Instituto Politécnico do Porto

Escola Superior de Saúde do Porto

Colorações

Alunos:

1. Inês Salgado Teixeira

2. Inês Sousa Soares

3. João Pacheco Dias

4. Matilde Pereira de Morais

5. Miguel Santos Carvalhos

Turno: B Grupo:2

Ano letivo 2022/2023

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Relatório de Biologia Microbiana

Licenciatura de Biotecnologia Medicinal

Unidade Curricular Biologia Microbiana
Professora: Carla Oliveira

Alunos:
Inês Salgado Teixeira
Inês Sousa Soares
João Pacheco Dias
Matilde Pereira de Morais
Miguel Santos Carvalhos
Turma: B Grupo:2

Porto, 14 de dezembro de 2022

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 Índice

1. Introdução 6
2. Introdução Teórica 7
3. Resultados Obtidos 10
4. Discussão de Resultados 13
5. Conclusão 16
6. Referências Bibliográficas 17
7. Bibliografia de Imagens 17

Índice de Ilustrações

Figura 1. Coloração de Gram – lâmina .......................................................................................... 10

Figura 2. Resultado coloração de Gram ao microscópio com a objetiva 100X ................................. 10
Figura 3. Resultado da coloração de Ziehl-Neelsen ao microscópio com a objetiva 100X ................. 10
Figura 4. Coloração da cápsula – lâmina ....................................................................................... 11
Figura 5. Resultado da coloração da cápsula ao microscópio com a objetiva 100X .......................... 11
Figura 6. Placa com meio LA – B. cereus ....................................................................................... 11
Figura 7. Resultado da coloração de esporos ao microscópio com a objetiva 100X ......................... 11
Figura 8. Leveduras a fresco a microscópio com a objetiva 100X .................................................... 12
Figura 9. Resultado da coloração de leveduras ao microscópio com a objetiva 100X ....................... 12

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 1. Introdução

Este relatório foi elaborado no âmbito da unidade curricular de Biologia Microbiana e encontra-se
dividido em quatro partes, uma introdução ao trabalho, uma introdução teórica com a descrição das
técnicas e meios utilizados, a apresentação dos resultados e, por último, uma discussão dos mesmos.

Neste trabalho vão ser abordadas cinco colorações de microrganismos, desenvolvidas durantes as
aulas:
● Coloração de Gram.
● Coloração de Ziehl-Neelsen.
● Coloração de esporos.
● Coloração de cápsula.
● Coloração simples e a fresco de leveduras.

Estas atividades tiveram como objetivo:

● Determinar o tipo de parede celular das bactérias.

● Determinar se as bactérias são resistentes ao álcool.
● A observação de esporos.
● Observar e identificar a cápsula de bactérias.
● Observar uma preparação de leveduras com e sem corante, e comparar os resultados
observados.

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 2. Introdução Teórica

Em microbiologia, uma coloração é uma técnica utilizada para diferenciar, identificar ou

caracterizar diferentes microrganismos ou estruturas presentes nestes, através da exibição ou não de
uma cor. A cor é atribuída com base nas propriedades químicas, físicas e morfológicas dos
microrganismos. Existem diferentes tipos de colorações, como por exemplo, a coloração de Gram, e
Ziehl-Neelsen, da cápsula, de esporos e de leveduras. Cada uma destas colorações afirma, com base
nas observações ao microscópio, se um determinado microrganismo apresenta ou não a propriedade
a estudar/observar.

As colorações têm uma grande importância na saúde e na ciência. Ajudam na identificação de

bactérias, assim como no diagnóstico de doenças, e na evolução da ciência, podendo levar ao
descobrimento de novos microrganismos e estirpes.

A coloração de Gram é uma coloração diferencial, uma vez que permite dividir e classificar as
bactérias em dois grandes grupos: bactérias Gram-positivas e bactérias Gram-negativas. As primeiras
possuem uma parede celular com uma camada de peptidoglicano muito abundante, uma membrana
interna e uma baixa concentração de lipídios, enquanto as segundas apresentam uma fina camada de
peptidoglicano, uma elevada concentração de lípidos, uma membrana interna e uma externa
composta por LPS.

Esta coloração utiliza quatro reagentes: um corante primário (violeta de cristal); um mordente
(Lugol); um descorante (solução de álcool-acetona); um corante de contraste (safranina). Quando o
violeta de cristal se liga ao mordente forma-se um complexo insolúvel que permite a intensificação da
cor violeta e confere à bactéria resistência à descoloração. De seguida, o efeito do descorante vai
depender da composição lipídica das paredes celulares das bactérias: nas gram-positivas, a baixa
concentração de lípidos é dissolvida pela ação do álcool, formando pequenos poros na parede, no
entanto, estes são fechados de imediato impedindo a saída do corante, mantendo a cor roxa das
células; nas bactérias gram-negativas, a alta concentração de lípidos presentes na membrana externa
da parede celular é dissolvida pelo álcool formando grandes poros, que permitem a saída do violeta
de cristal, deixando as células incolores. Por fim, a aplicação da safranina vai colorir as Gram-negativas
de rosa e não terá efeito nas Gram-positivas.

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 A coloração de Ziehl-Neelsen é uma técnica mais agressiva em comparação com a coloração de
Gram, aplicada a bactérias que não são bem coradas com esta última técnica. Esta permite a distinção
entre células que são ácido-álcool-resistentes e as que não apresentam esta propriedade. Bactérias
ácido-álcool-resistentes são células resistentes à coloração, mas uma vez coradas, resistem à sua
descoloração, mesmo quando submetidas a lavagens com ácidos fortes diluídos e álcool. Os géneros
Mycobacterium e Nocardia são exemplos de bactérias que apresentam esta propriedade.

Esta propriedade deve-se à existência de compostos lipídicos ao nível das estruturas de superfície das
bactérias, mais especificamente na parede celular, que causam uma grande hidrofobicidade,
dificultando a ação dos corantes.

Nesta técnica, todas as células são inicialmente coradas com a fucsina exibindo uma coloração
vermelha e, posteriormente, são submetidas à lavagem alternada com descolorante e água. Como
resultado poderá se observar células coradas de vermelho/rosa e, que por isso se mostram resistentes
à solução ácida, e outras incolores que, em oposição, não são resistentes à solução e, por isso,
perderam a sua cor. No final da coloração, utiliza-se um corante de contraste, azul de metileno, que
apenas irá colorar as células não álcool-ácido-resistentes.

A presença da cápsula numa bactéria pode ser verificada através de uma coloração negativa, ou
seja, o corante não penetra na cápsula e, portanto, é exibido um contraste entre a estrutura e o meio
escuro envolvente. A coloração da cápsula é difícil de elaborar, pois os materiais capsulares são
solúveis em água e podem ser removidos durante a lavagem. Normalmente, para executar esta
técnica utiliza-se tinta-da-china como corante negativo.

Os esporos são estruturas de resistência bacteriana que permitem que estas resistam, durante
grandes intervalos de tempo, a condições ambientais adversas. Certos géneros são conhecidos por
possuírem esta capacidade como, por exemplo, Bacillus, Clostridium e Sporosarcina.

A temperatura aplicada a esta técnica é fundamental, uma vez que a composição complexa dos
esporos impede a entrada da maioria dos corantes e, por isso, os esporos não mancham com cores
convencionais. A coloração com o corante verde malaquite e a fixação por calor permite a observação
destas estruturas ao microscópio e é denominada por coloração de esporos.

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 A Coloração de leveduras permite, muito facilmente identificar, numa certa cultura, quais
leveduras são viáveis e quais não são viáveis. Esta determinação é possível de ser elaborada através
da aplicação do azul de metileno que cora os organismos não viáveis de azul, enquanto os viáveis
permanecem incolores.

Para a identificação das leveduras ao microscópio, foram realizadas duas colorações, a coloração
simples e a coloração a fresco. Na coloração simples utilizou-se uma cultura sólida de leveduras
dissolvidas numa gota de água, com calor fixou-se as mesmas e com corante azul de metileno coloriu-
se as leveduras de azul. A coloração a fresco consistiu em pipetar leveduras de um meio líquido para
uma lâmina, cobrir com uma lamela e observar a mesma.

Para a realização dos procedimentos experimentais é necessário ter conhecimento de alguns

métodos: método de micropipetagem, método de assepsia por esterilização à chama e método do
esfregaço.

O método da micropipetagem é fundamental em procedimentos microbiológicos que utilizam

volumes extremamente pequenos de soluções. Este baseia-se na utilização de micropipetas para
transferir um pequeno volume de solução para um local desejado. Este método foi utilizado na
coloração de leveduras a fresco.

O método de assepsia por esterilização à chama tem como finalidade evitar a contaminação do
meio de cultura ou dos materiais utilizados, já que permite obter uma zona estéril à volta da chama
na qual se deve trabalhar. Este é um método muito importante, logo, foi utilizado em todas as
colorações.

O método do esfregaço consiste em espalhar uma pequena quantidade de carga microbiana sobre
uma lâmina de vidro de forma a haver dissociação de alguns elementos e sequente aderência destes
ao vidro. Este método foi utilizado na coloração das cápsulas.

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 3. Resultados Obtidos
Atividade 1: Coloração de Gram

Figura 1. Coloração de Gram – lâmina Figura 2. Resultado coloração de Gram ao microscópio

(foto de autor) com a objetiva 100X
(foto de autor)

Atividade 2: Coloração de Ziehl-Neelsen

Figura 3. Resultado da coloração de Ziehl-Neelsen ao microscópio com a objetiva 100X

(foto de autor)

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Atividade 3: Coloração da cápsula

Figura 4. Coloração da cápsula – lâmina Figura 5. Resultado da coloração da cápsula ao microscópio

(foto de autor) com a objetiva 100X
(foto de autor)

Atividade 4: Coloração de esporos

Figura 6. Placa com meio LA – B. cereus Figura 7. Resultado da coloração de esporos ao microscópio
(foto de autor) com a objetiva 100X
(foto de autor)

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Atividade 5: Coloração simples e a fresco de leveduras

Figura 8. Leveduras a fresco a microscópio com a Figura 9. Resultado da coloração de leveduras ao microscópio
objetiva 100X com a objetiva 100X
(foto de autor)
(foto de autor)

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 4. Discussão de Resultados

Nesta secção do trabalho vamos apresentar uma discussão, com base nos resultados obtidos nas
aulas práticas de biologia microbiana.

Atividade 1: Coloração de Gram

A coloração de Gram foi realizada numa cultura pura de Escherichia coli, uma bactéria Gram-
negativa e, como esperado, através da observação sob microscópio, foi verificado que a bactéria em
estudo adquiriu uma coloração vermelha, indicadora deste grupo de bactérias. Através da observação
ao microscópio foi, também, possível verificar que a colónia de Escherichia coli que foi testada era
pura ou constituída apenas por bactérias Gram-negativas, uma vez que nenhuma foi tingida pelo
violeta de cristal, característico das bactérias Gram-positivas.

Atividades 2: Coloração de Ziehl-Neelsen

Algumas espécies de bactérias não coram com facilidade com colorações comuns, porém por
aquecimento e com carbolfucsina estes microrganismos podem ser corados. É por esta razão que a
coloração de Ziehl-Neelsen é tão importante. A carbolfucsina é uma mistura de fucsina básica, corante
e fenol, que, quando adicionada e em contato com o calor, cora as células.

Nesta atividade laboratorial foi utilizada uma quantidade de massa bacteriana de uma cultura de
Mycobacterium em meio sólido, onde ocorreram dois pontos críticos que foram realizados com
elevada atenção: colocação de quantidade suficiente de corante para que este não secasse durante a
passagem da mecha de algodão em chama e a passagem desta mexa só até a emissão de fumos
brancos. Com os resultados obtidos e após observação ao microscópio na objetiva de 100X,
conseguimos identificar que os microrganismos presentes na lâmina eram ácido-resistentes devido à
sua coloração vermelha.

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Atividade 3: Coloração da cápsula/coloração negativa

Nem todos os microrganismos apresentam cápsula na sua composição, sendo este um dos fatores
que permite distinguir microrganismos. A coloração começa por dissolver uma pequena quantidade
de carga microbiana, neste caso de Enterobacter aerogenes, numa gota de tinta-da-China, e espalhar
essa mesma gota sobre a área da lâmina, com a ajuda de outra, elaborando um esfregaço. Este é o
processo mais importante, uma vez que um esfregaço mal realizado pode levar a um amontoamento
da carga microbiana e a zonas da lâmina mal corada.
Ao observar a amostra na objetiva 100X, foi difícil identificar as cápsulas uma vez que esta é uma
coloração que, para quem não está habituado, é complicado distinguir as cápsulas da superfície mal
tingida da lamina. Para além disso, os espaços onde não existiam cor também podem ser devidos a
um esfregaço mal realizado.

Atividade 4: Coloração de esporos

Os esporos têm uma estrutura complexa constituída por várias camadas altamente resistentes,
estas sendo bastante resistentes à coloração. Para romper essa barreira, e assim conseguir analisar o
esporo, é necessário mais tempo de exposição ao corante.

Nesta atividade laboratorial foi utilizada uma quantidade de massa bacteriana de uma cultura em
meio sólido Bacillus Cereus com um 1 mês de desenvolvimento, ou seja, libertando mais esporos, o
que facilita a sua observação.

A amostra de cultura foi corada com verde de malaquite e, posteriormente, aquecida com ajuda
de uma mecha ardente e deixou-se repousar por cerca de 10 minutos. De seguida, a amostra foi
observada a microscópio na objetiva de X100, onde conseguimos identificar, efetivamente, a presença
de esporos. Além dos esporos, foi possível ainda observar alguns bacilos livres e em cadeias, propondo
que nem todas as bactérias formaram esporos.

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Atividade 5: Coloração simples e a fresco de leveduras

Nesta atividade laboratorial, a levedura em estudo foi a Saccharomyces cerevisiae, utilizada na

produção do pão e da cerveja.
Para a identificação das leveduras ao microscópio, foram realizadas duas colorações, a coloração
simples e a coloração a fresco. As diferenças entre as duas colorações encontram-se na preparação
das amostras.
Ao observar a preparação com coloração a fresco na objetiva 100X, é possível verificar mesmo com
dificuldade, algumas leveduras em pequenas quantidades, distinguíveis pelas suas paredes verdes. Já
na preparação com coloração simples, são observadas muitas células azuis que se tratam de leveduras
não viáveis, assim como células translúcidas rodeadas de uma parede azul, em pequenas quantidades,
que são leveduras viáveis e que sobreviveram ao processo de flamejado. Com isto verificamos que a
Saccharomyces cerevisiae tem uma particular fragilidade ao calor.
Concluindo, verifica-se que a coloração que permite uma melhor observação das leveduras é a
coloração simples com azul de metileno, uma vez que através deste método é possível distinguir as
leveduras viáveis e não viáveis. No entanto, este implica um cuidado acrescentado com a exposição
ao calor a que são submetidas as mesmas.

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 5. Conclusão

Ao elaborar as várias colorações foi possível identificar o tipo de parede celular de uma colónia de
E.coli com a coloração de Gram, e ainda confirmar que esta tratava-se de uma colónia pura. Com a
coloração de Ziehl-Neelsen, foi possível descobrir que a bactéria utilizada é álcool-ácido-resistente,
uma vez que apresentou uma cor vermelha quando observada ao microscópio. Para a observação da
cápsula, foi utilizada a coloração negativa, na qual, sendo uma preparação difícil de preparar e de
observar, foi complicado identificar os espaços em branco observados no microscópio. Tal pode ter
acontecido, porque estes espaços brancos podem não ser apenas cápsulas, mas locais onde a
superfície da lamina não foi bem tingida. Na coloração de esporos, foi possível observar os esporos
produzidos pelo B. cereus, uma vez que estes apresentam uma cor verde após a coloração. Na
coloração simples e a fresco conseguiu-se observar uma preparação de leveduras com e sem corante
e comparar os resultados obtidos em cada uma, tendo-se chegado a uma conclusão de que a coloração
simples foi a que apresentou uma melhor observação das leveduras, permitindo a identificação da
viabilidade das leveduras.
Para concluir, foi possível atingir todos os objetivos pretendidos em cada aula prática de Biologia
Microbiana, assim como alargar o nosso conhecimento pelos vários tipos de colorações e como
realizá-los.

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 6. Referências Bibliográficas

1. OLIVEIRA, Carla. Coloração de Gram (03/12/2022)

2. OLIVEIRA, Carla. Coloração de Ziehl-Neelsen (03/12/2022)
3. OLIVEIRA, Carla. Coloração dos esporos (03/12/2022)
4. OLIVEIRA, Carla. Coloração da cápsula (03/12/2022)
5. OLIVEIRA, Carla. Coloração simples e a fresco leveduras (03/12/2022)
Apontamentos das aulas práticas-laboratoriais da unidade curricular de Biologia Microbiana

7. Webgrafia de Imagens

Imagem da capa: https://kasvi.com.br/bacteria-gram-positiva-gram-negativa/

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