UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA

FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE BIOLOGÍA

LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

PRÁCTICA N0 2

Integrantes:
● Carrasco Ramos, Kayla Milagros (20160431)
● Cuadros Olarte, Ronaldiño (20160434)
● Gomez Coila, Jorge Antonio (20160398)
● Macedo Quilca, Sebastian (20160450)

Grupo (día/hora): F* - Viernes – 11:00 a.m. a 1:00 p.m.

Fecha de la práctica: 12-04-19
Fecha de entrega del informe: 26-04-19

2019-1

1. INTRODUCCIÓN
En el mundo que nos rodea, existen organismos que el ojo humano es incapaz de ver.
Estos son llamados microorganismos, seres con tamaños que varían desde los 0.3 μm de
diámetro a más.
Afortunadamente el hombre encontró la manera de observarlos gracias a la microscopia,
aunque esto solo sirvió en un principio para ver microorganismos pigmentados, pues su
color añadía contraste y mejoraba la visualización de las células. Aquellas células que
carecían de pigmentación solo fueron posibles de ver gracias al uso de colorantes. Desde
1770 se vienen utilizando coloraciones simples, a partir de 1807 coloraciones compuestas
en investigaciones biológicas. Pero ¿Cómo logran teñir los colorantes? los colorantes
penetran las células por ósmosis, dando contraste a estructuras biológicas que de por sí
solas no las tienen. De acuerdo a la reacción que ocurre, existen diferentes tipos de tinción:
Las tinciones se pueden clasificar como simples cuando toda la muestra se tiñe del mismo
color y se utiliza un solo colorante (azul de lactofenol o tinta china); tinción diferencial,
cuando se visualiza más de un color porque se utiliza más de un colorante (Gram o Ziehl-
Neelsen); tinción específica, cuando se utilizan anticuerpos marcados con una molécula
fluorescente para identificar una estructura celular en particular (inmunocitoquímico). En
esta práctica nos enfocamos en el uso de la tinción diferencial, en particular la tinción de
Gram, denominada así por el bacteriólogo danés Hans Christian Gram, quien la desarrolló.
Sobre la base de su reacción a la tinción de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos
grupos, Gram-positivas y Gram-negativas. Debido a su importancia en taxonomía
bacteriana y a que indica diferencias fundamentales de la pared celular de las distintas
bacterias.

2. MATERIALES Y MÉTODOS

MATERIALES :
● 3 Laminas porta objeto
● Cultivos (Bacilus , Stafilococcus , E. coli)
● Asa de kolle
 ● Mechero de alcohol
● Microscopio
● Aceite de Inmersión
● Colorantes básicos: cristal violeta , safranina
● Lugol , decolorante
● Piseta de agua

MÉTODOS :

Colocar una gota de agua sobre cada porta objeto y con la

ayuda de la asa de kolle colocar sobre la gota una diminuta
cantidad del cultivo .

Distribuir la gota cargada con la muestra en

la lámina hasta formar una pequeña
película delgada.

Secar la lámina para poder fijarla a una distancia

moderada.

Colocar las láminas fijadas de bacterias sobre

el soporte de tinción.

Agregar gotas (suficiente para cubrir la muestra fijada)

7
de cada colorante, dejando que actúen por 30 segundos
el cristal violeta , 60 segundos el lugol , 20 segundos el
decolorante y 30 segundos la safranina (siempre enjua-
gando y secando la muestra).
 Observar en el microscopio en 4x, 10x y 40x. Finalmente con

3.RESULTADOS:

La tinción Gram permite diferenciar a las bacterias en Gram positivas y negativas:

Se observó que la bacteria Bacillus sp con el método de tinción diferencial de gram, esta se
tiñó de violeta, por lo tanto se trataría de una Gram +.

Fig. 1. Muestra fijada de Bacillus sp. Se tiñó de violeta , Gram +

Fuente: Elaboración propia.

En cuanto al Streptococcus sp. aplicando el mismo método con de tinción diferencial de

gram, esta se tiñó de violeta, por lo tanto se trataría de una Gram +.
 Fig.2. Muestra fijada de Streptococcus sp. Se tiñó de violeta, Gram +
Fuente: Elaboración propia.

En la Escherichia coli con el método de tinción diferencial de gram, esta se tiñó de rojo, por
lo tanto se trataría de una Gram -.

Fig. 3. Muestra fijada de Escherichia coli, Se tiñó de rojo, Gram -

Fuente: Elaboración propia.

4. DISCUSIONES

Existen factores que pueden influir en la tinción de las bacterias como una excesiva
decoloración. Otro factor en que las bacterias Gram positivas se observan parcial o
completamente rosadas, es la edad del cultivo; las células viejas tienden a perder su
capacidad de retener el complejo cristal violeta-yoduro y por lo tanto las bacterias se verán
rosados. Otro factor de variabilidad podría ser condiciones de estrés durante el cultivo, que
genera formas Gram negativas no viables, dentro de un cultivo de células Gram positivas.
(Rodríguez, 2006).

Mediante el uso de un microscopio de fuerza atómica se pudo determinar que E. coli tan
solo tiene de una a tres capas de peptidoglucano (Goldman & Green, 2015). Esta capa
delgada es la que no puede retener el colorante primario: cristal violeta. Una vez que se
agrega el alcohol cetona, todo este colorante es retirado, ya que se puede filtrar a través del
poco peptidoglucano que poseen las bacterias E. coli. De esta manera, la bacteria sólo se
tiñe con el último colorante, la safranina. El resultado es una tinción roja que determina que
la bacteria es una Gram negativa.

En la muestra de Bacillus sp no se puede diferenciar notablemente las endosporas. esto se

puede deber a que las bacterias se encontraban en la etapa II o III de la formación de estas
estructuras. Esta fase da lugar a la creación de dos compartimientos, de la célula más
grande de la madre y del foresporo más pequeño, ambas tendrán diferentes destinos de
desarrollo. El foresporo será, luego de completar la etapa IV, la endospora (Macedo, 2006).
Sin embargo se puede ver fácilmente que se trata de una bacteria Gram positivo por el
característico color violeta de la muestra.

5.CONCLUSIONES

En esta práctica aprendimos a diferenciar una bacteria Gram positiva de una Gram
negativa, ya que con ayuda de la tinción de Gram se logró observar un factor muy
importante como por ejemplo la obtención de los mismos obteniendo color violeta y rojo
respectivamente.

6. BIBLIOGRAFÍA

Goldman, E., & Green, L. (2015). Practical Handbook of Microbiology. New York: TAYLOR &
FRANCIS GROUP.

Macedo M., Vola M.(2006) Principales grupos de bacilos Gram positivo aerobios.
En: Temas de bacteriología y virología médica. (2a. ed.) Uruguay: FEFMUR

Rodríguez, E., Gamboa, M., Hernández, F., y García, J.(2006).Bacteriología

General: Principios y prácticas de laboratorio.Costa Rica:UNIVERSIDAD DE COSTA
RICA.

Madigan, M. T., Martinko, J. M., y Parker, J. Brock Biología de los Microorganismos.

10ª edición. Prentice-Hall. Madrid, 2003.