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INSTITUTO FEDERAL DE EDUCAÇÃO, CIÊNCIA E TECNOLOGIA DE SÃO PAULO

ENGENHARIA DE ALIMENTOS

EVERTON ZANAZZI
JULIANA MARANGUELI PAIVA
MARIA CLARA UMBUZEIRO BARBOSA
NATHÁLIA C. S. TAVARES
SUELEN AMARAL RODRIGUES

CONTAGEM MICRORGANISMOS EM AMOSTRA DE QUEIJO TIPO

FRESCAL:
COLIFORME E COLIFORME FECAL, SALMONELLA ssp e
STAPHYLOCOCCUS AUREUS

MATÃO
2022
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EVERTON ZANAZZI
JULIANA MARANGUELI PAIVA
MARIA CLARA UMBUZEIRO BARBOSA
NATHÁLIA C. S. TAVARES
SUELEN AMARAL RODRIGUES

CONTAGEM MICRORGANISMOS EM AMOSTRA DE QUEIJO TIPO

FRESCAL:
COLIFORME E COLIFORME FECAL, SALMONELLA ssp e
STAPHYLOCOCCUS AUREUS

Trabalho de aula prática da disciplina de

Microbiologia de Alimentos II do curso
de Bacharelado em Engenharia de
Alimentos do Instituto Federal de
Educação, Ciência e Tecnologia de São
Paulo – Câmpus Matão sob orientação da
Profa. Márcia Luiza Rizatto.

MATÃO
2022
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LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Materiais utilizados nas análises ..............................................................................11

Figura 2 – Fluxo preparação das diluições das amostras .........................................................12

Figura 3 – Tubo como caldo EC positivo ................................................................................15

Figura 4 – Tubo com caldo VC positivo ..................................................................................16

Figura 5 – Placa BS e placa XLD respectivamente .................................................................17

Figura 6 – Placa HE .................................................................................................................17

Figura 7 – Inoculação feita no tubo de ágar tríplice Açúcar Ferro (TSI) ................................18

Figura 8 – Inoculação feita no tubo de ágar lisina Ferro (LIA) ..............................................18

Figura 9 – Colônia de staphylococcus aureus ..........................................................................19

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Diluição e a presença de colônias lise ......................................................................16

Tabela 2 – Contagem das colônias de staphylococcus aureus ................................................19

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LISTA DE ABREVIAÇÃO

DTA – Doenças Transmissivéis por Alimentos

PCA – Plate Count Agar

PDA – Potato Dextrose Agar

TT – Tetraleonato

RV – Rappart-Vassiliadis

HE – Hecktoen

XLD – Xilose Lisina Desoxicolato

TSI – Tríplice Açúcar Ferro

LI – Lisina Ferro

BHI – Brain Heart Infusion

NMP – Número mais provável

UFC – Unidade Formadora de Colônia

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SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO...................................................................................................................7
2. OBJETIVO..........................................................................................................................9
3. MATERIAIS E MÉTODOS ...........................................................................................10
3.1. Materiais .....................................................................................................................10
3.1.1. Salmonella ...................................................................................................................10
3.1.2. Coliformes e Coliformes Fecais ................................................................................10
3.1.3. Staphylococcus aureus ...............................................................................................11
3.2. Métodos .......................................................................................................................12
3.2.1. Salmonella ...................................................................................................................12
3.2.2. Coliformes e Coliformes Fecais ................................................................................12
3.2.3. Staphylococcus aureus ...............................................................................................14
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES ...................................................................................15
4.1. Amostras .....................................................................................................................15
4.2. Resultados ...................................................................................................................15
4.2.1. Contagem de Bactérias do grupo Coliformes e Coliformes Fecais do número mais
possível (NMP) ............................................................................................................15
4.2.2. Salmonella spp em alimentos ....................................................................................17
4.2.3. Staphylococcus aureus em alimentos .......................................................................19
4.3. Cálculos .......................................................................................................................19
5. CONSIDERAÇÕES FINAIS ..........................................................................................21
6. CONCLUSÃO ..................................................................................................................23
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................................24
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1. INTRODUÇÃO

O queijo frescal é um produto lácteo amplamente consumido no Brasil. É

obtido através da coagulação do leite, e passa pelos processos de pasteurização,
coagulação, agitação, moldagem, salga, embalagem e armazenamento. Por ser
bastante nutritivo, o leite acaba sendo muito susceptível a contaminação por
microrganismos como fungos e bactérias. Essas contaminações podem interferir na
qualidade final do queijo e causar doenças nos consumidores. Doenças de origem
alimentar são provocadas por fungos, bactérias, vírus, protozoários e agentes
químicos, sendo as bactérias as maiores causadoras de doenças transmitidas por
alimentos (DTA) (APOLINÁRIO, 2014). Essas doenças ocorrem geralmente por
condições de higiene inadequadas, no local de produção e durante a manipulação dos
alimentos, apresentando ainda alta incidência, mesmo com controle higiênico
sanitário de órgãos reguladores do governo, como a ANVISA (SOUZA, 2011). Para
evitar tais problemas, a pasteurização é essencial e obrigatória, de acordo com o Art.
10 do Capítulo 1 da Resolução Nº 065/2005, na preparação do leite para a produção
do queijo. Análises microbiológicas foram realizadas para identificação das cargas
microbianas para os microrganismos bolores e leveduras, psicotróficos e mesófilos
anaeróbios, sendo possível avaliar com os resultados as condições de processo e
manipulação do queijo frescal.
A salmonelose é um termo usado para descrever a doença que resulta da
ingestão da bactéria Salmonella e a infecção resultante. A bactérias Salmonella pode
ser encontrados em alimentos mal higienizados, crus ou mal cozidos, produtos
agrícolas não processados como hortaliças, frutas, carnes cruas, leite e ovo, e
podendo estar presentes também no solo e na água contaminados com fezes. Este
microrganismo entra no trato digestivo, multiplica-se no intestino delgado e grosso
ocasionando uma inflamação que resulta em gastroenterite.
Adequar as boas práticas no manuseio dos alimentos e higiene pessoal são
formas de evitar a contaminação ingestão da bactéria Salmonella. Resfriar
rapidamente alimentos em volumes reduzidos, cozimento intenso, uso de ovos e leite
pasteurizado, evitar contaminação cruzada de áreas limpas e sujas ou de alimentos
crus e cozidos, lavar e higienizar as mãos e sanear equipamentos.
Os microrganismos “coliformes” selecionados de inóculos procedentes de
caldos de enriquecimento de coliformes, são bactérias em formato de bastonete,
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Gram-negativas; não esporuladas, que fermentam a lactose com produção de gás em

48 h a 35 °C.
O método para a quantificação de coliformes fecais, baseia-se na fermentação
da lactose em temperatura elevada (44 - 45 °C), o que pode apresentar possíveis
deficiências. Essas deficiências, é devido a coliformes termotolerantes além da E.
coli, principalmente Klebsiella, os quais por não serem de origem exclusivamente
fecal, podem comprometer a utilização do subgrupo coliformes fecais como
indicadores de contaminação fecal. As tendências habituais, em termos de
desenvolvimento de metodologia analítica, se direcionam para a detecção específica
de E. coli.
Os Estaphylococcus são bactérias Gram-positivas, cujo diâmetro oscila
entre 0.5 e 1.5 micras. Caracterizam-se porque dividem-se em grupos que
assemelham com cachos de uva (HARRIS et al., 2002).
Intoxicação alimentar por estaphylococus é uma das doenças transmitidas por
alimentos (DTA) mais comuns e resulta da ingestão de enterotoxinas estafilocócicas
(EE) pré-formadas em alimentos (HENNEKINNE et al, 2012).
O método de contagem de microrganismos em placas é um método geral, que
pode ser utilizado para contagem de grandes grupos microbianos, como aeróbios
mesófilos, aeróbios psicrotróficos, termófilos, bolores e leveduras, variando-se o tipo
de meio, a temperatura e o tempo de incubação (Hajdenwurcel, 1998; Silva et al.,
1997).
Contagem total de microrganismos mesófilos aeróbios detecta, em um
alimento, o número de bactérias aeróbias ou facultativas e mesófilas (35-37°C),
presentes tanto sob a forma vegetativa quanto esporulada (Hayes, 1995; Siqueira,
1995).
Bolores são fungos filamentosos, multicelulares, podendo estar presentes no
solo, no ar, na água e em matéria-orgânica em decomposição. Leveduras são os
fungos não filamentosos, normalmente disseminados por insetos vetores, pelo vento
e pelas correntes aéreas (Siqueira, 1995).
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2. OBJETIVO

Identificar as cargas microbianas presentes no queijo frescal em análises

realizadas em aula prática no laboratório de microbiologia para avaliação das
condições de processamento e manipulação do queijo frescal, identificando a
possível presença de contagem total (aeróbios mesófilos e aeróbios psicotróficos),
coliforme fecal e salmonela ssp presente no queijo minas frescal, realizando a
avaliação através de 3 diluições em placas petri em PCA e PDA após incubação.
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3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. Materiais

3.1.1. Salmonella

Para a realização da análise foram utilizados vários materiais que são essenciais para
obter o resultado de Salmonella amostra analisada.

 225 mL de caldo de pré enriquecimento.

 Tubos de caldo tetrationato (TT);
 Tubos de Caldo Rappaport-Vassiliadis Modificado (RV);
 Placas de Ágar Entérico de Hecktoen (HE);
 Placas de Ágar Bismuto Sulfito
 Placas de Ágar Xilose Lisina Desoxicolato (XLD);
 Tubos de Ágar Tríplice Açúcar Ferro (TSI);
 Tubos de Ágar Lisina Ferro (LIA);
 Estufa bacteriológica a 36 1 °C e a 43 0,5 °C;
 Alça de platina.

3.1.2. Coliformes e Coliformes Fecais

Para a realização da análise foram utilizados vários materiais que são essenciais para
obter o resultado de Coliforme e Coliformes Fecais amostra analisada.

 Alça de 3 mm de platina ou níquel-cromo nº 25 em cabo de Kolle;

 3.1.2 Pipetas bacteriológicas de 1,0 e 10,0 mL com graduação decimal;
 Banho-maria de precisão regulado a 44,5 0,2 °C com agitação;
 Estufa bacteriológica regulada a 36 1 °C;
 Frasco Erlenmeyer de 500 mL, contendo 225 mL de solução salina a 0,85%
 Estéril, ou frasco de diluição, contendo 90 mL de solução salina a 0,85% estéril;
 Tubos de ensaio contendo 10 mL de Caldo Lauril Sulfato Triptose (LST) com
 Duplicação dupla com tubo de Durhan invertido;
 Tubos de ensaio contendo 10 mL de caldo Lactosado Bile Verde Brilhante a
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 2% com tubo de Durhan invertido;

 Tubos de ensaio contendo 10 mL de caldo EC com tubos de Durhan invertidos;
 Culturas padrão de E. Coli e de Enterobacter aerogenes.

3.1.3. Staphylococcus aureus

 1 Erlenmeyer de 500mL com 225 ml de água salina peptonada;

 2 tubos de ensaio com 9 ml com água salina peptonada;
 3 placas com Ágar Baird- Parker;
 Estufa bacteriológica a 36  1 °C;
 Alça de platina;
 Pipetas bacteriológicas de 10,0 e 1,0 ml com graduação decimal;
 Alça de Drigalski;

Figura 1: materiais utilizados nas análises.

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3.2. Métodos

Figura 2: fluxo de preparação das diluições das amostras.

3.2.1. Salmonella

Pesar com exatidão, em cadinho calcinado (submetido à queima em forno Para o pré-
enriquecimento deve-se pesar assepticamente 25 g de amostra.
Transferir assepticamente para um Erlenmeyer contendo 225 mL de caldo lactosado;
Incubar 36  1 °C por 18 a 24 horas;
Para o enriquecimento Seletivo, deve-se transferir assepticamente alíquotas de 1,0 mL,
provenientes do caldo de de caldo tetrationato (ao qual se adicionou 0,1 mL da solução de verde
brilhante e 0,2 mL da solução de lugol) e em outro contendo 10 mL de caldo Rappaport-
Vassiliadis Modificado;
Incubar os tubos de caldo Rappaport-Vassiliadis Modificado em banho a 43  0,5 °C
por 24 horas e os de tetrationato em em estufa a 36  1 °C;
A partir do enriquecimento seletivo, semear através de estrias os meios sólidos seletivos:
Ágar Entérico de Hectoen, Xilose Lisina Desoxicolato e Bismuto Sulfito;
Incubar as placas a 36  1 °C por 24 horas;
Examinar as placas e verificar o desenvolvimento de colônias típicas;
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Com o auxílio de uma agulha de inoculação, remover uma porção de massa de células,
do centro da colônia típica e inocular em tubos inclinados de Ágar, Lisina Ferro (LIA) e Ágar
Tríplice Açúcar Ferro (TSI);
A inoculação deve ser feita por picada e estrias na rampa, utilizando-se a mesma alçada
para inocular ambos os tubos;
Incubar os tubos a 35 C por 24 horas e observar se há ocorrência de reação típica de
Salmonella.

Observação: Para inoculação, não é necessário nem recomendável flambar a agulha e

retirar outra porção da colônia, entre um tubo e outro.

3.2.2. Coliformes e Coliformes Fecais

Coletar as amostras;
Fazer as diluições;
Inocular 3 tubos de ensaio contendo 10 mL de caldo lauril sulfato triptose, com 1 mL
da primeira diluição;
Repetir a mesma operação para as diluições subsequentes;
Incubar os tubos por 24 e 48  2 h a 36  1 °C;
Após 24 h verificar os tubos com produção de gás;
Reincubar os tubos negativos por mais 24 h;
Para cada diluição, anotar o número de tubos com produção de gás no período de 48 
2 h;
Transferir uma alçada (com o auxílio da alça de inoculação) de cada tubo positivo do
teste presuntivo para outro tubo contendo 10 mL de caldo lactosado bile verde brilhante;
Incubar os tubos por 24 e 48  2 h a 35  0,5 °C;
Após 24 h verificar os tubos com produção de gás;
Reincubar os tubos negativos por mais 24 h;
Para cada diluição, anotar o número de tubos com produção de gás no período de 48 
2 h;
Verificar na tabela o NMP de coliformes;
Expressar o resultado como NMP de coliformes por mL ou g de amostra, conforme o
caso;
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Transferir uma alçada (com o auxílio de uma alça de inoculação) de cada tubo positivo
do teste presuntivo para outro tubo contendo 10 mL de caldo EC;
Incubar a 44,5  0,2 °C por 24 h;
Verificar o número de tubos com produção de gás, somente considerar os resultados
confiáveis quando os controles apresentarem crescimento com gás para Escherichia coli e
ausência de crescimento ou crescimento sem gás para Enterobacter aerogenes;
Verificar na tabela o NMP de coliformes;
Expressar o resultado como NMP de coliformes fecais por mL ou g de amostra;
Selecionar os tubos positivos do caldo EC e semeá-los, por estrias em ágar EAM;
Incubar a 35 °C por 24 h;
Verificar a presença de colônias típicas de E coli, colônias negras com brilho verde
metálico.

3.2.3. Staphylococcus aureus

Para o Plaqueamento Seletivo foi semeado 0,1 ml das diluições 10-1 e 10-2 da amostra
na superfície do Ágar Baird-Parker (em duplicata), espalhando em toda superfície o material
semeado, com o auxílio da Drigalski estéril;
Após ter aguardado a secagem, invertemos a placa e incubamos a 36  1 °C por 24 a 48
horas. Foi verificado o desenvolvimento de colônias típicas, que apresentam como colônias de
bordos regulares, pretas, brilhantes, com cerca de 1 mm de diâmetro, normalmente circundadas
por 2 halos, um mais extenso e transparente e outro menos extenso, opaco mais próximo da
colônia;
Contamos e anotamos o número total de colônias típicas. 4.3. Preparo do material para
provas complementares
Isolamos em Ágar Nutriente e em caldo BHI, um número de colônias correspondente a
raiz quadrada do número total de colônias características presentes na placa, com o isolamento
mínimo de 5 colônias;
Incubamos a 36  1 °C por 24 horas;
Examinamos pela coloração de Gram, as culturas obtidas. O Staphylococcus aureus
apresenta-se como cocos Gram-positivos normalmente agrupados em cachos.
 15

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1. Amostras

O experimento baseia-se na análise de pequenas quantidades de amostras do grupo

bacteriano do Queijo Minas Frescal. O intuito é realizar a contagem em placas de petri com
meios de cultura para determinar o tamanho de uma população de microrganismo, o que será
discutido nas unidades formadoras de colônias, também conhecidas como UFC.

4.2. Resultados

4.2.1. Contagem de bactérias do grupo coliforme e coliformes fecais pela técnica do

número mais provável (NMP)

Contagens de microrganismos pelo Número Mais Provável (NMP) são permite avaliar
estatisticamente a quantidade de microrganismos presentes em uma amostra e estimar a
proporção viável metabolicamente ativa. Ou seja, pode ser utilizada para estimar a população
total ou de um grupo específico de microrganismos, sendo o conjunto de respostas positivas ou
negativas considerado para o cálculo final.

Figura 3: Tubo com caldo EC positivo.

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Figura 4: Tubo com caldo VB positivo.

Depois dos tubos com caldo EC e VB serem incubados por 24 a 44,5 horas a 0,2 °C, foi
perceptível a produção de gases em alguns tubos.

Diluições Caldo Ec Caldo VB

-1
10 2 1
-2
10 2 1
-3
10 0 0
Tabela 1-Diluições e a presença de colônias.

Visto que a presença de colônias de E. Coli foram identificadas em alguns dos tubos,
utilizando a tabela do NMP (Número Mais Provável), ficou 7>NMP>21 por grama ou mL , o
que torna a amostra de queijo frescal dentro do aceitável para consumo, sem causar
interferência na qualidade, segurança do produto e saúde do consumidor.
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4.2.2. Salmonella spp em alimentos.

Logo após o incubamento das placas por 24 a 36 horas a 1°C, foi perceptível a presença
de colônias típicas de salmonella.

Figura 5: Placa BS e placa XLD respectivamente.

Figura 6: Placa HE
 18

Em seguida, a colônia típica presente na placa BS foi selecionada para inoculação nos
tubos de Ágar Lisina Ferro e Ágar Tríplice Açúcar Ferro, e após a inoculação percebeu-se a
presença de colônias típicas, como mostrada nas figuras abaixo.

Figura 7: Inoculação feita no tubo de ágar Tríplice Açúcar Ferro (TSI)

Figura 8: Inoculação feita no tubo de ágar Lisina Ferro (LIA).

Observando os resultados obtidos no tubo TSI, a parte do fundo ficou amarelada e a

rampa avermelhada, o que indica a presença de Salmonella na amostra. No tubo LIA,
avermelhada no fundo e a rampa na cor púrpura, o que também confirma a presença de
Salmonella na amostra.
 19

4.2.3. Staphylococcus aureus em alimentos

Através do incubamento das placas por 24 a 48 horas, observou-se o crescimento de

colônias típicas em todas as placas referentes as diluições 10 -1, 10 -2, 10 -3,

Figura 9: Colônias de Staphylococcus aureus

Diluição Número de colônias

-1
10 >300
-2
10 >300
-3
10 >110
Tabela 2: Contagem das colônias de Staphylococcus aureus

Na placa 10-1 foram contadas mais 300 colônias típicas, 10-2 foram contadas mais de
300 colônias típicas e na 10-3 foi contada mais de 110 colônias típicas.

4.3. Cálculos

Após os resultados obtidos, foi realizado os cálculos para obtenção dos resultados das
amostras quanto a aprovação ou rejeição do produto.

Placa de diluição 10-1 semeada com uma olíquota de 0,1 mL.

Total de colônias na placa: < 300 (N)

Total de colônias isoladas: 0 (l)

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Total de colônias confirmadas: < 59 (c)

Expressão

S = (C/l) x N

Resultado: { [(59/0) x 300] x 10 } / 0,1 = 0

Placa de diluição 10-2 semeada com uma olíquota de 0,1 mL.

Total de colônias na placa: < 300 (N)

Total de colônias isoladas: 16 (l)

Total de colônias confirmadas: < 120 (c)

Resultado: { [(120/16) x 300] x 10 } / 0,1 = 225 x 10³

Placa de diluição 10-3 semeada com uma olíquota de 0,1 mL.

Total de colônias na placa: < 110 (N)

Total de colônias isoladas: < 10 (l)

Total de colônias confirmadas: < 15 (c)

Resultado: { [(110/10) x 110] x 10 } / 0,1 = 121 x 10³

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5. CONSIDERAÇÕES FINAIS

Sabendo que não adequamos as boas práticas no manuseio dos alimentos, formas de
evitar a contaminação ingestão da bactéria Salmonella, foi introduzido na amostra com o intuído
de identificar nos nove tubos de ensaio programados com diferentes tipos de ambiente. Para a
Salmonella foi identificada na reação típica de Salmonella em TSI com a rampa alcalina, de
coloração vermelha, e fundo ácido, de coloração amarela, com ou sem produção de H2S
(escurecimento do Ágar).
De imediato vale frisar que para coliformes fecais, a presença nos alimentos é de grande
importância para a indicação de contaminação durante o processo de fabricação ou mesmo pós-
processamento. A presença destes microrganismos atuará como fator indicativo de
contaminação durante ou pós processo de fabricação, o que pode interferir diretamente na vida
útil do produto.
A presença de Coliformes totais no alimento analisado foi considerada uma indicação
útil de contaminação pós–sanitização ou pós-processo, evidencialmente práticas de higiene e
sanitização nos padrões de processamento.
A presença de Salmonella nos alimentos podem representar um risco para a saúde
pública, uma vez que tem se observado o aumento do número de surtos, devido ao consumo de
produtos contaminados presentes em diversos países. Diversos autores, para detecção de
Salmonella, têm utilizado a PCR para verificar a presença da bactéria em carnes, fezes, tecidos,
sangue, leite e ovos, com diferentes metodologias de manipulação das amostras, como foi o
caso da nossa analise o qual identificamos a presença da bactéria.
Para indústria a presença dos coliformes fecais, a maior parte das bactérias não
sobrevive tempo suficiente na água para serem detectadas, possuiu a importância como um
indicador de contaminação fecal na água, sendo por este motivo utilizadas como indicadores da
qualidade de higiene sanitária.
A presença de bolores e leveduras viáveis e em índice elevado nos alimentos pode
fornecer várias informações, tais como, condições higiênicas deficientes de equipamentos,
multiplicação no produto em decorrência de falhas no processamento e/ou estocagem e matéria-
prima com contaminação excessiva.
O número de microrganismos aeróbios mesófilos encontrado em um alimento tem sido
um dos indicadores microbiológicos da qualidade dos alimentos mais comumente utilizados,
indicando se a limpeza, a desinfecção e o controle da temperatura durante os processos de
 22

tratamento industrial, transporte e armazenamento foram realizados de forma adequada. Esta

determinação permite também obter informação sobre a alteração incipiente dos alimentos, sua
provável vida útil, a falta de controle no descongelamento dos alimentos ou desvios na
temperatura de refrigeração estabelecida.
 17
23

6. CONCLUSÃO

O queijo frescal tipo minas produzido de acordo com produções caseira está impróprio
para o consumo, levando em consideração a contagem dos microrganismos Salmonella sp e
Staphylococcus aureus, infringindo os limites determinados pela RDC da Anvisa de 331 de
2019 e a Instrução Normativa IN 60 de 2019. A presença de coliformes totais também é um
indicativo da má qualidade do produto. Dessa forma, a revisão das boas práticas de fabricação
deve ser realizada com urgência, já que as presenças destes microrganismos afetam diretamente
a saúde dos consumidores.
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7. REFERÊNCIAS

BRASIL. Instrução Normativa DAS – 62, de 26/08/2003. Oficializa os Métodos

Analíticos Oficiais para Análises Microbiológicas para Controle de Produtos de Origem Animal
e Água. Secretaria de Agricultura e Abastecimento. Coordenadoria de Defesa Agropecuária.
Disponível em: https://www.defesa.agricultura.sp.gov.br/legislacoes/instrucao-normativa-sda-
62-de-26-08-2003,665.html.