Universidade Tecnológica Federal do Paraná – UTFPR

Campus Londrina
Coordenação de Engenharia Química

MÓDULO 1. BIOENGENHARIA
COLORAÇÃO DE GRAM

1. OBJETIVOS:
a) Lembrar da escala de tamanho das bactérias observadas;
b) Reconhecer a morfologia das bactérias observadas;
c) Diferenciar entre as duas categorias principais de bactérias: Gram positivas
Gram negativas;
d) Entender como a reação da coloração de Gram afeta bactérias Gram
positivas e Gram negativas com base nas diferenças bioquímicas e estruturais
de suas paredes celulares.

2. INTRODUÇÃO
O procedimento de coloração de Gram é o procedimento de coloração
mais amplamente usado em microbiologia e foi desenvolvido pelo cientista e
médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram em 1884. A coloração de
Gram é uma técnica de coloração diferencial que permite diferenciar as
bactérias em dois grupos: gram-positivas e gram-negativas.
O procedimento é baseado na capacidade dos microrganismos de reter a
cor de corantes usados durante a reação de coloração, que é consequência das
suas diferentes estruturas de parede celular, as quais possuem diferentes
propriedades químicas e físicas.
As bactérias Gram-negativas são descoloridas pelo álcool, perdendo a cor da
mancha primária, roxa. As bactérias Gram-positivas não são descoloridas pelo
álcool e permanecem roxas. Após a etapa de descoloração, uma
contracoloração é usada para conferir cor rosa aos organismos gram-negativos
descoloridos.

3. IMPORTÂNCIA DA COLORAÇÃO DE GRAM:

A coloração de Gram é uma etapa preliminar muito importante na
caracterização e classificação inicial de bactérias. É também um
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procedimento fundamental na identificação de bactérias com base nas

características de coloração, permitindo que as bactérias sejam
examinadas em um microscópio de luz. As bactérias presentes em um
esfregaço não corado são invisíveis quando vistas em um microscópio de
luz. Uma vez coradas, a morfologia e a disposição das bactérias também
podem ser observadas. Além disso, é também uma etapa importante na
triagem de agentes infecciosos em amostras clínicas, como esfregaços
diretos de um paciente.

4. RESULTADOS ESPERADOS:
a) Morfologia bacteriana: tamanho, forma e arranjo
Espera-se observar microscopicamente as características morfológicas
das bactérias. As morfologias variam bastante, sendo as mais comuns
descritas abaixo: Cocos: bactérias esféricas que podem ocorrer em pares
(diplococos), em grupos de quatro (tetracocos), em cachos semelhantes a
uvas (estafilococos), em cadeias (estreptococos) ou em arranjos cúbicos
de oito ou mais (sarcinos).

Exemplos: Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes Bacillus:

bactérias em forma de bastão que geralmente ocorrem isoladamente,
mas ocasionalmente podem ser encontrados em pares (diplo-bacilos) ou
em cadeias (estreptobacilos).
Exemplos: Bacillus cereus, Clostridium tetani
Spirillum: bactérias em forma de espiral
Exemplos: Spirillum, Vibrio, Spirochete
Algumas bactérias têm outras formas, como:
Cocobacilos: forma esférica ou ovóide alongada;
Filamentosos: bacilos que ocorrem em longas cadeias ou fios;
Fusiforme: bacilos com extremidades afiladas;
Vibrião: bactéria com o formato de bastonete recurvo (em forma de vírgula).
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b) Gram positivas X Gram negativas:
Bactérias Gram positivas: espera-se que estas bactérias Gram positivas
fiquem coradas de roxo escuro devido à retenção do corante primário
(violeta de genciana ou violeta cristal) na parede celular.

Bactérias Gram negativas: espera-se que estas bactérias gram negativas

fiquem coradas de vermelho ou rosa devido à retenção do corante de
contracoloração (Safranina) na parede celular.

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5. MATERIAIS
Reagentes: Equipamentos:

1. Água destilada 1. Alça de inoculação de platina

 2. Água esterilizada 2. Bico de Bunsen ou similar

3. Corante primário –violeta 3. Gaze

cristal

5. Culturas de bactérias gram 5. Lamínulas de vidro

negativas e gram-positivas de
18 a 24 horas

6. Descolorante - álcool etílico 6. Microscópio

95 %

7. Mordente – Lugol (iodo) 7. Papel para limpeza e

secagem de lentes

8. Óleo de imersão 8. Pisseta

6. PROCEDIMENTOS
Parte 1: Preparação da lâmina microscópica de vidro
Lâminas sem gordura ou óleo são essenciais para a preparação de
esfregaços microbianos. A gordura ou o óleo dos dedos das lâminas são
removidos lavando as lâminas com água e sabão. Limpe as lâminas com
álcool. Após a limpeza, seque as lâminas e coloque-as sobre toalhas de
laboratório até que estejam prontas para uso.

Parte 2: identificação das lâminas

Desenhar um círculo na parte de baixo da lâmina usando uma caneta
marcadora de vidro pode ser útil para delimitar a área na qual você
preparará o esfregaço. Você também pode colocar as iniciais do nome do
organismo na borda da lâmina para identificá-lo. Deve-se ter cuidado para
que a identificação não entre em contato com os reagentes de coloração.
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Parte 3: Preparação do esfregaço

Suspensões bacterianas em caldo: Com uma alça resfriada estéril,
coloque uma alça cheia da cultura do caldo na lâmina. Espalhe por meio
de movimentos circulares da alça de inoculação até cerca de um
centímetro de diâmetro. A propagação excessiva pode resultar na
interrupção do arranjo celular. Um esfregaço satisfatório permitirá o
exame do arranjo celular típico e das células isoladas.

Culturas de placas bacterianas: Com uma alça resfriada estéril, coloque

uma gota de água estéril ou solução salina na lâmina. Esterilize e resfrie a
alça novamente e pegue uma pequena amostra de uma colônia bacteriana
colocando e mexendo suavemente na gota de água / solução salina na
lâmina para criar uma emulsão.
Amostras de cotonete: role o cotonete sobre a superfície limpa de uma
lâmina de vidro.
Nota: É muito importante evitar a preparação de esfregaços espessos e
densos que contenham excesso de amostra bacteriana. Um esfregaço
muito espesso diminui a quantidade de luz que pode passar, dificultando a
visualização da morfologia de células individuais. Os esfregaços
geralmente requerem apenas uma pequena quantidade de cultura
bacteriana. Um esfregaço eficaz aparece como uma fina camada
esbranquiçada ou película após a fixação por calor.

Parte 4: Fixação por Calor

A fixação por calor mata as bactérias do esfregaço, adere firmemente o
esfregaço à lâmina e permite que a amostra retire as manchas mais
rapidamente.
• Deixe o esfregaço secar ao ar.
• Depois que o esfregaço secar ao ar, segure a lâmina em uma das
extremidades e passe-a inteira pela chama de um bico de Bunsen duas a
três vezes com o lado do esfregaço para cima.
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Agora o esfregaço está pronto para ser tingido.

Observação: tome cuidado para evitar o superaquecimento da lâmina, pois
as proteínas na amostra podem coagular, fazendo com que a morfologia
celular pareça distorcida.
Parte 5: Procedimento de coloração de Gram
1. Em uma lâmina, contendo esfregaço fixo por calor e seco, cubra-o
pingando gotas de violeta cristal e deixe repousar por 15 segundos (1
minuto);
2. Incline a lâmina ligeiramente e enxágue suavemente com água
destilada usando uma pisseta;
3. Inundar suavemente o esfregaço com lugol ou Iodo de Gram e deixe
descansar por 1 minuto;
4. Incline a lâmina ligeiramente para escorrer todo o lugol e enxágue
suavemente com água destilada usando uma pisseta. A mancha
aparecerá como um círculo roxo na lâmina;
5. Para descorar a lâmina, incline a lâmina ligeiramente e aplique álcool
etílico a 95%, ou acetona gota a gota por 5 a 10 segundos até que o álcool
escorra quase transparente. Tenha cuidado para não descolorir demais; 6.
Enxágue imediatamente. um filete de água;
7. Cubra suavemente toda a lâmina com safarina e deixe corar por
aproximadamente 30- 45 segundos;
8. Incline a lâmina ligeiramente e enxágue suavemente com água
destilada usando uma pisseta;
9. Seque a lâmina com auxílio de um papel absorvente limpo ou deixe-a
secar ao ar livre; 10. Aplique uma gota de óleo de imersão sobre o
esfregaço e observe no microscópico com objetiva de imersão (100 X). A
técnica que consiste na coloração das bactérias apresenta diagnóstico
clínico correto em 80% dos testes realizados, levando em consideração a
simplicidade e velocidade da técnica, o número é extremamente positivo.
Essa técnica ainda possui baixo custo e instalações simples.
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7. PARA O GRUPO ENTREGAR DEPOIS DA PRÁTICA:

• Relatório contendo:
a) Micrografias dos microrganismos corados, mostrando suas morfologias. Nesta
etapa vou pedir que pesquisem pelo(s) microrganismo(s) envolvidos na
produção do produto que vocês estão desenvolvendo no projeto neste semestre.
Coloquei o exemplo abaixo para vocês se basearem e responderem as questões
do item b)
 Figura 1. Imagem retiradas da internet representando algumas células
submetidas à coloração de Gram.

Resposta da pergunta b: Cultura pura, Morfologia: bacilo, Coloração de Gram:

Gram positivo, OBS: micrografia mostra a presença de endósporos, indicando um
microrganismo de potencial alto risco.

b) Respostas das seguintes questões:

1. Olhando as imagens que vocês pesquisaram sobre os microrganismos de
vocês, responda:
a) Em quais microscopias as bactérias são Gram positivas e em quais
microscopias as bactérias são Gram negativas.
b) Quais são as morfologias observadas nas micrografias? As culturas de
microrganismos são puras? Justifique.
d) As células contêm um detalhe adicional. O que representa este detalhe? e)
Para o grupo que estiver trabalhando com vírus, peço que pesquisem um
exemplo de coloração de Gram de uma cultura mista, onde é possível observar
bactérias Gram negativas e positivas juntas.
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3. Um microbiologista inverteu a ordem das etapas de coloração de Gram e

submeteu a amostra à solução de álcool a 95% antes de tratar a amostra com
lugol. Com base na finalidade desse método de coloração, explique qual(is)
é(são) a(s) possível(is) consequência(s) da distração do profissional.

3. Ao fazer uma coloração de Gram, o técnico equivocou-se e esqueceu-se de

aplicar o mordente, o resultado esperado para a coloração de um microrganismo
Gram positivo e um Gram negativo é respectivamente:
A) Rosa e rosa.
B) Violeta e rosa.
C) Rosa e violeta.
D) Violeta e violeta.
E) Violeta e incolor.

4. Antes de usar seus reagentes para tingir as bactérias, você precisa primeiro
fixar a amostra por calor, agitando a lâmina através da chama azul em um bico
de Bunsen algumas vezes. Por que você faz isso?
a) Para que a bactéria reaja aos corantes
b) Para que as bactérias não sejam eliminadas
c) Para que a bactéria não morra
d) Para que a morfologia das bactérias mude

5. Quais são a coloração primária e a contra-coloração usadas na coloração de

Gram
a) Violeta cristal e safranina
b) Violeta cristal e iodo
c) Safranina e iodo
d) Acetona e violeta cristal

6. Qual é o papel do mordente na coloração de Gram?

a) Fixar a safranina na parede celular
b) Ajudar na descoloração
c) Ajudar as células a parecerem vermelhas
d) Fixar o corante primário na parede celular
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7. Por que a coloração de Gram e tão útil?

8. Durante uma coloração de Gram, uma etapa pode ser omitida e ainda assim
permitir a diferenciação entre células gram-positivas e gram-negativas. Que
etapa é essa?

8. REFERÊNCIAS
Livros textos:
Cappuccino G. James, Sherman Natalie, Microbiology A laboratory manual,
seventh edition, Pearson Education
Brown E. Alfred, Benson’s Microbiological Applications, ninth edition, McGraw Hill
Publication
Pelczar J. Michael, Chan E.C.S, Krieg R. Noel, Microbiology, fifth Edition, Tata
McGraw-Hill Publishing Company Limited
Prescott M. Lansing, Harley P. John, Klein A. Donald, Microbiology, sixth edition,
McGraw Hill Higher Education
Ananthanarayanan R, Text book of microbiology, sixth edition, Longman Private
Limited

Webliography:
http://vlab.amrita.edu/?sub=3&brch=73&sim=208&cnt=6
https://br.pinterest.com/pin/764767580454870104/

Figuras:
As figuras deste material teórico forma elaboradas usando o software canva
educacional e as figuras da simulação foram retiradas de websites.