Aluna: Érica Grangeia (2019126964)

Docentes: Ana Paula Chung e Rita Branco

Disciplina: Microbiologia I
Licenciatura em Saúde Ambiental
Ano letivo: 2019/2020

Relatório de aula prática

Tema: “Coloração de Gram” e “Coloração de Endósporos”

Introdução:

Objetivo:
- distinguir as bactérias de Gram (+) e Gram (-);
- observar a forma celular das bactérias;
- visualizar os endósporos formados no interior das células.

Material:
- solução de cristal violeta;
- solução de iodo de gram;
- solvente etanol/acetona;
- solução de safranina;
- solução de verde malaquite (5%);
- 3 lâminas;
- micropipeta (V = 10 μL);
- bactéria Serratia (Gram -) e bactéria Arthrobacter (Gram +);
- endósporo Bacillus megaterium;
- bico de Bunsen;
- ança;
- 3 molas de madeira;
- panela com água a ferver;
- torneira com água;
- papel absorvente;
- óleo de imersão;
- microscópio.

Procedimentos:

1a Parte: Procedimento inicial

1. Lavagem das mãos e desinfeção da bancada de trabalho com álcool.

2. Técnica do esfregaço:
i. Com a ajuda da micropipeta, colocar pequena quantidade de água estéril nas 3
lâminas;
ii. Acender o bico de Bunsen na chama de trabalho;
 iii. Com a ança, retirar material da bactéria Serratia de modo a preencher o loop e,
esfregá-la na lâmina previamente preparada. Repetir o mesmo procedimento na
Arthrobacter e no Bacillus megaterium;
iv. Passar cada lâmina várias vezes na chama, com a ajuda de uma mola, de modo a
remover toda a água anteriormente adicionada e secar todas as bactérias,
fixando-as na lâmina.

2a Parte: Coloração de Gram

1. Cobrir o esfregaço da gram (+) e gram (-) com o corante cristal violeta, e deixar
aturar durante 1 minuto. Enxaguar as preparações em água corrente.
2. Cobrir, novamente, o esfregaço da gram (+) e gram (-) com o iodo durante 1 minuto.
Enxaguar as preparações em água corrente.
3. Lavar as lâminas com o solvente etanol/acetona por 30 segundos, para permitir a
sua distinção. Enxaguar as preparações em água corrente.
4. Adicionar o corante safranina e deixar aturar durante 1 minuto. Lavar um pouco com
água corrente e deixar secar em papel absorvente.
5. Colocar uma gota de óleo em cada lâmina e visualizá-las ao microscópio com uma
ampliação de 100x.

3a Parte: Coloração de Endósporos

1. Colocar um suporte com água a ferver por baixo, a lâmina que apresenta o
endósporo. De seguida, corar o esfregaço com o verde malaquite cobrindo-o
completamente, durante 5 minutos.
2. Após o tempo ter terminado, retirar da água a ferver e enxaguar um pouco por água
corrente.
3. Adicionar o corante safranina e deixar aturar durante 1 minuto. Lavar um pouco com
água corrente e deixar secar em papel absorvente.
4. Colocar uma gota de óleo na lâmina e visualizá-la ao microscópio com uma
ampliação de 100x.

Resultados:

Figura 1 – bactérias gram positivas, Figura 2 – bactérias gram negativas,

observados a microscópio. observados a microscópio.

Figura 3 – endósporos, observados a microscópio.

Discussão de resultados:

As bactérias gram positivas apresentam uma camada espessa de peptidoglicano,

mas não uma membrana externa. Significa que, não há remoção das células do complexo
formado com o cristal violeta e o iodo e, a adição da safranina não teve grande impacto pois
não houve a tal remoção do complexo. Assim, a cor no final da coloração será roxa, como
está representado na figura 1. Para além disso, observa-se a forma celular das bactérias,
conseguindo distinguir os coccos e os bastonetes.
Por outro lado, as bactérias gram negativas apresentam uma membrana externa e
uma camada de peptidoglicano fina. Então, na etapa em que há a adição do solvente
etanol/acetona, o complexo formado pelo cristal violeta e iodo é removido das células, ou
seja, há uma descoloração nas gram negativas. Assim, quando se adiciona a safranina, as
bactérias ficam com a cor vermelha da mesma, como está representado na figura 2. Além
disso, conseguimos identificar que as bactérias são bastonetes.
Relativamente à coloração de endósporos, foi utilizado o corante verde de malaquite
que é um corante específico para os endósporos. A figura 3 apresenta uma imagem
microscópica dos endósporos, esta demonstra onde se encontram os endósporos, formados
dentro do interior da célula, e as células vegetativas. O resultado foi devido ao uso da
safranina pois esta, sendo de cor vermelha, o seu contraste com o verde de malaquite é
bastante notório. Adicionalmente, há um aglomerado de células vegetativas, como está a
seta preta a indicar, sem poder ver os endósporos no interior das células isto significa que,
ou o esfregaço foi muito forte, acabando por romper as células, ou a membrana e a parede
estavam fragilizadas. ê

Conclusão:

A coloração de Gram deve-se unicamente à espessura da parede bacteriana, isto é,

se a camada de peptidoglicano for espessa (gram positivas), conseguem reter o complexo
formado pelo cristal violeta e o iodo de gram. Se a camada de peptidoglicano for fina (gram
negativas), haverá descoloração das células pois não tem capacidade de reter o complexo.
Concluindo que as bactérias de gram positivas são capazes de formar estruturas de
resistência como os endósporos.
Na coloração de endósporos ...

http://www.provida.ind.br/site/index.php/bacterias/bacterias/122-tecnica-de-gram.html
https://www.infoescola.com/bioquimica/coloracao-de-gram/