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INSTITUTO FEDERAL DE EDUCAÇÃO, CIÊNCIA E TECNOLOGIA DE SÃO PAULO

ENGENHARIA DE ALIMENTOS

EVERTON ZANAZZI
CAROLINE SANTOS
GIOVANNA MARTINS
MARIA CLARA UMBUZEIRO BARBOSA
NATHALIA C. S. TAVARES

DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNAS PELO MÉTODO DE BIURETO

MATÃO
2022
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EVERTON ZANAZZI
CAROLINE SANTOS
GIOVANNA MARTINS

MARIA CLARA UMBUZEIRO BARBOSA

NATHALIA C. S. TAVARES

DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNAS PELO MÉTODO DE BIURETO

Trabalho de aula prática da disciplina de

Análise de Alimentos do curso de
Bacharelado em Engenharia de
Alimentos do Instituto Federal de
Educação, Ciência e Tecnologia de São
Paulo – Câmpus Matão sob orientação da
Profa. Gláucia Santos Vieira.

MATÃO
2022
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LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Materiais utilizados na Análise de proteína ................................................................8

Figura 2 – Pesagem da amostra de PTS .....................................................................................9

Figura 3 – Amostra A,B,C e D diluída com água destilada ......................................................9

Figura 4 – Amostra A,B,C e D com coloração azul ................................................................10

Figura 5 – Amostras 1,2,3,4,5 e 6 com coloração violeta ........................................................10

Figura 6 – Reação de formação do Complexo de Biureto .......................................................12

Figura 7 – O produto da reação forma um complexo de coloração violeta que é proporcional ao

teor das proteínas no meio .........................................................................................................12
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LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Cálculo das amostras ..............................................................................................11

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SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO..................................................................................................................5
2. OBJETIVO..........................................................................................................................7
3. MATERIAIS E MÉTODOS .............................................................................................8
3.1. Materiais .......................................................................................................................8
3.1.1. Reagentes de biureto ....................................................................................................8
3.1.2. Padrão de proteína (caseína)-(1m mg/ml) .................................................................8
3.1.3. Equipamentos e vidrarias ............................................................................................8
3.2. Métodos .........................................................................................................................9
3.2.1. Preparo das amostras ..................................................................................................9
3.2.2. Preparo da curva padrão ..........................................................................................10
3.2.3. Princípio da técnica de biureto para determinação de proteína ...........................11
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES ...................................................................................13
4.1. Discussões ....................................................................................................................13
4.2. Resultados ...................................................................................................................13
4.2.1. Cálculos .......................................................................................................................14
5. CONCLUSÃO ..................................................................................................................15
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................................16
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1. INTRODUÇÃO

Entre os vários métodos para dosagem de proteína total destaca-se o método

do biureto, o qual se baseia na reação do reativo de biureto, que é uma mistura de
íons Cu2+, Cu(OH)2 e tartarato de sódio, sendo esse último um complexante que
estabiliza íons Cu2+ em solução. A reação é positiva para peptídeos constituídos de
no mínimo de três aminoácidos. Tal complexação também ocorre com o biureto
(H2NCO-NH-CO-NH2), daí o nome da reação.
As origens do método do biureto podem ser traçadas desde a proposta inicial
de Autenrieth, em 1915; posteriormente diversos autores propuseram modificações
do mesmo, sendo, atualmente, a proposta metodológica de Gornall e cols9. a mais
utilizada. O método se baseia na reação do reativo do biureto, que é constituído de
uma mistura de cobre e hidróxido de sódio com um complexante que estabiliza o
cobre em solução, sendo o tartarato de sódio o recomendado por Gornall e cols.9. O
cobre, em meio alcalino, reage com proteínas formando um complexo quadrado
planar com a ligação peptídica. O produto de reação apresenta duas bandas de
absorção, uma em 270 nm e outra em 540 nm. Apesar da banda na região de 270 nm
aumentar em seis vezes a sensibilidade do método do biureto14, a banda na região
de 540 nm é a mais utilizada para fins analíticos, porque diversas substâncias,
normalmente presentes na maioria dos meios analisados, absorvem na região de 270
nm causando muita interferência no método.
O método de biureto tem sido aplicado para determinar a concentração de
proteínas totais em diversos meios, sendo eles: soro ou plasma sangüíneo, líquido
cérebro espinhal (líqüor), urina, alimentos, saliva, fibrinogênio e tecido animal. O
método de biureto tem sido, também, utilizado em análise por injeção em fluxo,
assim como em alguns métodos cinéticos. Apesar de ser rápido, utilizar reagentes
de baixo custo e não apresentar grande variação da absortividade específica para
diferentes proteínas, este método não é muito sensível, como foi destacado por
diversos autores, colocando-o em grande desvantagem, em relação a outras
metodologias, e por isto tem sido, ao longo dos anos, substituído por métodos mais
sensíveis. Mesmo assim, o método de biureto continua sendo recomendado para a
determinação da concentração de proteínas totais em plasma sangüíneo pela
Associação Americana de Análises Clínicas e por diversos autores, bem como para
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a determinação de proteínas totais em saliva30 e leite29, quando comparado com

outros métodos.
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2. OBJETIVO

Determinar a quantidade de proteínas presente na amostra de proteína

texturizada de soja através do método de biureto.
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3. MATERIAIS E MÉTODOS

Para a realização da análise foram utilizados vários materiais que são essenciais para
obter o resultado de umidade da amostra analisada.

3.1. Materiais
3.1.1. Reagente de biureto

 Pesar 1,5 g de CuSO4.5H2O e 6 g de tartarato duplo de sódio e potássio, dissolvê-

los em água destilada completando o volume a aproximadamente 500 ml. Juntar
sob agitação, 300 mL de NaOH 10% e completar a 1 litro.

3.1.2. Padrão de proteína (caseína) - (10 mg/mL)

 Dissolver 1 g de caseína em 100 mL de NaOH 0,1 mol/l.

3.1.3. Equipamentos e vidrarias

 Espectrofotômetro
 Estante com 9 tubos de ensaio
 1 pipetas graduada de 5 mL
 2 pipetas graduadas de 2 mL
 3 béqueres de 50 ml

Figura 1: materiais utilizados na análise de proteína.

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3.2. Métodos

3.2.1. Preparo da Amostra

Foi pesado de 1 a 10 g de amostra proteína texturizada de soja, tendo peso de 10,023 g.

Figura 2: pesagem da amostra de PTS.

Foi diluído em um balão 100 ml de água destilada com os 10 g da amostra pesada. Nesta
amostra foi apresentado uma solução com concentração de 10 mg/ml de proteína.

Após, foi realizado a filtragem da amostra em papel filtro para melhor diluição.

Foram piptados em 3 tubos de ensaio identificados como A, B e C, com volumes de 0,5;

0,2 e 0,1 ml da amostra e completado com 1 ml de água destilada.

Figura 3: amostras A,B e C diluídas com água destilada

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3.2.2. Preparo da curva padrão.

Foram enumerados 6 tubos de ensaio de 0 a 6, pipetando os componentes

com dosagens de 0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 e 1 ml da solução padrão de proteína (10
mg/ml), usando uma pipeta de 1 ml.

Foi completado o volume de cada tubo para 1 ml com água destilada.

Adicionou-se 5 ml do reagente de Biureto, agitando e deixou em repouso durante
30 minutos à temperatura ambiente.

Figura 4: amostra A,B,C e D com coloração Figura 5: Amostra 1,2,3,4,5 e 6 com

Azul. coloração violeta.

Foi realizado a leitura dos tubos no espectrofotômetro a 540 nm.

Através dos dados obtidos foi realizada um gráfico apresentando a curva

padrão.

Abaixo foram descritos os valores das mg/tubo de caseína e a absorbância encontrada

após as amostras passarem ela análise do espectrofotômetro .
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Tabela 1: cálculos das amostras.

3.2.3. Princípio da Técnica de Biureto para Determinação de Proteína

Princípio da Técnica do Biureto para Determinação da Proteína Total As ligações

peptídicas das proteínas (-CONH-) reagem com os ions cúpricos, em meio alcalino, formando
um complexo de coloração violeta, que é proporcional ao teor das proteínas no meio. A
presença do tartarato de sódio e potássio estabiliza o reagente e a concentração adequada de
Iodeto de Potássio previne a sua auto-redução (GORNALL et al., 1949). Figura 2. A) Reação
de formação do Complexo de Biureto. B) O produto da reação forma um complexo de coloração
violeta que é proporcional ao teor das proteínas no meio.
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Figura 6 : Reação de formação do Complexo de Figura 7 : O produto da reação forma um complexo de

Biureto coloração violeta que é proporcional ao teor das proteínas
no meio.
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4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1. Discussões

As amostras com coloração das mistura A,B e C permaneceu azul, sendo a solução de
referência e os tubos contendo a proteína e água destilada. Nas amostras 1,2,3,4, e 5,
observou-se a formação de uma coloração violeta nos tubos. A coloração violeta foi mais
intensa nas amostras, por apresentar menor concentração de proteínas comparada às amostras
dos alimentos de origem animal. A coloração violeta observada após as reações descritas com
a proteína e a caseina se deve à ocorrência de um composto de coordenação que se forma a
partir de interações entre o íon e os átomos de nitrogênio presentes nas proteínas. O íon Cu2+,
por exemplo, é capaz de estabelecer ligações com ligantes capazes de contribuir com quatro
pares de elétrons. Nesse caso, as proteínas atuam como ligantes do íon cúprico, e o par de
elétrons disponível em cada átomo de nitrogênio exerce interação com o metal de modo a
mantê-lo envolto, protegido, permitindo a estruturação do composto de coordenação.

4.2. Resultados

Após todas as análises realizadas foram aplicados os cálculos para verificação da curva
padrão.
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4.2.1. Cálculos:

Cálculo do Valor de Proteínas (mg/g)

𝑃 = 𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎çã𝑜 ∗ 𝐹𝐷 ∗ 100

Para a amostra B:

𝑃 = 6,247 ∗ 31,24 ∗ 100

𝑃 = 19.515,628

𝑃
= 19,5 %
1000

Para a amostra C:

𝑃 = 2,230 ∗ 50 ∗ 100

𝑃 = 11.150

𝑃
= 11 %
1000
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5. CONCLUSÃO

A reação do Biureto é importante para demonstrar a presença de proteínas em materiais

biológicos, como também para quantificá-las, uma vez que o complexo cobre-proteína
apresenta uma absorção máxima 545nm; a intensidade da cor depende exclusivamente da
concentração de proteína.
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6. REFERENCIAS

Cecchi, H. M. “Fundamentos teóricos e práticos em análise de alimentos” Campinas:

Editora da Unicamp, 1999.