MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO

SECRETARIA DE EDUCAÇÃO MÉDIA E TECNOLÓGICA

INSTITUTO FEDERAL DE EDUCAÇÃO, CIÊNCIA E
TECNOLOGIA DO AMAZONAS
CURSO SUPERIOR TECNOLOGIA EM ALIMENTOS

RELATÓRIO DE ANÁLISES MICROBIOLÓGICAS: CALDO E.C E MRS PARA

LACTOBACILOS EM IOGURTE

MANAUS
2023
 JOYCE YARLEM DE SOUZA PINHEIRO
KHAN LEE URMAY QUEIROZ
LILIAN SILVA DE SOUZA
SUEUDA PEREIRA BRASIL
VALERIA MORAES DE LIMA

RELATÓRIO DE ANÁLISES MICROBIOLÓGICAS: CALDO E.C E MRS PARA

LACTOBACILOS EM IOGURTE

Relatório de análise microbiológica:

Identificação de Caldo E.C e MRS para
lactobacilos em iogurte, da disciplina de
Microbiologia de Alimentos, do Instituto
Federal de Ciências e Tecnologias do
Amazonas – IFAM CMC, para obtenção de
nota. Professora: Dra. Lúcia Schuch Boeira

MANAUS
2023
 SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 4
2. OBJETIVO ........................................................................................................... 5
3. PRÉ - LABORATÓRIO ………………………………………………………………. 6
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES ........................................................................
5. CONCLUSÃO.......................................................................................................
6. REFERÊNCIAS ...................................................................................................
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1. INTRODUÇÃO

A análise microbiológica de alimentos é predominantemente cultural, objetivando a

detecção ou a enumeração de microrganismos vivos. Em função da multiplicidade de
grupos, gêneros e espécies que podem estar presentes, um grande número de ensaios
são utilizados, que podem ser de dois tipos: ensaios qualitativos, que verificam a
presença ou ausência do(s) microrganismo(s) alvo em uma dada quantidade da
amostra, sem quantificar, e ensaios quantitativos, que determinam a quantidade do(s)
microrganismo(s) alvo na amostra, geralmente por unidade de massa ou volume.
Cada um desses ensaios segue procedimentos diferenciados, que dependem do(s)
microrganismo(s) alvo, mas a maioria deles utiliza as mesmas técnicas culturais
básicas de microbiologia. Essas técnicas são a detecção da presença/ausência da
contagem do Número Mais Provável (NMP) e a contagem padrão em placas.
(Swanson et al. , 2001)
A contagem padrão em placas é utilizada tanto para a quantificação de grandes
grupos microbianos, como os aerobios mesófilos, os aeróbios psicrotróficos, os bolores
e leveduras, os clostrídios sulfito redutores, os enterococos e as bactérias lácticas,
como também para gêneros e espécies em particular, como Staphylococcus aureus
Bacillus cereus e Clostridium perfringens .
O procedimento básico é a inoculação da amostra homogeneizada (e suas
diluições) em um meio sólido (com ágar), contido em placas de Petri, seguida da
incubação das placas até crescimento visível. A versatilidade da técnica é decorrente
do princípio envolvido na contagem, baseado na premissa de que, quando fixada em
um meio de cultura sólido adequado, cada célula microbiana presente na amostra irá
formar uma colônia isolada.
Variando-se o tipo de meio de cultura (meio de enriquecimento, meio seletivo, meio
seletivo-diferencial) e as condições de incubação (temperatura e atmosfera), é possível
selecionar o grupo, gênero ou espécie que se deseja contar. Como as células
microbianas muitas vezes ocorrem em agrupamentos (pares, tétrades, cachos,
cadeias, etc.), não é possível estabelecer uma relação direta entre o número de
colônias e o número de células.
Essa correlação é feita entre o número de colônias e o número de “Unidades
Formadoras de Colônias”(UFC),que podem ser tanto células individuais como
agrupamentos característicos de certos microrganismos.Para a homogeneização da
amostra e preparo das diluições, são utilizados os procedimentos descritos. Para a
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inoculação no meio de cultura, chamada de plaqueamento, podem ser utilizados quatro

procedimentos básicos: a) o plaqueamento em profundidade (pour plate), b) o
plaqueamento em superfície (spread plate), c) o plaqueamento em gotas (drop plate)
ou d) a filtração em membrana. (Swanson et al. , 2001)

PLAQUEAMENTO EM PROFUNDIDADE

O procedimento padrão de plaqueamento em profundidade, tem limite de detecção

de 10 UFC/g para produzir sólidos ou 1 UFC/ml para produtos líquidos. Esse
procedimento pode ser adaptado, se necessário, para limite de detecção de 1 UFC/g
para produtos sólidos. Suas principais aplicações são os ensaios de contagem total de
aeróbios mesófilos, contagem de clostrídios sulfitos redutores, contagem de
enterobactérias, contagem de enterococos e contagem de bactérias lácticas. Apresenta
algumas limitações, a principal delas sendo a necessidade de fusão do meio de cultura
antes do uso. Alguns meios, suplementados com componentes sensíveis ao calor
depois da esterilização, não podem ser reaquecidos para fusão do ágar antes do uso.
(Swanson et al. , 2001)

PLAQUEAMENTO EM SUPERFÍCIE (SPREAD PLATE)

A principal diferença do plaqueamento em superfície, em relação ao plaqueamento

em profundidade, é que a amostra e/ou suas diluições são inoculadas diretamente na
superfície do meio sólido, já distribuído em placas. A inoculação superficial é
considerada vantajosa sob alguns aspectos, pois não expõe os microrganismos ao
calor do meio fundido, permite a visualização de características morfológicas e
diferenciais de colônias, facilita a transferência de colônias, permite a utilização de
meios que não podem ser fundidos depois de prontos e não exige que os meios sejam
translúcidos.
Sua principal desvantagem é que o volume inoculado é limitado à capacidade de
absorção de líquido pelo meio de cultura, que não permite a inoculação de mais do que
0,5ml por placa. (Swanson et al. , 2001)

PLAQUEAMENTO EM GOTAS (DROP PLATE)

O plaqueamento em gotas é uma técnica de inoculação em superfície, com as mesmas

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vantagens do plaqueamento em superfície. A principal diferença é que o inóculo não é

espalhado, mas sim, depositado no meio de cultura, em gotas de 0,01ml. Como as
gotas ocupam um espaço mínimo, é possível inocular, numa mesma placa, três
diluições em triplicata, três gotas por diluição. Isso torna a técnica extremamente
econômica, com limite de detecção de 1.000 UFC/g de produtos sólidos ou 100 UFC/ml
de produtos líquidos. Não é uma técnica rotineiramente utilizada na análise de
alimentos, mas pode ser muito útil em situações que exijam a inoculação de um
número grande de diluições. (Swanson et al. , 2001)

FILTRAÇÃO EM MEMBRANA

O procedimento de filtração em membrana é limitado à análise de amostras

líquidas límpidas, sem sólidos em suspensão, que possam ser filtradas através de uma
membrana de poro 0,45mm. Sua principal vantagem é que permite a inoculação de
maiores volumes da amostra, concentrando na membrana os microrganismos
presentes na quantidade inoculada. O limite de detecção é de 1 UFC por volume
inoculado, sendo indicado para amostras com contagens abaixo do limite de detecção
dos outros procedimentos. Suas principais aplicações são os ensaios de contagem
total de aeróbios mesófilos, contagem de bolores e leveduras, contagem de bactérias
lácticas, contagem de enterococos e contagem de coliformes totais/fecais/ E. coli em
água, refrigerantes, outros produtos líquidos e produtos sólidos que possam ser
transformados numa solução límpida, como sal e açúcar, por exemplo. (Swanson et al.
, 2001)

CONTAGEM DAS COLÔNIAS E CÁLCULO DOS RESULTADOS

As instruções apresentadas são aplicáveis aos ensaios em que todas as colônias

desenvolvidas nas placas, após o período de incubação, são contadas e consideradas
no cálculo.
No caso de ensaios que utilizam meios diferenciais, para distinguir o(s)
microrganismo(s) alvo da microbiota acompanhante (outros microrganismos que
podem crescer nas mesmas condições), apenas as colônias típicas são contadas e
consideradas no cálculo. Esse é o caso da contagem de enterococos e
enterobactérias, que seguem as orientações dos capítulos específicos. Da mesma
forma, no caso dos ensaios que exigem a confirmação das colônias, apenas a
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porcentagem de colônias confirmadas é considerada no cálculo. (Swanson et al. ,

2001)
2. OBJETIVO GERAL

- Aprender métodos de microbiologia.

2.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

- Realizar os números mais prováveis

- Aprender fazer contagem de bactérias;

- Demonstrar a importância da contagem em placas

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3. EXPERIMENTO, RESULTADOS E DISCUSSÕES

3.1. Materiais

● Placas de petri
● Pipetas
● Béqueres
● Tubos de ensaios

3.2. Reagentes

● Caldo E.C
● Caldo MRS lactobacilos
● Ágar
● Água peptonada

3.3. Preparo da solução de caldo E.C

Pesou-se 8,5 g de E.C e dissolveu-se em 3,052 ml de água purificada até

homogeneização. Logo após, em cada um de 9 tubos de ensaio, foram adicionados
9 ml de diluente, utilizando a micropipeta (Figura 1), transferiu-se 1 ml da suspensão
para o primeiro tubo, homogeneizando a amostra o qual foi identificado como 10 1 ,
que corresponde a sua diluição (Figura 2). Depois, o tubo foi agitado durante alguns
segundos. O mesmo procedimento foi repetido para os outros tubos, até completar
as diluições necessárias, de 10 1 até 10 9 (Figuras 3 e 4).

As amostras para análises microbiológicas foram analisadas ficando incubadas em

estufa bacteriológica a uma temperatura de 44,5ºC entre um período de 24 horas
(EC) e 35ºC entre um período de 48 horas (VB).

3.4. Preparo da solução de caldo MRS lactobacilos

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3.5. Preparo da solução de Ágar

Suspendeu-se 37,5g do meio desidratado em 1L de água destilada e aqueceu-se

no microondas até se dissolver completamente. Depois, foram dispensados em
várias placas (Figuras 5 e 6). Após o meio solidificar, foram feitas estrias nas placas
com o tubo PCA 10 3 (Figura 7).

As amostras para análises microbiológicas foram analisadas ficando incubadas a

37 C entre um período de 18 a 24 horas.

Figura 1: Adição de diluente Figura 2: Identificação de amostra

Fonte: Lima, 2023 Fonte: Lima, 2023

Figura 3: Identificação de amostra Figura 4: Identificação de amostra

Fonte: Lima, 2023 Fonte: Lima, 2023
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Figura 5 : Placas de petri identificadas Figura 6: Placas de petri com a cultura

Fonte: Lima, 2023 Fonte: Lima

Figura 7: Estrias em placas

Fonte: Lima, 2023

Foram alcançados os seguintes resultados na análise da amostra de iogurte.

Na placa de Petri onde foi usado o PCA para contagem de bactérias, onde as
placas foram enumeradas de acordo com suas determinadas diluições, foram
encontrados os seguintes resultados:

DILUI PCA
ÇÃO
10 1 Inc
10 2 110
10 3 Inc
10 4 Inc
10 5 Inc
10 6 100
Logo o resultado escolhido foi a de maior quantidade, a placa de 10 6 que teve um
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número de 1,1x106 UFC/g.

Além do PCA, foi usado AB para contagem de bolores e leveduras, onde os

resultados estão apresentados na tabela abaixo:

DILUI AB
ÇÃO
10 1 138
10 2 13
10 3 2
10 4 -
10 5 -
10 6 -

Diante os dados, foi observado que logo na primeira diluição, ou seja, na placa de
10 1 , que o crescimento foi favorável para contagem com um valor
de 1,4x 103 UFC/g.

NMP (número mais provável)

Foi encontrado resultados favoráveis para determinar presença ou ausência de

coliformes totais e termotolerantes, onde todos os tubos múltiplos deram positivos.
Logo concluindo de acordo com valores tabelados o Número mais provável de
microrganismos. Foi usado o VB e EC, como é mostrado abaixo:

VB EC
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3 3
3 3
3 3
3 3
3 3
3 3

Chegando a um número tabelado de 1,1x10^6 NMP/g.

Após os métodos anteriores, foi usado o Agar EMB conhecido como Levine, que é
usado para isolar e identificar E.coli e Enterobacter. Onde foi observado estrias de
cores verdes metálicas, cores arroxeadas entre outras. Nessa análise não é possível
identificar se o microrganismo existente na amostra é de E.coli, podendo ser outros
tipos de bactérias como mostra a tabela abaixo:

CARACTERÍSTICAS Microrganismos
Colônias violeta escura, convexas, de E.coli
baixa
confluência, 2-3mm de diâmetro e que
exibe um brilho verde metálico á luz
refletida .
Colônias planas azuladas, relativamente Enterobacter aerogenes
confluentes, 4-6mm de diâmetro com um
centro marrom escuro, ocasionalmente
com um brilho metálico.
Colônias violetas com ligeiro brilho Citrobacter
metálico.
Colônias mucosas acastanhadas. Klebsiella
Colônias âmbar transparentes. Salmonela e Shigella
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5. CONCLUSÃO

Tendo em vista os resultados obtidos, podemos concluir que a amostra está

totalmente insatisfatória para o consumo humano. Sendo assim, é importante que
medidas sejam adotadas para que as pessoas não sejam acometidas por infecções
ou até mesmo intoxicações alimentares.

Uma medida essencial seria a refrigeração correta desse alimento, o queijo, para
assim evitar que os microrganismos cresçam e se multipliquem de maneira rápida.
Além disto, podemos dizer que o principal objetivo desta aula prática que era a
aprendizagem foi alcançado com êxito.
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6. REFERÊNCIAS

ISO 6887-1. Microbiology of food and animal feeding stuffs - Preparation of test
samples, initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination - Part
1:General rules for the preparation of the initial suspension and decimal dilutions,
1st ed . The International Organization for Standardization, 1999.

ISO 7218. Microbiology of food and animal feeding stuffs -General requirements and
guidance for microbiological examination, 3 rd ed . The International Organization
for Standardization, 2007.

SWANSON, K.M.J, PETRAN, R.L. & HANLIN, J.H. Culture methods for enumeration of
microorganisms. In: DOWNES, F. P. & ITO, K. (eds.), Compendium of Methods for
the Microbiological Examination of Foods, 4 th ed. Washington: American Public
Health Association (APHA), 2001. Chapter 6, p.53-67.

SILVA, Carlos Magalhães. Estudo Bacteriológico em Experimentos. São Paulo;

Terramar, 2003.

INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. Métodos

físico-químicos para análises de alimentos. 4° ediçã0, 2008. 1020 p.