UNIVERSIDADE DE SOROCABA

MICROBIOLOGIA CLÍNICA

FARMÁCIA

RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA

INFECÇÕES GASTROINTESTINAIS
 Ernesto M. Uryu RA: 93820

Guilherme Augusto P. da Silva RA: 85279

Sorocaba-SP

2019

INTRODUÇÃO

As gastroenterites infecciosas afetam grande parte da população mundial. A

OMS estima que ocorram cerca de 2 bilhões de casos a cada ano, sendo a principal
causa de morbidade e mortalidade de origem infecciosa e a maior causa de
mortalidade em crianças menores de cinco anos. A grande maioria das diarreias de
origem infecciosa é tratável; entretanto, em muitos casos, o isolamento do agente
etiológico não é feito de forma adequada (TORRES FILHO, 2013).

Mesmo quando são realizados os exames adequados, cerca de 30% dos

casos podem permanecer sem etiologia definida. Diversos motivos podem
influenciar na dificuldade em se isolar o agente etiológico, sendo a diversidade
desses agentes a principal causa. A origem das gastroenterites infecciosas pode ser
parasitária, bacteriana ou viral. As diarreias podem ser classificadas em três
síndromes: inflamatória, com presença de disenteria; não inflamatória; e doença com
repercussão sistêmica, febre entérica. As síndromes estão diretamente relacionadas
às etiologias, resposta inflamatória e topografia da infecção (BETÉS; MUÑOZ-
NAVAS, 2016).
 Os principais agentes bacterianos relacionados com gastroenterites incluem
os gêneros Salmonella, Shigella, Escherichia, Staphylococcus, Aeromonas,
Plesiomonas, Yersinia e Campylobacter (TORRES FILHO, 2013).

O teste globalmente mais utilizado para a pesquisa de agentes bacterianos

em fezes é a coprocultura. Apesar de se tratar de um teste bastante sensível, a
coprocultura apresenta diversas limitações, incluindo a ocasião e a forma de colheita
da amostra. As fezes devem ser colhidas na fase aguda (diarreicas), em frascos
estéreis ou em swabs com meio de transporte conservante específico (Carry-Blair).
De preferência, devem ser encaminhadas ao laboratório até duas horas após a
colheita e conservadas em temperatura ambiente. Caso seja possível a utilização de
meio de transporte conservante (Carry-Blair), a amostra poderá permanecer estável
por até 48 horas seconservada sob refrigeração (2-8ºC) (TORRES FILHO, 2013).

O uso prévio de antibióticos ou antidiarreicos também pode interferir no teste.

Na maioria dos laboratórios clínicos são utilizados meios de cultivo seletivos para os
seis primeiros agentes, deixando os últimos dois (Yersinia e Campylobacter) apenas
para pesquisas específicas, solicitadas de forma especial ao laboratório. Este
procedimento pode trazer grande limitação à sensibilidade da coprocultura, devido à
grande incidência de Campylobacter associada a processos gastroentéricos
(BETÉS; MUÑOZ-NAVAS, 2016).

A infecção por Salmonella é comum, podendo originar uma multiplicidade de

manifestações clínicas. Na maioria das vezes apresenta-se como doença auto-
limitada, sob a forma de gastrenterite aguda, no entanto pode originar formas mais
graves como bacteriemia, artrite, meningite e pneumonia, entre outras (ALMEIDA et
al., 2012).

Segundo a classificação de Kauffman-White, existem duas espécies de

Salmonella, S. entérica e S. bongori, divididas em sorogrupos e sorotipos de acordo
com os antígenos de superfície produzidos pela bactéria. O conhecimento do
sorotipo predominante numa região, orienta o estudo epidemiológico desta infecção,
nomeadamente, as fontes de contágio associadas, a evolução e gravidade
esperadas, bem como a existência de resistências aos antibióticos (MARCUS et al.,
2007). A gastrenterite (GE) a Salmonella representa um problema de saúde pública
mundial, sendo a sua incidência real muito superior ao número de casos declarados
(ALMEIDA et al., 2012).

OBJETIVO: Semear bactérias contidas em amostra, nos meios específicos a fim de

identificar e isolar a bactéria, por meio de coprocultura e assim encontrar o patógeno
causador do quadro infeccioso.

MATERIAIS E MÉTODOS

 Placa ágar SS
 Placa ágar MacConkey
 Swab estéril
 Alça calibrada descartável
 Amostra
 Bico de Bunsen
 Lâmina para microscópio;

 Kit de coloração – Cristal violeta, lugol, álcool-acetona e safranina;

 Enterokit B – tubos EPM, mili e citrato
 Caldo tetrationato
 Reativo de Kovacs

MÉTODO – COPROCULTURA

 Ágar Mac Conkey (Seletivo que inibe Gram + e evidencia

fermentadores de lactose). Utilizado para isolar e identificar seletivamente
enterobactérias em amostras biológicas. As enterobactérias fermentadoras de
lactose abaixam o pH do meio, o que é detectado pelo indicador (vermelho neutro)
originando colônias vermelhas ou rosadas. As não-fermentadoras formam colônias
transparentes, incolores ou âmbar.
 Ágar SS (....) para isolamento e identificação de bacilos entéricos,
especialmente Salmonella e Shigella. Diferencia as bactérias em fermentadoras ou
não de lactose e em produtoras de H2S, pela presença de lactose, vermelho neutro,
citrato de ferro, verde brilhante na sua composição.

A técnica do esgotamento em placa consiste em depositar sobre um ponto da

superfície do meio uma alíquota do material e depois espalhá-lo em dois ou três
setores, de maneira a obter quantidades progressivamente menores do material.

Método – Enterokit B

Bateria de testes que é uma modificação do meio de Rugai e Araújo. Permite

verificar com fidelidade a maioria das enterobactérias isoladas de espécimes
clínicos. Se consiste tem 3 meios: EPM, MILI e Citrato de Simmons.

O meio EPM consiste em testes de:

Produção de gás por fermentação da glicose (Aparecimento de bolhas ou

desprendimento do fundo).

Produção de H2S - Enegrecimento do meio.

H2S + sulfato ferroso Precipitado negro (Tiossulfato de sódio)

Hidrólise da uréia - Aparecimento da cor azul ou verde-azulada (reação fraca) que

se estende para a base do meio, envolvendo-a totalmente ou não. A produção de
urease pela bactéria, alcaliniza o meio pela degradação de uréia em NH 3.

Desaminação do triptofano - Aparecimento da cor verde-garrafa na superície do

meio. Quando a reação é negativa, a superfície do meio adquire cor azul ou
raramente, amarela.

O meio MILi consiste em testes de:

Motilidade – Positivo se houver crescimento difuso.

Descarboxilação de lisina – A descarboxilação da lisina torna o meio púrpura.
Quando o aminoácido não é utilizado, o meio adquire cor amarela nítida nos 2/3
inferiores. A utilização da glicose na parte inferior do meio torna o meio amarelo. Se
a lisina for descarboxilada o meio ficará alcalino e retornará a cor original roxa.

Produção de indol (Verificação da enzima triptofanase pela bactéria) - Após a

leitura dos testes de lisina e motilidade adicionar 3 ou 4 gotas do reativo de Kovacs à
superfície do meio e agitar levemente. Quando a bactéria produz indol, o reativo
adquire a cor rosa ou vermelha.

Citrato de Simmons - Evidencia a capacidade da bactéria de crescer utilizando o

citrato como única fonte de Carbono. Se a bactéria for capaz de crescer ela também
utilizará os sais inorgânicos de amônia presentes no meio, como fonte de N,
liberando produtos finais de metabolismo que elevam o pH do meio. A adição de um
indicador de pH pode evidenciar essa alcalinização comprovando o crescimento da
bactéria nesse meio com apenas uma fonte de C.

A agulha de inoculação foi introduzida na amostra de bactérias e estriada na

superfície do meio de citrato, foi esterilizada na chama do bico de Bunsen,
introduzido na amostra e inserido nos tubos MILI verticalmente até o fundo e
retirado, o mesmo processo feito nos tubos EPM porém perfurando até o final e
durante a retirada estriando na superfície do gel.

Método – Coloração de Gram

A amostra foi retirada do cultivo com alça de metal calibrada e confeccionada

em esfregaço, em seguida foi adicionado cristal violeta e aguardado o tempo de 1
minuto. Na sequência foi lavado com água destilada e adicionado lugol para fixação
do corante, aguardando mais 1 minuto. Em seguida foi descorado com álcool-
acetona, lavado com água e adicionado de corante fucsina por 30 segundos, após,
lavado novamente e encaminhado ao microscópio para análise.

CALDO TETRATIONATO
 O caldo tetrationato é um meio líquido para enriquecimento seletivo de
amostras nas quais se deseja recuperar Salmonelas. Possui adição de solução de
iodo e iodeto de potássio é usado como um meio de enriquecimento seletivo para o
isolamento de Salmonela em alimentos e outros materiais de importância sanitária.

Caldo Tetrationato é usado como um enriquecimento seletivo para o cultivo

de espécies de Salmonella que possam estar presentes em pequenas quantidades ,
aos quais passam por processamento que incluem exposição a baixas
temperaturas, secagem, radiação e conservantes. Embora células lesadas possam
não formar colônias em meios seletivos, elas podem ser ingeridas e causar doença.
A concorrência entre diferentes gêneros bacterianos, presentes em uma mesma
amostra, pode inibir o crescimento das espécies do gênero Salmonella spp. O
enriquecimento seletivo amplia em muito a possibilidade de recuperação, evitando a
liberação de resultados falsos negativos.

O Caldo Tetrationato foi originalmente descrito por Mueller que descorbiu que
o meio inibiu seletivamente os coliformes, permitindo que os patógenos entéricos
crescessem sem restrição. Kaufmann modificou o meio de Mueller e alcançou uma
porcentagem ainda maior de isolado. O Tetrationato contém peptonas que fornecem
nitrogênio, vitaminas, aminoácidos e carbono. Sais biliares que inibem o crescimento
de microrganismos gram-positivos. O carbonato de cálcio neutraliza e absorve os
metabolitos tóxicos.

O iodo é adicionado no momento do uso, reagindo com o tiossulfato para

formar o tetrationato. O crescimento das enterobactérias que reduzem o tetrationato,
como a Salmonella, é relativamente normal, enquanto os coliformes e outras
enterobactérias não redutoras são suprimidas. A redução do tetrationato produz
ácido neutralizado pelo carbonato de cálcio presente na formulação.

RESULTADOS

Após o período de incubação das placas e enterokit B e kit

NF obtivemos os seguintes resultados:
 Ágar MacConkey: Apresentou coloração marrom alaranjado com formação
de colônias brancas.

Ágar SS (Salmonella, Shigella): Apresentou coloração

alaranjada com colonias enegrecidas.

Tubo EPM: Apresentou a produção de H2S, onde é possível

ver pelo enegrecimento do meio, e não houve a formação de
gás.

Tubo MILI: podemos observar a motilidade da bactéria

presente na figura A, a descarboxilação da lisina na figura B, e a não formação de
indol na figura C

Figura A Figura B Figura C

Tubo Citrato: A bactéria cultivada foi capaz de usar citrato como única fonte de
carbono, assim deixando o meio azulado.

Semeadura no caldo tetrationato: O sedimento presente

após a semeadura no caldo, indica o crescimento
bacteriano.

Lactose 0 Urease 0 Indol 0

Gás 0 LTD 0 Lisina 2

H2S 1 Motilidade 1 Citrato 1

Total: 1 1 3

Resultado: 1-1-3 Salmonella spp

CONCLUSÃO
 O crescimento em ágar SS e ágar MacConkey, indicam que a bactéria é uma
gran negativa, e em nenhum dos meios de cultura, houve fermentação da lactose. A
formação de colônia enegrecidas no meio SS, indicam a formação de H2S,
característico das salmonelas.

O tubo EPM, evidenciou mais uma fez a formação de H2S, sem formação de
gas, sendo que não foi encontrado nenhuma bolha no meio, e o enegrecimento do
tubo que antes era verde, indica a produção de H2S. O tubo MILI evidenciou a
motilidade, a não formação de indol e a descarboxilação da lisina. A bactéria
semeada no tubo de citrato modificou a cor de verde para azul, indicando o uso de
citrato como única fonte de carbono.

Por fim o caldo tetrationato apresentou sedimentos que caracterizam o

crescimento bacteriano. A somatória resultante foi de 113, que conforme a bula
indica que a bactéria isolada e cultivada era uma Salmonell ssp.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ALMEIDA, C. et al. Salmonella gastroenteritis in children. Acta medica portuguesa,

v. 25, n. 4, p. 219–223, 2012.

BETÉS, M.; MUÑOZ-NAVAS, M. Protocolo diagnóstico y tratamiento de la

gastroenteritis aguda. Medicine-Programa de Formación Médica Continuada
Acreditado, v. 12, n. 3, p. 147–151, 2016.

MARCUS, R. et al. Re-assessment of risk factors for sporadic Salmonella serotype

Enteritidis infections: a case-control study in five FoodNet Sites, 2002–2003.
Epidemiology & Infection, v. 135, n. 1, p. 84–92, 2007.

TORRES FILHO, H. M. Gastroenterites infecciosas. Jornal Brasileiro de Medicina,

Rio de Janeiro, v. 101, n. 2, p. 25–29, 2013.