COLÉGIO INTERNATO DOS CARVALHOS

Microbiologia – 11ºAno

ANO LETIVO DE 2022/2023

COLORAÇÃO DE GRAM – PROTOCOLO

INTRODUÇÃO
A coloração de Gram é uma técnica de coloração que permite, após exposição a diferentes
corantes e soluções, a diferenciação de espécies bacterianas com base na coloração que
apresentam, azul arroxeada ou vermelha.
A diferente coloração resulta das diferentes propriedades químicas e físicas das paredes celulares
bacterianas. Mais especificamente, nas bactérias Gram positivas, a parede celular é constituída
por uma espessa camada de peptidoglicano, enquanto que nas Gram negativas, a parede celular
é constituída por uma fina camada de peptidoglicano e por uma membrana fosfolipídica externa.

Gram-negativas

Gram-positivas

No final da experiência, as bactérias Gram positivas são visualizadas com a coloração azul
arroxeada devido ao facto de não serem descoloradas pelo álcool, uma vez que possuem uma
camada de peptidoglicano mais espessa. O álcool desidrata a parede celular destas bactérias,
havendo contração dos seus poros e tornando-as impermeáveis, retendo o complexo formado
entre o cristal violeta e o lugol.
As bactérias Gram negativas, que são visualizadas com a coloração vermelha já que o álcool é
responsável por dissolver a membrana de lipídios constituinte destas bactérias e, assim, remover
o complexo formado entre o cristal violeta e o lugol, descolorando essas bactérias, que são,
posteriormente, coradas pela safranina.
A técnica de Gram é utilizada na área da medicina, uma vez que é um método rápido, prático e
barato para uma identificação primária de bactérias responsáveis por infeções. Desta forma, é útil
para os médicos poderem indicar o antibiótico adequado para tratar uma infeção bacteriana que
possa estar a ocorrer, já que se conhecem características específicas destes grupos de bactérias
(Gram positivas e Gram negativas), nomeadamente da sua parede celular.
MATERIAL E REAGENTES
● Amostra bacteriana ● Solução de álcool/acetona
● Lâminas ● Pipeta de pasteur
● Lamelas ● Óleo de imersão
● Soluto de lugol ● Lamparina
● Cristal violeta ● Caneta de acetato
● Safranina ● MOC
● Água destilada

PROCEDIMENTO
1. Colocar a amostra bacteriana na lâmina, podendo ser acrescentada uma gota de água para
facilitar a homogeneização das colónias;
(Se necessário, realizar a técnica do esfregaço com a amostra bacteriana)
2. Deixar secar um pouco, podendo passar a lâmina rapidamente pela chama da lamparina,
para favorecer a secagem;
(No entanto é importante ter atenção à temperatura, já que se a temperatura for muito alta é
possível que haja alteração na estrutura da bactéria ou até levar à sua morte, o que pode
interferir no resultado da experiência)
3. Quando a lâmina estiver seca, colocar numa tina de coloração com o corante cristal violeta e
deixar atuar por cerca de 1 minuto;
4. Lavar a lâmina com um pouco de água destilada;
5. Colocar a lâmina numa tina de coloração com soluto de lugol e deixar atuar por 1 minuto;
6. Em seguida, lavar a lâmina com água destilada e aplicar a solução de álcool/acetona,
deixando atuar por 30 segundos;
7. Depois, lavar novamente com água destilada e cobrir a lâmina com o terceiro corante, a
safranina, e deixar atuar por 30 segundos;
8. Em seguida, lavar a lâmina com água destilada e deixar secar à temperatura ambiente;
9. Assim que a lâmina estiver seca, observar ao MOC, na objetiva de 100x, colocando uma gota
de óleo de imersão.
RESULTADOS

Reagentes Bactérias Gram positivas Bactérias Gram negativas

Cristal Violeta

Soluto de lugol

Solução de álcool/acetona

Safranina

Maria Luís Resende, 15977

Beatriz Carvalho, 15679
Sofia Pinho, 15859