Instituto Politécnico do Porto

Escola Superior de Saúde do Porto

Relatório de Biologia Microbiana

Alunos:

1. Inês Salgado Teixeira

2. Inês Sousa Soares

3. João Pacheco Dias

4. Matilde Pereira de Morais

5. Miguel Santos Carvalhos

Turno: B Grupo:2

Ano letivo 2022/2023

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Relatório de Biologia Microbiana

Licenciatura de Biotecnologia Medicinal

Unidade Curricular Biologia Microbiana
Professora: Carla Oliveira

Alunos:
Inês Salgado Teixeira
Inês Sousa Soares
João Pacheco Dias
Matilde Pereira de Morais
Miguel Santos Carvalhos
Turma: B Grupo:2

Porto, 16 de novembro de 2022

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Índice

1. Introdução ........................................................................................................................... 7
2. Introdução Teórica.............................................................................................................. 8
3. Resultados Obtidos .......................................................................................................... 10
4. Discussão de Resultados ................................................................................................. 14
5. Conclusão ......................................................................................................................... 17
6. Referências Bibliográficas ................................................................................................ 18
7. Bibliografia de Imagens .................................................................................................... 18

Índice de Ilustrações

Figura 1. Placa com meio NA – mãos sujas ................................................................................... 10

Figura 2. Placa com meio NA – mãos limpas ................................................................................. 10
Figura 3. Placa com meio NA – telemóvel ..................................................................................... 10
Figura 4. Placa com meio NA – maçaneta ..................................................................................... 10
Figura 5. Placa com meio NA – capa de borracha .......................................................................... 10
Figura 6. Placa de MSA - sem crescimento de S.aureus.................................................................. 10
Figura 7. Placa com meio NA - Microrganismos ............................................................................ 11
Figura 8. Placa com meio NA - Microrganismos ............................................................................ 11
Figura 9. Placa com meio NA - Microrganismos ............................................................................ 11
Figura 10. Placa com meio NA - Microrganismos .......................................................................... 11
Figura 11. Placa com meio NA - Microrganismos presentes no solo – 4º diluição ............................ 11
Figura 12. Resultado coloração de Gram – lamina......................................................................... 12
Figura 13. Resultado coloração de Gram ao microscópio............................................................... 12
Figura 14. Placa com meio NA – S.aureus ..................................................................................... 12
Figura 15. Placa com meio NA – E.coli .......................................................................................... 12
Figura 16. Placa com meio NA – mix (S.aureus e E.coli) ................................................................. 12
Figura 17. Placa com meio MSA - mix (S.aureus e E.coli) – crescimento de S.aureus ........................ 13
Figura 18. Placa com meio MaC – mix (S.aureus e E.coli) – crescimento de E.coli ............................ 13

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 1. Introdução

Este relatório foi elaborado no âmbito da unidade curricular de Biologia Microbiana e encontra-se
dividido em quatro partes, uma introdução ao trabalho, uma introdução teórica com a descrição das
técnicas e meios utilizados, a apresentação dos resultados e, por último, uma discussão dos mesmos.

Neste trabalho vão ser abordadas cinco atividades experimentais desenvolvidas durantes as aulas:
● Ubiquidade dos microrganismos. Técnica asséptica. Flora microbiana.
● Isolamento de microrganismos do solo.
● Análise morfológica das colónias do solo.
● Observação Microscópica de microrganismos: Coloração de Gram.
● Isolamento de uma cultura pura. Repicagens. Meios seletivos.

Estas atividades tiveram como objetivo:

● Perceber a presença de microrganismos nos objetos à nossa volta, assim como no nosso corpo
(nariz e mãos)
● O isolamento de colónias de microrganismos a partir de uma amostra de solo
● O estudo morfológico de colónias de microrganismos obtidas a partir de uma amostra de solo
● Identificar bactérias gram-positivas e gram-negativas a partir da coloração de Gram
● O isolamento de uma cultura pura através de uma amostra mista

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 2. Introdução Teórica

Os microrganismos são um grande e diversificado grupo de seres microscópicos unicelulares que

podem ser divididos em seres acelulares, como os vírus, e em seres celulares como, por exemplo,
bactérias, protozoários, algas e fungos que, normalmente, se classificam como decompositores,
produtores ou consumidores primários. Estes pertencem aos três domínios, Bacteria, Archaea e
Euckaria, e podem ser encontrados nos mais diversos ambientes na forma de células isoladas ou em
colónias.
Os microrganismos têm elevada importância para o ser humano, mas também para o meio
ambiente. Estes são utilizados nas mais diversas áreas, como a genética, a bioquímica e a biologia
molecular, uma vez que são as ferramentas mais acessíveis para investigar e estudar os processos
biológicos, dada a sua simplicidade anatómica e o seu rápido crescimento em condições controladas.
Outras duas aplicações de grande interesse para o humano são a indústria e a medicina, uma vez que
os microrganismos são responsáveis pelos processos de fermentação, como por exemplo a
fermentação do leite e da cerveja, e pela obtenção e produção de muitos antibióticos. Relativamente
ao seu papel no meio ambiente, estes são responsáveis pela fertilização dos solos, pelo tratamento
de esgotos e por processos de biorremediação.

A maioria dos microrganismos podem ser estudados em laboratório recorrendo a meios de cultura.
Os meios de cultura são preparações químicas ricas em nutrientes que permitem o crescimento e
análise de microrganismos em laboratório. Cada microrganismo requer um conjunto específico de
nutrientes e condições indispensáveis ao seu desenvolvimento, assim é necessário proporcionar-lhes
as condições favoráveis para o seu crescimento, como a temperatura, humidade, pH, ausência e/ou
presença de oxigénio, entre outras. Estes meios podem ser classificados como meios nutritivos ou
seletivos e são utilizados e escolhidos consoante o objetivo pretendido. Os meios nutritivos permitem
o crescimento de todo o tipo de microrganismos, sendo o meio Nutrient Agar (NA) um exemplo. Os
meios seletivos permitem apenas o desenvolvimento de certas espécies, inibindo o crescimento de
outras, sendo o meio Manitol Salt Agar (MSA) e o meio MacConkey Agar dois exemplos.
O meio NA foi utilizado na primeira, segunda e quinta atividades: ubiquidade dos microrganismos,
técnica asséptica, flora microbiana; isolamento de microrganismos do solo; isolamento de uma cultura
pura, respetivamente. O meio MSA foi utilizado na primeira e na quinta atividade para o isolamento
de S. aureus. O meio MacConkey Agar foi empregado na atividade cinco para a obtenção de uma
cultura pura de uma gram-negativa (E.coli).

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 Para a realização dos procedimentos experimentais é necessário ter conhecimento de alguns
métodos: método de micropipetagem, método de assepsia por esterilização à chama, método
sementeira por espalhamento, a realização de diluições sucessivas e de alguns tipos de riscados.
O método da micropipetagem é fundamental em procedimentos microbiológicos que utilizam
volumes extremamente pequenos de soluções. Este baseia-se na utilização de micropipetas para
transferir um pequeno volume de solução para um local desejado. Existem micropipetas para
diferentes volumes, permitindo a seleção da mais adequada para o volume que pretendemos pipetar,
estas possuem pontas descartáveis para cada pipetagem que se realiza. Este método foi utilizado na
atividade 2: isolamento de microrganismos do solo.
O método de assepsia por esterilização à chama tem como finalidade evitar a contaminação do
meio de cultura ou dos materiais utilizados para determinado procedimento e é frequentemente
utilizado em laboratório, já que permite obter uma zona de estéril à volta da chama na qual se deve
trabalhar. Este é um procedimento muito importante em laboratório, visto que possibilita a
minimização dos riscos de infeção ou intoxicação. Este método foi utilizado na atividade 1: ubiquidade
dos microrganismos, técnica asséptica, flora microbiana; na atividade 2: isolamento de
microrganismos do solo; na atividade 4: observação microscópica de microrganismos: coloração de
Gram; e na atividade 5: isolamento de uma cultura pura, repicagem, meios seletivos.
O método de sementeira por espalhamento consiste no espalhamento uniforme de amostra sobre
toda a superfície do meio com uma Alça de Drigalsky de forma a que após serem incubadas se consiga
obter colónias individualizadas. Este espalhamento deve ser realizado em movimentos circulares por
toda a área placa de Petri. Este método foi utilizado na atividade 2: isolamento de microrganismos do
solo.
A elaboração dos riscados consiste na transferência de microrganismos para uma placa de petri,
recorrendo a uma ansa de inoculação ou uma zaragatoa. Assim, com a ponta do instrumento com
amostra risca-se toda a área da placa de Petri com movimentos em zig-zag ou de forma a formar um
quadrado – quadrante perfeito. Este método foi utilizado na atividade 1: ubiquidade dos
microrganismos, técnica asséptica, flora microbiana (com uma zaragatoa); e na atividade 5:
isolamento de uma cultura pura, repicagem, meios seletivos (ansa).
O método da diluição seriada consiste na execução de várias diluições sequenciais. Foi
especificamente, utilizado na atividade 2: isolamento de microrganismos do solo, com o principal
intuito de diminuir a carga microbiana na amostra.

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 3. Resultados Obtidos
Atividade 1: Ubiquidade dos microrganismos. Técnica asséptica. Flora microbiana.

Figura 1. Placa com meio NA – mãos sujas Figura 2. Placa com meio NA – mãos limpas

Figura 3. Placa com meio NA – telemóvel Figura 4. Placa com meio NA – maçaneta

Figura 5. Placa com meio NA – capa de borracha Figura 6. Placa de MSA - sem crescimento de S.aureus

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Atividades 2 e 3: Isolamento de microrganismos do solo e análise morfológica das colónias do solo.

Figura 7. Placa com meio NA - Microrganismos Figura 8. Placa com meio NA - Microrganismos
presentes no solo presentes no solo – 1º diluição

Figura 10. Placa com meio NA - Microrganismos

Figura 9. Placa com meio NA - Microrganismos presentes no solo – 3º diluição, identificação de duas
presentes no solo – 2º diluição colónias

Figura 11. Placa com meio NA - Microrganismos presentes no solo – 4º diluição

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 Atividade 4: Observação microscópica de microrganismos: Coloração de Gram.

Figura 13. Resultado coloração de Gram ao microscópio

Figura 12. Resultado coloração de Gram – lamina

Atividade 5: Isolamento de uma cultura pura. Repicagem. Meios seletivos.

Figura 14. Placa com meio NA – S.aureus Figura 15. Placa com meio NA – E.coli

Figura 16. Placa com meio NA – mix (S.aureus e E.coli)

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Figura 17. Placa com meio MSA - mix (S.aureus e E.coli) –
Figura 18. Placa com meio MaC – mix (S.aureus e E.coli) –
crescimento de S.aureus
crescimento de E.coli

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 4. Discussão de Resultados

Nesta secção do trabalho vamos apresentar uma discussão, com base nos resultados obtidos nas
aulas práticas de biologia microbiana.

Atividade 1: Ubiquidade dos microrganismos. Técnica asséptica. Flora microbiana.

Esta atividade teve como objetivo a perceção da presença de microrganismos nos objetos à nossa
volta, assim como no nosso corpo (nariz e mãos).
Na placa de meio MSA, na qual se cultivou microrganismos do nariz, esperava-se o
desenvolvimento de Staphylococcus aureus e, como consequência, houve-se uma mudança de cor do
meio, de carmim para amarelo, uma vez que esta espécie fermentaria o manitol presente no meio,
provando esta alteração. No entanto, identificou-se que esta situação não ocorreu, logo conclui-se
que não existe esta bactéria no nariz do indivíduo em estudo ou a técnica de retirada da amostra foi
mal-executada e, por isso, não foi verificada a presença da bactéria.
Já os resultados nas placas de meio NA relativas ao telemóvel e à capa da borracha foram os
esperados, exibindo uma grande e diversa flora bacteriana. No caso das placas relativas às mãos sujas
e mãos limpas, era expectável que a placa das mãos sujas apresentasse uma maior carga microbiana
do que a placa com as mãos higienizadas. Apesar disso, os resultados obtidos mostraram o contrário
e, como tal, foi elaborada uma hipótese que pode explicar este ocorrido que consiste na possível
presença de carga microbiana no papel-toalha utilizado para a secagem das mãos após a sua
higienização. Em relação à placa relativa à maçaneta, esta apresentou um nível muito baixo de carga
microbiana ao contrário do que era esperado, já que este é um objeto que se encontra em contato
com várias pessoas. No entanto, este resultado pode ser explicado pela possibilidade de a maçaneta
ter sido desinfetada no dia anterior.
Com esta atividade o grupo pôde observar uma das maiores características dos microrganismos
que é a sua ubiquidade, ou seja, estes encontram-se em todas as superfícies e ambientes.

Atividades 2 e 3: Isolamento de microrganismos e análise morfológica das colónias do solo.

No solo existe uma elevada concentração e diversidade de microrganismos, no entanto, as espécies

que se desenvolvem variam consoante o tipo de solo, o que permite uma comparação entres os
mesmos.
As atividades realizadas tiveram como objetivo o isolamento de colónias de microrganismos a
partir de diluições sucessivas de uma amostra de solo e o estudo das colónias obtidas.

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 De acordo com o procedimento utilizado, era esperado que quanto maior a diluição menor a carga
microbiana, o que foi observado na sequência de placas. Em seguimento, realizamos um estudo
morfológico de duas colónias presentes na placa correspondente à quarta diluição.
A colónia identificada como colónia 1 (imagem 10) apresentou-se, macroscopicamente, com cor
amarela, forma irregular, elevação papilada, margem filamentosa e uma cor mais intensa na zona de
elevação. Microscopicamente, verificou-se que esta apresenta, simultaneamente, uma margem
ondulada e filamentosa, assim como uma cor mais acastanhada no centro.
A colónia considerada como colónia 2 apresentou-se, macroscopicamente, com uma cor opaca,
forma rizoide, elevação plana e margem filamentosa. Devido a estas características, a colónia 2 pode
ser confundida com uma colónia de fungos, hipótese que foi excluída em aula com a observação ao
microscópio, onde esta apresentava filamentos em toda a sua área, uma margem e forma filamentosa.
Com esta análise colocamos em hipótese a possibilidade de esta ser uma colónia de Actinomicetos.

Atividade 4: Observação microscópica de microrganismos: Coloração de Gram.

A coloração de Gram é uma coloração diferencial, uma vez que permite dividir e classificar as
bactérias em dois grandes grupos: bactérias Gram-positivas e bactérias Gram-negativas. As primeiras
possuem uma parede celular com uma camada de peptidoglicano muito abundante, uma membrana
interna e uma baixa concentração de lipídios, enquanto as segundas apresentam uma fina camada de
peptidoglicano, uma elevada concentração de lipídios, uma membrana interna e uma externa
composta por LPS.
Esta coloração utiliza quatro reagentes: um corante primário (violeta de cristal); um mordente
(Lugol); um descorante (solução de álcool-acetona); um corante de contraste (safranina). Quando o
violeta de cristal se liga ao mordente forma-se um complexo insolúvel que permite a intensificação da
cor violeta e confere à bactéria resistência à descoloração. De seguida, o efeito do descorante vai
depender da composição lipídica das paredes celulares das bactérias: nas gram-positivas, a baixa
concentração de lipídios é dissolvida pela ação do álcool, formando pequenos poros na parede, no
entanto, estes são fechados de imediato impedindo a saída do corante, mantendo a cor roxa das
células; nas bactérias gram-negativas, a alta concentração de lipídios presentes na membrana externa
da parede celular é dissolvida pelo álcool formando grandes poros, que permitem a saída do violeta
de cristal, deixando as células incolores. Por fim, a aplicação da safranina vai colorir as Gram-negativas
de rosa e não terá efeito nas Gram-positivas.
A coloração foi realizada numa cultura pura de Escherichia coli, uma bactéria Gram-negativa e,
como esperado, através da observação sob microscópio, foi verificado que a bactéria em estudo

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adquiriu uma coloração vermelha, indicadora deste grupo de bactérias. Através da observação no
microscópio foi, também, possível verificar que a colónia de Escherichia coli que foi testada era pura
ou constituída apenas por bactérias Gram-negativas, uma vez que nenhuma foi tingida pelo violeta de
cristal.

Atividade 5: Isolamento de uma cultura pura. Repicagem. Meios seletivos.

A realização desta atividade teve como objetivo a obtenção de duas culturas puras de E.coli, duas
de S. aureus e uma cultura não pura, em meio NA, que consistiu no crescimento das duas espécies
anteriormente mencionadas (5 placas). Uma cultura de cada espécie foi obtida, com recurso a meios
seletivos, a partir de uma mistura líquida entre as mesmas: para a cultura de E.coli utilizou-se o meio
MacConkey Agar que permite o crescimento de bactérias Gram – negativas; para a cultura de S. aureus
recorreu-se a um meio MSA que possibilita o crescimento de Gram – positivas. A segunda placa de
cada espécie foi realizada em meio NA e foi obtida a partir da repicagem de culturas puras das
respetivas colónias. É importante mencionar que foram utilizados dois tipos de riscado: riscado em
zig-zag e riscado por quadrante repetido. Este último foi realizado no meio MacConkey Agar e teve
como objetivo reduzir a carga microbiana que iria desenvolver-se na placa, tal foi comprovado.
Com a observação dos resultados obtidos observou-se que no meio NA que continha a mistura das
duas espécies ocorreu o crescimento de ambas as bactérias, uma vez que este é um meio nutritivo e
não seletivo; o meio MacConkey Agar passou de acastanhado para vermelho, o que indica que houve
crescimento bactérias Gram-negativas, ou seja, apenas colónias de Escherichia coli se desenvolveram;
o meio MSA passou de carmim para amarelo o que indica que ocorreu fermentação do manitol, logo
obteve-se desenvolvimento de Staphylococcus aureus. A seletividade destes meios explica o porquê
de se obterem culturas diferentes a partir de uma mesma amostra inicial.
Para as colónias obtidas a partir da repicagem de placas puras anteriormente elaboradas, os
resultados observados foram o crescimento de E.coli e S. aureus nas respetivas caixas de Petri. Assim,
foi possível a obtenção de mais duas colónias puras, apesar de se ter seguido um procedimento
diferente.
Em suma, obteve-se várias culturas puras, através do seu isolamento em meios diferentes,
utilizando, por exemplo, a técnica de repicagem.

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 5. Conclusão

Com o elaborar do presente relatório foi possível compreender a presença dos microrganismos em
diversas superfícies, observando assim, a sua ubiquidade; verificar a grande variedade destes
organismos no solo assim como, as características morfológicas de algumas colónias presentes no
mesmo. Compreendeu-se, também o método da coloração de Gram, com o qual foi possível confirmar
que a bactéria Escherichia coli é uma bactéria gram-negativa, ao apresentar coloração vemelha/rosa
ao microscópio.
Com estas atividades experimentais adquiriu-se conhecimentos sobre meios seletivos e nutritivos,
com o qual foi possível cultivar colónias puras de E. coli e S. aureus, a partir de uma amostra mista,
assim como uma placa com vários tipos de colónias na análise dos microrganismos presentes no solo.
Para além dos meios, foi aprendido e compreendido o procedimento para elaborar os riscados,
assim como o método de esterilização à chama.

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 6. Referências Bibliográficas

1. OLIVEIRA, Carla. Técnica Asséptica (09/11/2022)

2. OLIVEIRA, Carla. Isolamento microrganismos do solo (10/11/2022)
3. OLIVEIRA, Carla. Análise morfológica das colónias (10/11/2022)
4. OLIVEIRA, Carla. Coloração de Gram (10/11/2022)
5. OLIVEIRA, Carla. Isolamento cultura pura (10/11/2022)
Apontamentos das aulas práticas-laboratoriais da unidade curricular de Biotecnologia Microbiana

7. Bibliografia de Imagens

Imagem da capa:
http://www.ceuma.br/mestradobiologiamicrobiana/images/areasdeconcetrancao.jpg (13/11/2022)

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