INSTITUTO FEDERAL DE EDUCAÇÃO, CIÊNCIA E TECNOLOGIA DE PERNAMBUCO

Campus Recife - Av. Prof. Luis Freire, 500 - Cidade Universitária, Recife - PE, 50740-545

Disciplina: Microbiologia Aplicada

Professores: Edivânia Souza de Lima, Eduardo José Alécio de Oliveira

ANÁLISES DE CRESCIMENTO MICROBIANO

Relatório de microbiologia

Discentes:

João Victor Santiago

Maria Beatriz Gonçalves de Oliveira

Paula Eduarda Correia de Queiroz

Pedro Henrique Melo

Yvson Lucas Machado da Silva

RECIFE, 10 de Novembro de 2022

 SUMÁRIO:

1. OBJETIVOS ……………………………………………… 02
2. INTRODUÇÃO …………………………………………… 03
3. MATERIAIS UTILIZADOS ……………………………… 05
4. PROCEDIMENTO …………………………………………06
5. MANIPULAÇÃO ASSÉPTICA…………………………….07
6. INOCULAÇÃO DAS DIGITAIS……………………………07
7. SEDIMENTAÇÃO ESPONTÂNEA………………………..08
8. SEMEADURA COM ESTRIAS…………………………….09
9. INOCULAÇÃO EM PROFUNDIDADE…………………...11
10. ESFREGAÇO E COLORAÇÃO DE GRAM………………. 12
11. REFERÊNCIAS ……………………………………………..15

1
OBJETIVOS:

➢ Estudar as formas de controle microbiano;

➢ Analizar e observar o comportamento de microorganismo;
➢ Garantir ao máximo a vitabilidade das células e a quantidade de
células viáveis.

2
INTRODUÇÃO

Em qualquer ambiente estamos expostos a microrganismo. Dentro do ambiente

laboratorial microbiológico é de extrema importância estudar técnicas de
isolamento, inoculação, manipulação de microrganismos e esterilização de
vidrarias.

O isolamento consiste numa técnica utilizada para isolar microrganismo a partir de

uma população mista e em seguida estudar suas propriedades. Envolve meio de
culturas sólidos e técnicas de isolamento de colônias. Existem alguns fatores que
influenciam a escolha do meio que vai ser utilizado, como: a origem do material a
ser analisado, as necessidades nutricionais do organismo e as espécies que se
imaginam estar presente na amostra.

A inoculação é uma técnica muito utilizada para introduzir num organismo ou

inserir num meio ou ambiente propicio. Nos laboratórios de microbiologia clínica,
os meios de cultura são rotineiramente inoculados com amostras clínicas (amostras
que foram coletadas de pacientes com suspeita de doença infecciosa). A inoculação
de um meio líquido envolve a adição de uma parte da amostra ao meio. A
inoculação de um meio sólido ou meio em placa envolve a utilização de uma alça
de inoculação estéril para a aplicação de uma parte da amostra à superfície do

3
meio. Esse processo é conhecido como semeadura em estrias.

A manipulação consiste na técnica para manter os meios de cultura ou materiais

estéreis isentos de contaminação. Para manipulação dos microrganismos
pertencentes a cada uma das quatro classes de risco devem ser atendidos alguns
requisitos de segurança, conforme o nível de contenção necessário. Estes níveis de
contenção são denominados de níveis de Biossegurança. Os níveis são designados
em ordem crescente, pelo grau de proteção proporcionado ao pessoal do
laboratório, meio ambiente e à comunidade.

O nível de Biossegurança 1, é o nível de contenção laboratorial que se aplica

aos laboratórios de ensino básico, onde são manipulados os microrganismos
pertencentes a classe de risco 1.

O nível de Biossegurança 2 diz respeito ao laboratório em contenção, onde

são manipulados microrganismos da classe de risco 2. Se aplica aos laboratórios
clínicos ou hospitalares de níveis primários de diagnóstico, sendo necessário, além
da adoção das boas práticas, o uso de barreiras físicas primárias (cabine de
segurança biológica e equipamentos de proteção individual) e secundárias
(desenho e organização do laboratório).

O nível de Biossegurança 3 é destinado ao trabalho com microrganismos da

classe de risco 3 ou para manipulação de grandes volumes e altas concentrações de
microrganismos da classe de risco 2. Para este nível de contenção são requeridos
além dos itens referidos no nível 2, desenho e construção laboratoriais especiais.
Deve ser mantido controle rígido quanto a operação, inspeção e manutenção das
instalações e equipamentos e o pessoal técnico deve receber treinamento específico
sobre procedimentos de segurança para a manipulação destes microrganismos.

O nível de Biossegurança 4, ou laboratório de contenção máxima, destina-se a

manipulação de microrganismos da classe de risco 4, onde há o mais alto nível de
contenção, além de representar uma unidade geográfica e funcionalmente

4
independente de outras áreas. Esses laboratórios requerem, além dos requisitos
físicos e operacionais dos níveis de contenção 1, 2 e 3, barreiras de contenção
(instalações, desenho equipamentos de proteção) e procedimentos especiais de
segurança.

A esterilização de vidrarias de laboratório são necessárias geralmente em duas

ocasiões: quando os instrumentos são novos (limpeza prévia) e após serem
utilizados nas medições. Ter em mente quais substâncias foram utilizadas nos
instrumentos é importante, pois o método aplicado e os produtos utilizados na
lavagem e esterilização de vidrarias de laboratório podem interferir na análise.

MATERIAIS UTILIZADOS

1. Contador de colônias
2. Estufa
3. Geladeira
4. Bico de Bunsen
5. Tubo de ensaio
6. Placa de Petri
7. Cabo de kolle com alça de níquel
8. Cabo de kolle com agulha de Inoculação
9. Microscópio
10. Luva
11. Pisseta
12. Estante
13. Papel crepado
14. Lâmina
15. Algodão cardado

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PROCEDIMENTOS

1. Manipulação Asséptica
2. Inoculação das Digitais - Finger Plate
3. Sedimentação espontânea do Ar
4. Semeadura em Estrias
5. Inoculação em profundidade
6. Esfregaço e Coloração de Gram

DADOS

Prática Quantidade de colônias Quantidade de colônias

Inoculação de
<1 1
profundidade (Pour Plate)

Resultados

● Resultados da introdução de profundidade (Pour Plate). Em uma das

placas não houve proliferação pois teve erro no despejo do sabouraud pois
colocamos ele ainda muito quente na placa de Petri, na segunda placa
houve uma proliferação de uma colônia igual a 1

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 1. MANIPULAÇÃO ASSÉPTICA

1.1 Objetivos:

➔ Observar o meio de cultura e analisar a contaminação e propagação de fungos e

bactérias em ambiente estéril.

1.2 Procedimento:

A manipulação asséptica consiste na técnica para manter os meios de cultura ou

materiais estéreis isentos de contaminação, é de extrema importância dentro do
ambiente laboratorial microbiológico, pois os microrganismo podem afetar de forma
negativa as experiências realizadas alterando os resultados esperados no decorrer das
práticas.O ambiente laboratorial deve estar o mais livre possível de microrganismo para
obter bons resultados.

2. INOCULAÇÃO DE DIGITAIS

Materiais :

- Placa Rodac 9 cm de diâmetro;

- Bico de Bunsen;

- Ágar Padrão de Contagem (PCA);

- Digitais das mãos;

- Estufa;

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2.1 Procedimento

O meio de cultura utilizado na inoculação das amostras foi o Ágar Padrão de Contagem
(PCA) percebe-se que mesmo com o controle de temperatura entre 40-45 oC, é difícil a
homogeneização do meio com o inóculo na placa pelo método Pour-plate. Foi passado os
dedos sob o meio de cultura a fim de gerar um crescimento de colônias e logo após foi
embalado e colocado dentro da estufa por 3 dias. Em um curto período de tempo ocorre
a gelificação do Ágar na placa Rodac, gerando, o crescimento localizado das colônias.

2.2 Resultado

A etapa de crescimento da colônia foi crítico pela incerteza do método de profundidade.

Porém, nas placas houve proliferação de micro-organismo do meio com o inóculo de
modo uniforme na placa, se concentrando em grandes quantidades de colônias onde as
digitais deslizaram, de cores laranjas, amarelas e brancas com formatos circulares.

3. SEDIMENTAÇÃO ESPONTÂNEA DO AR

Materiais

- Placa Rodac 9 cm de diâmetro;

- Bico de Bunsen;

- Ágar Sabouraud;

- Estufa;

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3.1 Procedimento

O meio de cultura utilizado na inoculação das amostras foi o Ágar Sabouraud. Sob ação
da gravidade foi exposto a placa Rodac com o meio para o ar livre durante 15 minutos
sem o abrigo da chama, ao final posto dentro da estufa para favorecer o crescimento
durante 3 dias.

3.2 Resultado

Após a retirada da estufa foi visto que poucos micro-organismos proliferaram no meio
vistos a olho nu, mas ainda aqueles que proliferaram se tinham formatos circulares de
cores brancas e negras. Mostrando que até mesmo no ar existem micro-organismos.

4. SEMEADURA EM ESTRIAS

Materiais

-Bico de Bunsen;

-Placa de Petri com microrganismos crescidos;

-Ágar nutriente inclinado;

- Contador de colônias;

- Cabo de kolle com alça/agulha de níquel.

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4.1 Procedimento

Inicialmente, após a prática de impressão de digitais recolhemos a placa que foi

conservada por 3 dias em um meio de cultura PCA ( Plate Count Agar) para realizarmos
algumas observações perante as colônias crescidas dentro dela através do contador de
colônias. Foram elas: Cor, tamanho e aparência que mantiveram após sua incubação.

Ademais, demos sequência à nossa aprendizagem em relação a técnica de Semeadura em

estrias, que tem como objetivo obter o crescimento do microrganismo no meio de cultura
a fim de: Estocar bactérias, estudar seu metabolismo em uma prova específica e avaliar
a capacidade (ou não) dos micro-organismos no meio de cultura.

Em primeiro ponto, é importante esterilizar o principal instrumento de transferência no

bico de Bunsen, para assim nos certificar que o procedimento não sofra contaminação de
terceiros. Após isso, espere a alça esfriar um pouco para que não mate os
micro-organismos e logo em seguida, pegamos a placa e levemente tocamos sobre a
colônia que desejo analisar. Ainda com a chama ligada, pego o tubo de ensaio com ágar
nutriente inclinado e insiro a alça dentro dele partindo da base e realizando movimentos
de ondas até as extremidades do bisel (assim como mostra a figura abaixo) e fecho o
tudo. É importante manter todo equipamento que será utilizado perto da chama, assim
evita acidentes e aumenta a praticidade ao manipular os equipamentos.

4.2 Resultado

Após guardar sob refrigeração por 3 dias, o procedimento resultou em vários

microrganismos crescidos com formatos circulares, nas cores branca e cinza, e com
aparência de bolores.

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 5. INOCULAÇÃO EM PROFUNDIDADE (Pour Plate)

Materiais:

-Bico de Bunsen

-Água pura

-Algodão cardado

-Pipetador automático

-Pipeta esterilizada

- 2 placas de Petri

- Frasco de vidro 250ml

5.1 Procedimento

Demos início a prática de Inoculação de água de enxágue de vidraria não estéril

escolhendo uma Vidraria não estéril qualquer e a nossa foi um frasco de 250ml para
observamos se teria proliferação após o manejo de cultura nessa Vidraria.

Com esses materiais na bancada demos início a nossa prática, onde colocamos a água
estéril do tubo no frascos de 250ml e agitamos para a água tocar em todas as paredes da
Vidraria em seguida pipetamos 1ml (na ponta de encaixe da pipeta colocamos um
chumaço pequeno de algodão) com o pipetador automático seccionamos o 1 ml do frasco
e botamos nas placas de petri, da máquina de banho Maria que estava a 35C° pegamos
dois tubos com sabouraud para pormos na placa de Petri à observação de proliferação
de bactérias.

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 6. ESFREGAÇO E COLORAÇÃO DE GRAM

Materiais:

-Corantes; Cristal violeta; Lugol e Safranina

-Álcool

-Tubo de ensaio

-Lâmina

-Cabo de kolle com alça

-Bico de Bunsen

-Pisseta com Água destilada

-Microscópio

6.1 Procedimento

Consiste em colorir microrganismos com corantes e descobrir qual microrganismo é se

baseando na reação dos corantes com as estruturas. Mas antes disso é preciso realizar a
técnica de esfregaço cumprindo todos os métodos, deve se checar o combustível do Bico

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de Bunsen e em seguida acende-lo, aquecer a alça até adquirir uma coloração alaranjada
do metal da alça em seguida deve-se esperar o calor se dissipar da alça para realizar a
captura de gotículas de água para inserção na lâmina, a alça é reaquecida e resfriada
para nova captura, dessa vez, do microorganismo que deve ser inoculado na lâmina de
vidro para ser colorido, lembrando que tudo isso deve ser feito com o auxílio da chama
mantendo uma distância de no máximo 20 centímetros.

Os corantes são inseridos do seguinte modo:

O Cristal Violeta é adicionado e deve ser cronometrado para ser lavado, o tempo é de 60
segundos.

O próximo passo é adicionar o lugol, novamente esperar 60 segundos e depois enxaguar

novamente tirando o excesso de corante.

Após essas etapas deve-se utilizar álcool 70ºGL para descolorir o microorganismo.

A última etapa é adicionar a Safranina, contabilizar 30 segundos e lavar novamente com

água destilada.

Microrganismos que adquirem a coloração azul-violeta são chamadas de gram-positivas

enquanto as que adquirem coloração avermelhada são gram-negativas, esse mecanismo
ocorre pois os microrganismos quando expostos a esses indicadores reagem dependendo
da sua dissolução lipídica de suas membranas externas com o que chamamos de
peptidoglicanos e cada um dos corantes tem uma função diferente para arranjos dessa
estrutura.

Depois de toda a coloração feita é preciso investigar acerca da cor absorvida pelo
microorganismo para fazer a distinção e para isso utilizamos um microscópio

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 ● Selecionar a objetiva de menor aumento e baixar a platina completamente. Se
o microscópio foi utilizado corretamente anteriormente, deve estar nesta
posição.
● Colocar a lâmina com o objeto a ser visualizado sobre a platina e travar com a

pinça.

● Começar a visualização com a objetiva de menor aumento.

● Realização do enfoque.

● Aproximar o máximo possível a lente do objeto a ser visualizado através do

ajuste macrométrico (depois disso não se deve utilizar esse ajuste)

● Ajustar com o chariot e observar se há foco

● Aumentar a lente gradativamente e por fim deve-se utilizar um óleo quando
obtiver uma boa resolução que assegurará a análise.

6.2 Resultado

Foi satisfatório aprender e desenvolver essa técnica que é imprescindível para

indicar microrganismos de gram-positivo ou gram-negativo

Foram realizados vários ensaios e foi possível observar microrganismos gram

negativos isolados e também uma amostra que continha os dois tipos de coloração
indicando que o isolamento não foi bem executado e havia os dois tipos de
microorganismos(gram-positivo e gram-negativo) em uma das lâminas que
inoculamos.

Essa técnica serve para levantar suspeitas sobre contaminação de bactérias e é

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bastante versátil, por isso ainda é bem utilizada em variados segmentos e foi
possível comprovar a sua eficácia em indicar microrganismos e facilitar a
visualização no microscópio.

REFERÊNCIAS
1. Microbiologia - Gerard J. Tortora; Christine L. Case; Berdell R. Funke. Edição
12ª/2016
2. https://docs.google.com/file/d/0B99-LtFjHQR1b3hXU2N4THM5Q3M/ed
it
3. https://kasvi.com.br/qual-a-finalidade-de-meios-de-cultura-em-microb
iologia/#:~:text=Inocula%C3%A7%C3%A3o%20de%20Meios%20de%2
0Cultura,parte%20da%20amostra%20ao%20meio.
4. https://www.laborclin.com.br/wp-content/uploads/2019/06/GRAM.pdf
5. https://kasvi.com.br/manuseio-microscopio/

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