1.

0 - BIOSSEGURANÇA EM LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA

A biossegurança no laboratório pode ser traduzida como um conjunto de
práticas, equipamentos e instalações voltadas para a prevenção, minimização
ou até eliminação de riscos inerentes às atividades realizadas no ambiente de
trabalho, pensando em preservar a saúde dos colaboradores, o meio ambiente
e a qualidade dos trabalhos desenvolvidos.

1.1 - NORMAS DE SEGURANÇA PARA AS AULAS PRÁTICAS DE

MICROBIOLOGIA CLÍNICA
- É indispensável o uso de avental no laboratório, que deve ser comprido, de
mangas compridas e estar abotoado e limpo;
OBS – Alunos sem jaleco não poderão assistir às aulas.
- Cabelos longos devem ser amarrados de modo a não interferir com reagentes
e equipamentos. - Utilizar sapatos fechados. OBS – Alunos de sandálias u
chinelos não poderão permanecer no laboratório.
- Evitar o uso de lentes de contato;
- Não fumar, não comer, não beber; evitar tocar a boca e outras mucosas ou
pele.
- O Material pessoal (bolsas cadernos, mochilas, agasalhos, etc.) deve ser
mantido longe das bancadas de trabalho. Utilizar na bancada somente o material
necessário ao trabalho prático, como: roteiro de aula, papel e lápis ou caneta
para anotações;
- Antes de iniciar o trabalho assegure-se de que tem, à mão, todo o material
necessário
- Ler atentamente o protocolo da aula prática e não iniciar o trabalho antes de ter
certeza sobre o que fazer, a cada passo;
- É obrigatório a descontaminação da bancada no começo e no fim do trabalho
com solução de álcool 70% ou outra similar (verifique se o bico de Bunsen está
aceso);
- Cuidado com a chama do bico de Bunsen, que deverá estar acesa durante a
maior parte do tempo; OBS: A utilização do Bico de Bunsen é essencial pois visa
a diminuição de microrganismos no campo de trabalho através do calor. Para
isto ele apresenta regulagem que torna possível selecionar o tipo de chama ideal
para o trabalho. No caso da microbiologia deve ser usada a chama azul porque
esta atinge a maior temperatura e não forma fuligem. É importante ressaltar que
a chama apresenta diferentes zonas, e tal fato é importante para que o processo
de flambagem seja executado adequadamente, já que certas zonas da chama
devem ser evitadas. As zonas da chama são: Zona Neutra (zona fria e, portanto,
não deve ser utilizada na flambagem), zona redutora e zona oxidante (zonas
onde já ocorrem a combustão e, portanto, já podem ser usadas para a
flambagem).

FIGURA 1: Bico de Bunsen.

FONTE: Google imagens.

- Todo o material deve ser devidamente identificado; - Utilizar corretamente as
técnicas de manuseio de culturas microbianas;
- Não falar durante o manuseio das culturas, para minimizar o risco de
contaminação das mesmas;
- Relatar imediatamente, ao professor ou técnico, qualquer evento, acidente ou
imprevisto;
- Colocar materiais contaminados recipientes próprios, existentes nos
laboratórios;
- Deixar as Placas de Petri tampadas sobre a bancada;
- Deixar as lâminas fornecidas para visualização sobre as bancadas; - Deixar os
tubos com culturas nas estantes;
- Depois de usar o microscópio, desligar a luz e limpar a objetiva com lenço de
papel fino para retirar o óleo de imersão;
- Quando terminar de trabalhar com culturas, esterilizar alças e fios de platina;
retirar as luvas e descartá-las em lixo infectante, lavar as mãos em água corrente
e depois com álcool 70% ou similar; deixar secar ao ar;
- O lixo deverá ser adequadamente acondicionado e todo material contaminado
deve ser autoclavado para descontaminação antes de ser descartado ou
reutilizado;
- Retirar todo o EPI quando sair do laboratório;
- Lavar as mãos com sabonetes antissépticos.

REFERENCIAS:
Sociedade Brasileira de Patologia Clínica/Medicina Laboratorial, 2015.
Recomendações da Sociedade Brasileira de Patologia Clínica/Medicina
Laboratorial (SBPC/ML) : boas práticas em microbiologia clínica. Barueri,
SP : Manole : Minha Editora, 2015.
 2.0 - MICROSCOPIA
2.1 - O MICROSCÓPIO

FONTE: DINIZ, 2018.

2.2 - TÉCNICAS DE COLORAÇÃO EM BACTERIOLOGIA (Gram, Ziehl

Neelsen, Fontana Tribondeau)
As bactérias podem ser observadas através da microscopia à fresco (sem
coloração) ou coradas através de diferentes técnicas.
A observação dos microrganismos à fresco tem função de verificar a mobilidade
e morfologia de bactérias espiraladas (que podem ficar distorcidas se fixadas),
alterações na divisão celular e formação de esporos. O microscópio de campo
escuro ou diminuição da intensidade da luz é necessário facilitar a visualização
das bactérias pois são transparentes.
Através da coloração as bactérias são fixadas, muitas vezes através do calor e
posteriormente as interações químicas que ocorrem com os corantes levam a
sua morte o que favorece o transporte e manuseio com menor risco ocupacional
e contaminação do ambiente.
A coloração favorece a visualização da morfologia e a diferenciação estrutural
das células capazes de corar através da afinidade pelos diferentes corantes.
- Preparo do esfregaço:
Toda coloração deve ser iniciada após realização do esfregaço que pode ser
realizado a partir do material biológico coletado corretamente e preparado, o que
sugere resultado e direciona o uso a prescrição de antibióticos em casos de
infecções mais graves, bem como orienta a realização dos passos para
realização da cultura e provas de identificação.
Realiza-se esfregaço também a partir de culturas com crescimento em caldos ou
ágar, neste caso o material precisa ser diluído em solução salina e realizado
esfregação utilizando a alça de platina.
Após realizado esfregaço o mesmo deverá secar ao ar livre, para minimizar
riscos de contaminação, e posteriormente ser fixado para a aderência das
células à lâmina. A forma mais comumente empregada para fixação do
esfregaço é flambar, passar a lâmina com o esfregaço voltado para cima, por
três vezes através da chama do bico de bunsen.

FONTE: DINIZ, 2018.

2.2.1 - COLORAÇÃO DE GRAM
A coloração de GRAM foi desenvolvida por Hans Christian Gram, separa a
bactérias em dois grandes grupos baseado nas diferenças existentes entre as
estruturas das paredes celulares desses dois grupos. A coloração de GRAM
contribui no diagnóstico das infecções bacterianas, agilizando – o e auxiliando
nas prescrições médicas de modo correto.
A estrutura da parede celular das bactérias GRAM POSITIVAS difere da
estrutura da parede celular das bactérias GRAM NEGATIVAS, pois as bactérias
GRAM POSITIVAS possuem uma espessa camada de peptídeoglicano, além de
ácidos teicóicos e lipoteicóicos. Já as bactérias GRAM NEGATIVAS possuem
em sua parede celular poucas camadas de peptidoglicana e uma membrana
plasmática externa. A peptidoglicana liga-se a lipoproteínas na membrana
externa e, ao contrário das gram-positivas, não contém ácidos teicóicos e
lipoteicóicos em sua estrutura. A membrana plasmática da bactéria gram-
negativa consiste de lipopolissacarídeos, lipoproteínas e fosfolipídeos.
Nas etapas da coloração o cristal violeta é adicionado e as estruturas das
bactérias GRAM POSITIVAS E NEGATIVAS coram-se igualmente. No segundo
passo da coloração o lugol reage com o cristal violeta formando o complexo iodo-
cristal violeta (CV-I), que se fixa e cora a célula mais intensamente, sendo Lugol
neste caso denominado de murdente.
Para o álcool adicionado ao esfregaço as bactérias se comportam de maneira
diferente:
- As bactérias Gram-positivas não se descoram facilmente pelo tratamento com
o álcool. Isto se explica pelo fato dessas bactérias possuírem uma espessa
parede celular (várias camadas de peptidioglicano), além de outros possíveis
componentes, como: ácidos teicóicos, proteínas, polissacárides e etc. Estas
substâncias não são solúveis em álcool, que parece atuar reduzindo a
permeabilidade da parede, dificultando a extração (saída) do complexo CV-I (no
citoplasma). A bactéria Gram-positiva permanece então com a coloração
(coram-se em roxo) até o final.
- As bactérias Gram-negativas são descoradas pelo tratamento com o álcool.
Estas bactérias possuem uma delgada camada de peptideoglicano (que não é
suficiente para impedir a passagem do solvente) além de uma membrana
externa rica em lipídios (lipoproteina, fosfolípides e lipídio “A” que participa do
LPS). O álcool solubiliza (dissolve) estes lipídeos (muitas vezes dissolvendo
membrana externa), o que contribui para um aumento da permeabilidade da
parede, permitindo a remoção CV-I, descorando a célula. Finalmente, as
bactérias descoradas pelo álcool, por não apresentarem contraste que permita
sua visualização.
No último passo da adição de corantes a fucsina (corante rosa) é adicionado
corando apenas as bactérias GRAM NEGATIVAS.
Então, tem-se bactérias GRAM POSITIVAS coradas em ROXO e bactérias
GRAM NEGATIVAS coradas por ROSA (vermelho).

FIGURA: Técnica coloração por GRAM.

FONTE: TORTORA, FUNKE, CASE, 2012.

2.2.2 - COLORAÇÃO DE GRAM EM AMOSTRAS CLÍNICAS

A - URINA:
A coleta da amostra é fundamental para a qualidade do resultado pois impede
que resultados falsos positivos ou negativos possam ocorrer e prejudicar
diagnóstico e tratamento.
Amostras coletadas a partir do jato médio devem ser homogeneizadas e uma
gota de 10 µL colocada na lâmina, secar e fixar ao calor para posterior coloração
seguindo o descrito em 2.2.1 – coloração de GRAM.
Para análise do primeiro jato é necessário a centrifugação a 2000 rpm/ 10 min
retirar o sobrenadante e colocar uma gota do sedimento em lâmina, secar e fixar
ao calor para posterior coloração seguindo o descrito em 2.2.1 – coloração de
GRAM.

B – AMOSTRAS RECEBIDAS DE SWAB:

Para amostras coletadas em dois “swabs” forem coletados um dos deles deve
ser usado para fazer o esfregaço rolando delicadamente sobre a superfície da
lâmina limpa.
Em caso de coleta de apenas um “swab” suspender o mesmo em pequeno
volume de solução salina estéril, agitar, comprimir o “swab” na parede do tubo e
usar a suspensão para preparo do esfregaço e cultura.
Para coloração do material nas duas amostras, secar e fixar ao calor para
posterior coloração seguindo o descrito em 2.2.1 – coloração de GRAM.

C – AMOSTRAS DE CULTURAS
Líquidas:
Culturas em Caldos – com a alça de platina coletar uma amostra colocar sobre
a lâmina, secar e fixar ao calor para posterior coloração seguindo o descrito em
2.2.1 – coloração de GRAM.
Hemocultura: aspirar uma pequena quantidade, colocar duas gotas sobre a
lâmina, espalhar, secar e fixar ao calor para posterior coloração seguindo o
descrito em 2.2.1 – coloração de GRAM.
Colônias: sobre uma lâmina limpa colocar uma gota de solução salina estéril,
com alça coletar uma colônia isolada e emulsificar delicadamente a amostra.
Para as amostras de cultura é necessário: secar e fixar ao calor para posterior
coloração seguindo o descrito em 2.2.1 – coloração de GRAM.

2.2.3 – RESULTADO DA MICROSCOPIA DE GRAM

Ao microscópio na objetiva de 100 (aumento 1000 x) analisar várias áreas do
esfregaço, verificar presença de células e leucócitos, relatar a ausência ou
presença de microrganismos.
Na presença de microrganismos é necessário a descrição da morfologia e
agrupamento dos microrganismos observados conforme tabela:
 MORFOLOGIA COLORAÇÃO DE ARRANJO
GRAM
Aos pares
Cocos GRAM positivo Em cadeia
Agrupados semelhantes
a cachos de uva
Ramificados
Bacilos GRAM positivo Corineiformes ou
difteróides
Doderlein
Diplococos GRAM negativo
Bacilos GRAM negativo
Cocobacilos GRAM negativo
Cocobacilos GRAM variáveis
Leveduras e/ou
leveduras em filamento
Em casos de não visualizados microrganismos – não foram observados
microrganismos coráveis pelo método de GRAM, uma vez que para visualizar
microrganismos pelo método de GRAM, em geral é necessário a presença de
104 UFC/mL.

A imagem, a seguir, foi extraída do livro Procedimentos Básicos em Microbiologia

Clínica (OPLUSTIL, 2010).
FIGURA: Esquema de classificação das bactérias gram-negativas de acordo
com a coloração pelo método de GRAM.
FONTE: OPLUSTIL, 2010.

FIGURA: Esquema de classificação das bactérias gram-positivas de acordo com

a coloração pelo método de GRAM.

FONTE: OPLUSTIL, 2010.

2.2.4 – IMAGENS DE LÂMINAS DA MICROSCOPIA DE GRAM

A seguir podem ser visualizadas imagens de lâminas coradas pelo método de

GRAM que foram preparadas a partir de culturas de diferentes espécimes
biológicos que justifica a identificação dos microrganismos e não apenas a
determinação da morfologia, arranjo e coloração.

FIGURA: Imagens de lâminas coradas pelo método de GRAM, elaboradas a

partir de culturas diferentes espécimes clínicos identificadas.
FONTE: MURRAY, 2018.
2.3.1 - COLORAÇÃO DE ZIEHL NEELSEN
A coloração de Ziehl Neelsen baseia-se na capacidade dos gêneros bacterianos
Micobacterium e Nocardia em resistirem a descoração com uma solução de
álcool-ácido, após tratamento pela fucsina fenicada aquecida, permanecendo
coradas de vermelho (BAAR- Bacilo-Álcool). Já a maioria das bactérias não
possuem esta propriedade e permanecem com a cor do corante de fundo, azul
de metileno.
A propriedade dos gêneros Micobacterium e Nocardia em resistir a descoloração
com álcool-ácido é justificada por possuírem sua parede celular de lipídeos
fortemente ligados a ácido micólico, que provocam hidrofobicidade, dificultando
a penetração de corantes aquosos.

2.3.2 - COLORAÇÃO DE ZIEHL NEELSEN EM AMOSTRAS CLÍNICAS

A coloração de Ziehl Neelsen em amostras clínicas é importante já que é o
método mais rápido para detecção de microbactérias em amostras clínicas. As
microbactérias possuem crescimento lento, mesmo em condições ótimas e
exigem meios de cultura complexos para seu crescimento, que ocorre a partir de
12 a 15 dias para visualização de poucas colônias (as culturas devem ser
mantidas em observação de 6 a 8 semanas para diagnóstico definitivo).
A técnica de coloração segue descrito:
- após realizar o esfregaço e fixar,
- cobrir o esfregaço com solução de fucsina de Ziehl,
- aquecer a parte inferior da lâmina com a chama do bico de Bunsen até emissão
de vapor por 5min.
- lavar em água corrente,
- cobrir o esfregaço com solução de álcool-ácido e deixar por 1 min.
- lavar com água corrente,
- cobrir o esfregaço com azul de metileno, por aproximadamente 2 min.
- Lavar e deixar secar,
Examinar a lâmina ao microscópio com a objetiva de imersão.
Amostras mais comuns usadas para diagnostico são:
A – ESCARRO: Coleta deve ser obrigatoriamente realizada em frasco estéril, de
boca larga para facilitar a coleta, pela manhã após higiene bucal,
preferencialmente por três dias consecutivos.
O transporte para laboratório precisa acontecer em até 48 hs, caso não seja
possível a amostra deve ser mantida sob refrigeração e enviada a análise em no
máximo 48hs.
Todo material deve ser avaliado e de locais onde pode-se observar maior
concentração de pús e sangue deve ser coletado usando alça e espalhado sobre
a lâmina. Secar. Fixar ao calor e corar.

B-LÍQUIDOS ORGÂNICOS: os líquidos orgânicos devem ser centrifugados

(5000 rpm/15min). O sobrenadante desprezado e uma alça do sedimento deve
ser coletada e depositada sobre a lâmina. Secar. Fixar ao calor e corar.

C-BIOPSIA DE TÉCIDO: a amostra deve ser macerada coma ajuda de grau e

pistilo estéril com gotas de solução salina, uma alça do material deve ser extraída
e espalhada por ¾ da lâmina. Secar. Fixar ao calor e corar.

D-URINA: todo volume precisa ser centrifugado (5000 rpm/15min), uma alça do
sedimento deve ser coletada e depositada sobre a lâmina. Secar. Fixar ao calor
e corar.
Todo processamento das amostras deve acontecer em cabine de segurança.

2.3.3 – RESULTADO DA MICROSCOPIA DE GRAM

FONTE: DINIZ, 2018.

2.3.4 – IMAGENS DE LÂMINAS DA MICROSCOPIA DE GRAM
A seguir podem ser visualizadas imagens de lâminas coradas pelo método de
Ziehl Nielsen que foram preparadas a partir de culturas de diferentes espécimes
biológicos.

FIGURA: Imagens de lâminas coradas pelo método de GRAM, elaboradas a

partir de culturas diferentes espécimes clínicos identificadas.
FONTE: MURRAY, 2018.

REFERÊNCIAS
MURRAY, Patrick R. Microbiologia médica básica 1. ed. - Rio de Janeiro:
Elsevier, 2018. 248 p. : il.; 25 cm.
OPLUSTIL C. P.; ZOCCOLI,C. M.; TOBOUTI N. R.; SINTO S.I. Procedimentos
Básicos em Microbiologia Clínica. 3ª ed., São Paulo: SARVIER, 2010.
 2.0 – CULTURA BACTERIANA

Para sucesso do exame laboratorial cultura bacteriana vários aspectos devem

ser levados em consideração a destacar: coleta das amostras, conservação e
transporte, o processamento.
Para a coleta da amostra o verdadeiro local da infeção em condições adequadas
é um fator que reduz as chances de causar resultados falsos positivos ou
negativos. O transporte respeitando temperatura, tempo e material adequado
para característica de cada amostra é importante para preservar para sucesso
do exame.
O destaque no processamento da amostra vai para a semeadura primária
correta, pontos importantes no recebimento das amostras devem ser levados em
consideração pelo microbiologista, tais como: natureza do material clínico,
seleção do meio de cultura, temperatura e tempo de cultivo.
Urina, fezes, escarros, lavado brônquico, líquor, fragmento de tecidos, líquidos
orgânicos, são materiais mais comuns em que a cultura é solicitada, mas vale
ressaltar que qualquer material clínico pode ser submetido a cultura.

2.1. SEMEADURA
A semeadura do material biológico deve em meios de cultura. Os meios de
cultura fornecem in vitro os nutrientes que são necessários para o crescimento
das bactérias, para tanto devem reproduzir as condições nutricionais
necessárias a cada espécie bacteriana.
Como as exigências nutricionais das bactérias variam de espécie para espécie
o meio de cultura que contem a necessidade nutricional da espécie suspeita de
provocar a infecção deve ser selecionado, uma vez que não existe meio de
cultivo universal, isto permitirá o crescimento, posterior isolamento das colônias
bacterianas e assim a identificação da espécie causadora da patologia.
A ordem de inoculação dos meios de cultura é sempre do meio menos seletivo
para o mais seletivo, assim evita se que substâncias inibidoras sejam
transferidas de um meio para outro.
2.1.1 TÉCNICAS DE SEMEADURA
Existem diferentes técnicas de semeadura e inoculação de amostras em meios
de cultivo. A escolha da melhor técnica deve ter como base os objetivos, que
podem ser entre outros: crescimento, isolamento, identificação, contagem.
Os materiais mais usados para empregar as técnicas de semeadura são:
- alça bacteriológica – que podem ser de platina, descartável, calibrada ou não.
- agulha de platina – tem função de extrair fragmento da colônia e purificar.
- swab – empregado para coleta e semeadura em antibiograma.

A – SEMEADURA “ESPALHAMENTO EM SUPERFICIE”

Tem como principais objetivos o crescimento, isolamento e quando semeados
com alça calibrada a quantificação.

FIGURA: Técnica de semeadura espalhamento por superfície.

FONTE: BRASIL, 2013.

B – ESGOTAMENTO POR MEIO DE ESTRIAS SUPERFICIAIS

Tem como objetivos: crescimento, isolamento de colônias que vão ser
identificadas posteriormente. É a semeadura mais empregada na rotina de um
laboratório de análises clínicas.
FIGURA: Técnica de semeadura por superfície.

FONTE: OPLUSTIL, 2010.

C – PRINCIPAIS MEIOS DE CULTIVO USADOS NA SEMEADURAS EM

ROTINA DE LABORATÓRIOS ANALÍTICOS.
O quadro a seguir, extraído do livro Bacteriologia clínica escrito por Yokomizo,
et al., 2019, demonstra o resumo dos principais meios de cultivo utilizados pelos
laboratórios analíticos, suas aplicações e aspectos da colônia.
QUADRO: Principais meios de cultivo usados para crescimento, isolamento e
posterior identificação de bactérias.
FONTE: YOKOMIZO, et al.

REFERÊNCIAS
BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Microbiologia Clínica para o
Controle de Infecção Relacionada à Assistência à Saúde. Módulo 4:
Procedimentos Laboratoriais: da requisição do exame à análise microbiológica e
laudo final/Agência Nacional de Vigilância Sanitária–Brasília: Anvisa, 2013. 95p.:
il.9 volume
MURRAY, Patrick R. Microbiologia médica básica 1. ed. - Rio de Janeiro:
Elsevier, 2018. 248 p. : il.; 25 cm.

OPLUSTIL C. P.; ZOCCOLI,C. M.; TOBOUTI N. R.; SINTO S.I. Procedimentos

Básicos em Microbiologia Clínica. 3ª ed., São Paulo: SARVIER, 2010.
YOKOMIZO. et al. Bacteriologia clínica. – Porto Alegre : SAGAH, 2019.