Scientific Reports, 7, 44302.
Cereghino, J. L., Cregg, J. M. Expressão de proteínas heterólogas na levedura
metilotrófica Pichia pastoris. FEMS Revisões de microbiologia, v. 24, p. 45-66,
2000.
Cereghino, GPL, Cereghino, JL, Ilgen, C., & Cregg, JM (2002). Produção de proteínas
recombinantes em culturas fermentadoras da levedura Pichia pastoris. Opinião
atual em biotecnologia, 13 (4), 329-332.
Daly, R., & Hearn, MT (2005). Expressão de proteínas heterólogas em Pichia pastoris:
Uma ferramenta experimental útil na engenharia e produção de proteínas. Journal
of Molecular Recognition: An Interd An Interdisciplinary Journal, 18 (2), 119–
138.
Gomes, AR, Byregowda, SM, Veeregowda, BM, & Balamurugan, V. (2016). Uma visão
geral dos sistemas hospedeiros de expressão heteróloga para a produção de
proteínas recombinantes. Advances in Animal Veterinary Sciences, 4 (7), 346–
356.
Ingold, C. T.; Hutchínson, I. The Biology of Fungi. Londres, 1969.
 47

Khan, KH (2013). Expressão gênica em células de mamíferos e suas aplicações.

Farmacêutico Avançado, 3 (2), 257–263.
Julien, C. (2006). Produção de proteínas recombinantes humanóides em Pichia pastoris.
BioProcess International, 22–30. [Google Acadêmico]
Torres, F. A. G.; Moraes, L. M. P. Proteínas recombinantes em leveduras. Biotecnologia
Ciência & Desenvolvimento, v. 29, p. 20-22, 2002.
Vassileva A, Chugh DA, Swaminathan S, Khanna N. Efeito do número de cópias nos
níveis de expressão do antígeno de superfície da hepatite B na levedura
metilotrófica Pichia pastoris. Proteína Expr Purif. 2001;21:71– 80. doi:
10.1006/prep.2000.1335. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]