Aulas Práticas do Laboratório de Microbiologia

2011

HAMILTON R. F. BAVUTTI MARCOS LUENGO BLANCO MARIA RAQUEL MANHANI

BIOSSEGURANÇA EM LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA
1. O trabalho no laboratório de microbiologia exige, obrigatoriamente, o uso de epi: avental de mangas longas, com elástico nas mangas, fechado; óculos; touca; máscara facial; luvas; sapatos fechados ou pró-pés; 2. Evitar o uso de lentes de contato (preferir óculos) e maquiagem; 3. Não fumar, não comer, não beber; evitar tocar a boca e outras mucosas ou pele; 4. Não deixar cadernos, canetas, livros, bolsas, sacolas, dentre outros na bancada de trabalho – eles devem ser colocados em locais onde não haja risco de contaminação; 5. Cuidado com a chama do bico de Bunsen (figura 1), que deverá estar acesa durante a maior parte do tempo; 6. Desinfetar a bancada no começo e no fim do trabalho com solução de álcool 70% ou outra similar (cuidado! Verifique se o bico de Bunsen não está aceso!!!); 7. Ler atentamente o protocolo da aula prática e não iniciar o trabalho antes de ter certeza sobre o que fazer, a cada passo; 8. Antes de iniciar o trabalho assegure-se de que tem, à mão, todo o material necessário – não pegar mais material que o necessário nem material indevido; 9. Todo o material deve ser devidamente identificado; 10. Utilizar corretamente as técnicas de manuseio de culturas microbianas: 11. Não falar durante o manuseio das culturas, para minimizar o risco de contaminação das mesmas; 12. Relatar imediatamente, ao professor ou técnico, qualquer evento, acidente ou imprevisto; 13. Quando terminar de trabalhar com culturas, retirar as luvas e descartá-las em lixo infectante, lavar as mãos com sabonete antisséptico ou similar; deixar secar ao ar; 14. Guardar todo material usado no local apropriado e deixar as bancadas em ordem ao fim do trabalho; 15. O lixo deverá ser adequadamente acondicionado e todo material contaminado deve ser autoclavado para descontaminação antes de ser descartado ou reutilizado; 16. Retirar todos os EPIs (avental, luvas, óculos de segurança) quando sair do laboratório; 17. Depois de usar o microscópio, desligar a luz e limpar a objetiva com lenço de papel fino embebido em solução apropriada para limpeza das lentes, para retirar o óleo de imersão. Várias precauções devem ser obrigatoriamente tomadas durante os procedimentos no laboratório de Microbiologia para evitar a contaminação das pessoas, do ambiente e das culturas: Qualquer procedimento só deve se iniciar depois que todos os objetos necessários estejam o mais próximo possível do operador e deve ser realizado o mais rapidamente possível; Os frascos que precisam ser abertos devem ser fechados o mais rapidamente possível; o trabalho deve ser feito ao redor do bico de Bunsen e não são admitidas correntes de ar;

Figura 1 – Bico de Bunsen

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mantendo-a até que fique completamente vermelha. etc. por exemplo. 1. impedindo a entrada de contaminantes. 5. as superfícies internas estéreis das placas de Petri devem entrar em contato com o ar o menor tempo possível. devem permanecer na mão do operador. Essa posição deixa o dedo mínimo livre para segurar os tampões dos tubos. Deve-se proceder da seguinte maneira: 1. como se faz com um lápis (dedo polegar. Mover lentamente a alça para dentro da região mais quente da chama. entre o dedo mínimo e a palma da mão durante todo o procedimento Durante as manipulações. eles devem ser mantidos abertos ao redor do bico de Bunsen.   alças calibradas: que carregam um volume conhecido do material. na posição mais horizontal possível e deve ter sua “boca” novamente flambada antes de ser fechado. alternativamente ela pode ser resfriada nas paredes internas de um tubo ou placa de Petri (regiões estéreis). Esfriar a alça no ar. o calor cria uma corrente de convexão. 2. superfície da bancada. Quando você flamba o tubo. Posicionar a ponta da alça na região azul claro da chama . As partes estéreis de alças ou pipetas que entrarão em contato com as culturas ou com frascos estéreis não podem ser tocadas nem entrar em contato com outras superfícies não estéreis como. aquecimento rápido pode produzir a liberação de pequenas gotículas e formação de aerossóis. Os movimentos que devem ser realizados na flambagem de alças e agulhas encontram-se na figura 2. num ângulo próximo à posição vertical. Re-esterilizar a alça imediatamente após o uso. Os tampões de algodão ou roscas dos frascos não podem ser largados nem colocados sobre nenhuma superfície.Todos os frascos abertos devem ter suas “bocas” flambadas imediatamente. indicador e médio). Flambagem de alças e agulhas de platina ou de níquel-cromo  alça de níquel-cromo: Segura-se a alça perto de sua parte superior. Usar imediatamente. 6. pois depois do uso em culturas. mantendo-a na mão.essa é a região "fria" da chama. Mover a alça para que toda a extensão seja aquecida adequadamente ("ao rubro"). panos. 3. 4. sem colocá-la em nenhum local (para que ela não se contamine outra vez). o determinações quantitativas. podendo ser usadas em "Flambagem": aquecimento gradual da ponta da alça. acima do cone azul claro. que força o ar para fora. 3 . paredes externas de placas ou tubos.

A seqüência de flambagem de tubos e frascos encontra-se na figura 3.Segure a alça como se fosse um lápis. rode o frasco e não o tampão . não se esqueça. Feche o tubo. para que ele saia facilmente. dentro da chama do bico de Bunsen enquanto isso. antes de fechar. quase na vertical Posicione a ponta na região fria da chama Esfrie no ar. próximo à chama Aqueça gradualmente toda a extensão "ao rubro" Figura 2 – Seqüência para flambagem de alça e de agulha de inoculação 2. o tampão fica preso na mão do operador. Segure o tubo com a mão esquerda e retire o tampão com dedo mínimo da mão direita. Flambagem de tubos e frascos Afrouxe o tampão do frasco ou tubo. Passe a boca do tubo para frente e para trás. repita a operação acima. rodando o tubo e não o tampão. Depois de usar.o tampão fica fixo). 4 . mantendo o seguro entre esse dedo e a palma da mão (para retirar o tampão. recolocando o tampão.

previamente esterilizadas. imediatamente após o uso.Remova o tampão com o dedo mínimo Segure o tampão entre o dedo e a palma da mão Passe a boca do tubo dentro da chama Recoloque o tampão. colocando o aspirador e mantendo o dedo mínimo livre para abrir o frasco que contem o líquido a ser transferido. girando o tubo Figura 3 – Flambagem de tubos e frascos 3. como um lápis. acondicionadas em recipientes especiais ou individualmente embrulhadas devem ser manuseadas na frente do bico de Bunsen. com algodão na ponta. para ser transportada. Não encostar a ponta da pipeta em regiões não estéreis dos tubos. Manuseio de pipetas As pipetas graduadas ou de Pasteur. Segurá-las pela região do bocal. A pipeta contaminada deve ser colocada em um frasco com desinfetante. 5 .

3. ainda. ou antes de fechá-los. A tampa nunca deve ser colocada sobre a bancada. 2. agitação intensa.MATERIAL NECESSÁRIO pipetador pipetas de 1 mL e 10 mL embaladas em papel kraft ou similar estante para tubos tubos de ensaio contendo 10 mL de solução de corante (simulando meio de cultura estéril) tubos de ensaio contendo 9 mL de água (simulando diluente estéril) alça de platina ou de níquel-cromo tubos de ensaio vazios Erlenmeyer contendo 200 mL de solução de corante (simulando meio de cultura estéril). ou seja. os recipientes (tubos de ensaio. 5. Trabalhar em áreas submetidas previamente à limpeza e à desinfecção. 4. sem que haja perigo de superaquecimento ou queimaduras. Estas impedirão que microrganismos presentes no ar ou depositados sobre as diversas superfícies com a poeira. culturas puras de microrganismos. Os procedimentos 2 a 5 estão ilustrados na Figura 4. Flambar rapidamente a boca dos tubos contendo microrganismos ou meio estéril. soluções e equipamentos ou. Também impedem que os microrganismos com que estamos trabalhando nos contaminem ou ao ambiente. para reduzir o número de potenciais microrganismos contaminantes. ou seja. com tampão de algodão - 6 . placas de Petri. etc) com meio de cultura devem ser abertos o mais próximo possível da chama do bico. Deixar esfriar o instrumento antes de obter o inóculo. As técnicas referentes à manipulação de culturas envolvem basicamente: 1. Flambar ao rubro alça ou agulha antes e após cada inoculação. venham a contaminar materiais estéreis do laboratório como meios de cultura. centrifugação. como por exemplo.MANOBRAS ASSÉPTICAS I . preferencialmente na parte interna do recipiente que contém o meio de cultura. Trabalhar dentro da “zona de segurança” do bico de Bunsen*.INTRODUÇÃO As manobras assépticas são técnicas que impedem a entrada de microrganismos onde estes não são desejados. Desembrulhar a pipeta estéril dentro da zona de segurança. II . garantem a boa assepsia. sendo retirada e mantida segura pelo dedo mínimo da mão que detém a alça ou agulha durante a inoculação. * Operações com microrganismos patogênicos que podem gerar aerossóis. flambá-la rapidamente e mantê-la nesta região durante todo o trabalho. 6. dentro da zona de segurança. seguidas da abertura do frasco que contém a suspensão microbiana devem ser realizadas em cabine de segurança (capela de fluxo laminar vertical) e alças e agulhas devem ser esterilizadas em forno esterilizador (Figura 5). imediatamente após abri-los.

Desenvolver habilidade de: a. agulha de inoculação. . Descrever as principais técnicas de manobras assépticas. com auxílio de pipeta de 1 ou 2 mL. Identificar e manipular corretamente a vidraria principal e outros objetos de uso mais frequente em Microbiologia. sendo retirada e mantida segura pelo dedo mínimo da mão que detém a alça ou agulha durante a inoculação. a válvula da tubulação de gás). IV . bico de Bunsen. transferir 1 mL para outro tubo contendo 9 mL de água. Agitar suavemente até que o corante se distribua de maneira uniforme.OBJETIVOS bico de Bunsen placas de Petri embaladas em papel Kraft ou similar 1. placas.Transferência de caldo estéril para tubos previamente esterilizados 1.Realização de diluições seriadas 1. A partir deste tubo. A tampa nunca deve ser colocada sobre a bancada. Repetir quantas vezes julgar necessárias até o domínio da técnica. Retirar as placas vazias da embalagem e mantê-las próximas ao bico de Bunsen. usando pipeta estéril de 1 mL. Realizar a desinfecção da bancada de trabalho. manipular tubos contendo meios estéreis. 2. Deste último tubo. A partir do tubo contendo solução de corante. Distribuir 1 mL de solução de corante. agitando suavemente. distribuir meios de cultura estéreis em placas de Petri previamente esterilizadas. (Atenção! Este procedimento deve ser realizado na zona de segurança do bico de Bunsen). Parte B. contida em um tubo. 3. etc) e outros objetos de frequente manipulação (alça. este procedimento deve ser realizado na zona de segurança do bico de Bunsen). 3. 7 . Acender o bico de Bunsen (abrir primeiramente a válvula do bico de Bunsen e a seguir. Realizar a desinfecção da bancada de trabalho.PROCEDIMENTOS Parte A. 1 mL para tubo contendo 9 mL de água.Transferência de meio de cultura contido em Erlenmeyer para placas de Petri 1. a válvula da tubulação de gás). Treinamento de manobras assépticas . transferir. 4.III . para outro tubo vazio. de maneira asséptica (próximo ao bico do Bunsen). transferir 1 mL para outro tubo contendo 9 mL de água. 3. c. Mostrar a vidraria principal (pipetas. imediatamente após abri-los e antes de fechá-los. . 2. tubos. etc). realizar diluições seriadas. 2. (Atenção! flambar rapidamente a boca dos tubos contendo a solução de corante. Acender o bico de Bunsen (abrir primeiramente a válvula do bico de Bunsen e a seguir. Retirar uma pipeta de 1 mL da embalagem e acoplá-la ao pipetador. b.

Cite três procedimentos adotados em laboratório de microbiologia que minimizam o risco de contaminação ambiental. Fonte: VERMELHO (2006) Figura 5 . (Atenção! flambar rapidamente a boca do Erlenmeyer contendo a solução de corante. ou antes de fechá-lo.Esterilizador de alças e agulhas V – Questões para fixação de conhecimento 1. imediatamente após abri-lo. Figura 4 .Manobras assépticas. Qual a diluição final obtida no procedimento de diluição seriada realizado? 8 . 3. do operador e do material em estudo. Repetir quantas vezes forem necessárias até se obter domínio da técnica. Quais os principais objetivos das manobras assépticas? 2.4. Transferir aproximadamente 20 mL de solução de corante contida em Erlenmeyer para cada uma das placas.

o médico dinamarquês Christian Gram descobriu. empiricamente. a partir daí. que bactérias que eles continham não eram descoradas pelo álcool.Feixes cúbicos: sarcina . uma nova metodologia de coloração diferencial. o tratamento com álcool (ou álcool-acetona) extrai os lipídeos.Tétrades Divisão em três planos: .De forma não organizada: cocos em cachos (estafilococos) . precisando de um microscópio óptico comum. Forma: as bactérias podem ser classificadas quanto à forma em três grupos básicos:    Cocos: células esféricas. ao corar cortes histológicos com violeta de genciana. como células isoladas.3 por 0.Cocos: Divisão em um plano: . as quais são células flexíveis que se movimentam por rotação e flexão. ocasionalmente. Durante o processo de coloração de Gram. O mecanismo da coloração de Gram refere-se à composição da parede celular. e as Gram-negativas. daí resultando uma porosidade ou permeabilidade aumentada da parede celular das bactérias Gram-negativas. Surgiram muitas modificações. Algumas células comportam-se como bacilos curvos.Em cadeias: estreptococos Divisão em dois planos: . contudo sem afetar substancialmente a idéia original. Ao longo desses anos. não é possível visualizá-las a olho nu. existem as espiroquetas.8 m até 10 por 25 m. Sendo assim. podem aparecer os seguintes arranjos: . em geral. Assim. porém. uma fina camada de peptideoglicano sobre a qual encontra-se uma camada constituída de lipoproteínas.INTRODUÇÃO As células bacterianas são caracterizadas quanto aos seguintes aspectos: Tamanho: as bactérias são microscópicas. através do método de Ehrlich (1882). que podem ser denominados víbrios. Espirilos: células espiraladas. pode-se observar: bacilos aos pares (diplobacilos) ou em cadeias (estreptobacilos).Aos pares: diplococos . fosfolipídeos e lipopolissacarídeos.COLORAÇÃO DE GRAM E MORFOLOGIA BACTERIANA I . o complexo cristal 9 . Dependendo do plano e do número de divisões através das quais as bactérias continuam unidas. se previamente tratadas com solução de iodo. Bacilos: células cilíndricas. Arranjo: grupamentos bacterianos. medindo desde 0. Entre as bactérias espiraladas. Ele adicionou a este procedimento um contra-corante (safranina. o mecanismo da coloração de Gram foi intensamente estudado. fucsina básica) e estabeleceu.Bacilos e Espirilos: Apresentam-se. sendo que as Gram-positivas possuem várias camadas de peptideoglicano e ácidos teicóicos. Coloração de Gram Em 1884. em forma de bastonetes.

o complexo CV-I é retido na parede após tratamento pelo álcool-acetona. porosidade CV-I célula. relacionar a composição da parede celular das bactérias com os corantes de Gram. pela perda da capacidade de retenção do corante. uma diminuição do diâmetro dos poros da camada de peptideoglicano da parede celular. Outra explicação baseia-se também em diferenças de permeabilidade entre os dois grupos de bactérias. As culturas jovens respondem melhor à diferenciação tintorial. classificar as bactérias de acordo com a coloração de Gram. como por exemplo. torna-se desidratada durante o tratamento com álcool. violeta não da e diminuição permeabilidade. a permeabilidade é reduzida e o complexo CV-I não pode ser extraído. na etapa diferencial com álcool-acetona. 10 . A reação de Gram é extremamente dependente do estado fisiológico da célula. que deixa as células descoradas.OBJETIVOS Executar a técnica de coloração de Gram. De acordo com Trabulsi (2008). Os poros da parede das bactérias Gram-negativas permanecem suficientemente grandes. aumento da da porosidade. permanecendo violeta tornando-se vermelha. verificar a importância de realizar a coloração de Gram a partir de um material clínico. Conseqüentemente. mesmo após tratamento com álcool-acetona. o complexo iodo-cristal violeta poderá ser retirado da célula. alterando a permeabilidade aos solventes (álcool-acetona). têm o complexo corado extraído pelo álcool. devido à pequena espessura da camada basal e às descontinuidades existentes nesta camada.Formação do complexo CVI no interior da célula. A parede celular das bactérias Gram-positivas. Etapas da coloração de Gram e aspectos das células gram-positivas e gram-negativas Soluções e ordem de aplicação 1 – Cristal violeta 2 – Solução de lugol Reação e aspecto das bactérias Gram-positivas Coradas em violeta Gram-negativas Coradas em violeta Formação do complexo CV. podem causar danos à parede celular. em pontos de aderência entre a membrana externa e a membrana celular. a porosidade diminui. que I no interior da célula.violeta-iodo (CV-I) pode ser retirado e as bactérias Gram-negativas são descoradas. Nas bactérias Gram-positivas. sair da o complexo 3 – Álcool-acetona Desidratação celular. possibilitando a extração do complexo CV-I. provavelmente. A célula adquire o corante. excretadas normalmente por culturas envelhecidas. citar as formas das bactérias e descrever seus arranjos. II . As culturas velhas de Gram-positivas podem se apresentar com Gram variável. as bactérias Gramnegativas. o que causa.o complexo CV-I é removido da célula pode que permanece 4 – Fucsina ou safranina A célula não é afetada. Enzimas líticas. em virtude de sua composição diferente. que permanece violeta permanece violeta parede Extração dos lipídeos da da parede celular.

Em seguida. 6. 5. 2. Colocar uma pequena gota de solução salina fisiológica na superfície de uma lâmina. colocar duas alíquotas de cultura bacteriana preparada no meio líquido sobre a superfície de uma lâmina de microscopia. etc) mantidas em meio de cultura líquido ou em meio sólido. a) Preparação de esfregaço de microrganismos A partir de meio líquido: 1. b) Técnica de coloração de Gram 1. fazendo uma suspensão homogênea. Staphylococcus aureus. Cobrir todo o esfregaço com solução de cristal violeta. Flambar novamente a alça. Proteus mirabilis. Em seguida. A partir de meio sólido: 1. 4. Deixar o esfregaço secar à temperatura ambiente. Esperar a lâmina esfriar e realizar a coloração. 5. fazendo movimentos circulares de dentro para fora. 3. Com auxílio de uma alça de platina (ou de níquel-cromo) estéril. 3. com auxílio de uma alça de platina. esfriá-la e coletar o inóculo bacteriano. aguardar um minuto e desprezar o corante na pia. Esperar a lâmina esfriar e realizar a coloração. Flambar a alça e deixar o esfregaço secar à temperatura ambiente. passando duas ou três vezes a lâmina na chama do bico de Bunsen. Espalhar sobre a lâmina.III – MATERIAL . realizar a fixação. Flambar a alça. 4. 11 .             Cristal violeta para Gram Solução de Lugol Solução de fucsina ou de safranina para Gram Solução de álcool-acetona Solução salina fisiológica Microscópio óptico Bico de Bunsen Alça e agulha de inoculação Pinça Lâminas para microscopia Lenços de papel absorvente Óleo de imersão IV – MÉTODO As etapas da preparação do esfregaço a partir de meios líquido e sólido encontram-se na figura 6.Culturas de microrganismos (Escherichia coli. passando duas ou três vezes a lâmina na chama do bico de Bunsen. 2. realizar a fixação.

Desenhar as estruturas e arranjos observados. Explique como pode ser realizada a fixação do esfregaço. Cobrir todo o esfregaço com solução de lugol. 3. Inclinar a lâmina e gotejar solução álcool-acetona até que não haja desprendimento de corante (cerca de 30 segundos). Observar ao microscópio. com objetiva de imersão. Figura 6 . Cobrir o esfregaço com fucsina (ou safranina) e aguardar 30 segundos. aguardar um minuto e 30 segundos e desprezar o corante na pia. Lavar a lâmina rapidamente em água corrente.Seqüência de preparação de esfregaço. Lavar a lâmina e secá-la ao ar (sem esfregá-la). 12 . 5. 4. Fonte: VERMELHO (2006) V – Questões para fixação de conhecimento 1. 6.2.

2. Descreva a função de cada substância empregada na coloração de Gram. 13 . 4. na qual o operador deixou de realizar a etapa de lavagem com álcool-acetona terão que aspecto ao microscópio? Explique. Qual a importância de se realizar a fixação? 3. As células bacterianas gram-negativas submetidas à coloração de Gram.

Existem esporos ovais e esféricos. Neste método. Normalmente. Mas esta não é a única propriedade associada ao fenômeno. subterminal ou terminal. respectivamente. cromossomo. Do ponto de vista morfológico (forma. tamanho. Por esta razão. Algumas células desenvolvem um mecanismo de ordem genética. As técnicas de coloração usuais são ineficientes e o esporo se mostra impenetrável a corantes comuns. A desidratação gera uma estrutura muito densa e altamente refrátil (refringente). indubitavelmente. Quando colocado em um meio de cultivo adequado. Elas manifestam grande resistência ao calor. O contra-corante safranina é aplicado com a finalidade de diferenciar as células vegetativas dos esporos. O material genético.COLORAÇÃO DE ESPOROS BACTERIANOS – MÉTODOD DE WIRTZ I – INTRODUÇÃO Uma característica importante. substância ausente na estrutura de células vegetativas. congelamento. localizados no corpo da célula vegetativa em posição central. devido à grande quantidade de cátions Ca 2+ na célula. dificultando (e até mesmo impedindo) a ação de desinfetantes comuns sobre a estrutura queratinóide destas capas. o esporo pode permanecer estável por muitos anos. A membrana do esporo apresenta em sua composição o ácido dipicolínico. tais como cristal violeta. Tais propriedades estão associadas em parte à desidratação progressiva por que passa o citoplasma celular. o ácido dipicolínico encontra-se na forma de sal – dipicolinato de cálcio. Tal fenômeno também se verifica quando uma célula vegetativa. A esporulação é um processo demorado. o qual emprega o verde malaquita e safranina. dessecação. Isto. mostrando um aumento de resistência ao calor. está protegido por uma dupla camada oriunda da invaginação da própria membrana interna da forma vegetativa. causando deformações nas células. alterações químicas e radiações. desidratada é aquecida em um meio aquoso. e com dimensões variadas. Este fenômeno biológico é entendido como a formação de uma nova célula – o esporo. localização intracelular) os esporos desempenham importante papel na sistemática bacteriana. O esporo também é chamado de endósporo e difere química e fisiologicamente da célula que o originou. Um dos métodos mais empregados para a coloração de esporos é o de WIRTZ (1908). no interior de uma célula bacteriana. o qual pode levar horas para se completar. como corante e contra-corante. que vão de valores que permitem a inclusão do esporo no corpo celular até dimensões maiores. sem uma fonte externa de nutrientes. 14 . pois estes detalhes não são muito repetidos nas várias espécies. que lhes permite sobreviver em circunstâncias precárias. tanto morfológica quanto fisiológica de um grande número de bactérias Gram positivas pertencentes aos gêneros Bacillus e Clostridium é a esporulação. pode até ser ativado e dar origem a uma célula vegetativa capaz de se multiplicar. uma preparação a fresco de bactérias esporuladas pode ser rápida e satisfatoriamente observada através de um microscópio ótico de contraste de fase. azul de metileno. o calor é usado para facilitar a penetração do corante verde-malaquita através da parede do esporo. é reflexo da característica particular de seu envoltório. Uma vez formado. É indiscutível que a esporulação é um dos mais importantes eventos da fisiologia celular bacteriana. dependendo das condições de cultivo.

subterminal ou terminal V – Questões para fixação de conhecimento 1. 6. dimensão. 9. Quais gêneros bacterianos são capazes de formar esporos? 3. dimensão e localização intracelular do esporo. a presença. Identificar através da coloração. IV . Lavar em água corrente. que estruturas seriam observadas na lâmina após a coloração? 15 . 5. Deixar secar. Deixar esfriar. por 30 segundos. Fixar sobre a chama do bico de Bunsen (3 a 4 vezes). Corar rapidamente. Cobrir o esfregaço com uma solução aquosa de verde malaquita a 5% e aquecer até desprendimento de vapores durante 5 minutos sobre a chama do bico de Bunsen (ou em banho-maria a 100o C por 5 a 10 minutos). Se a coloração de Wirtz tivesse sido aplicada a um esfregaço proveniente de células de Bacillus subtilis reativadas há 24 horas sob condições ideais de cultivo. 10. Lavar em água corrente. Explique o que ocorre com as células de Bacillus subtilis quando estas são deixadas por vários dias em meio de cultura. preparar um esfregaço fino a partir de cultura de Bacillus subtilis mantida há vários dias em meio sólido (por exemplo: ágar triptona-soja). 2.INTERPRETAÇÃO  Células vegetativas: cor vermelha  Endosporo: cor verde  Bactérias não esporuladas: cor vermelha  Esporos bacterianos livres: cor verde Anotar os resultados. III . Em uma lâmina limpa.PROCEDIMENTO 1. 8. em relação à forma. Por que o esfregaço e a solução de corante verde-malaquita devem ser aquecidos? 4. 3.  Aspecto do bacilo: normal ou dilatado  Forma do endósporo: oval ou esférico  Localização do endósporo: central. forma e localização celular de esporos em bactérias. 2. acrescentando mais corante. 4. Deixar esfriar. 7. com uma solução aquosa de safranina a 1%.II – OJBJETIVOS Executar uma técnica de coloração específica para a visualização de esporos bacterianos. Observar ao microscópio ótico com a objetiva de 100 X (imersão). Não deixar a preparação secar. 11. Deixar secar ao ar naturalmente.

Triptose Sulfito Ciclosserina (TSC) . quando então são conhecidas as necessidades nutricionais específicas. O ágar é um polímero .PREPARAÇÃO DE MEIOS DE CULTURA I . cérebro. meio de carne cozida (com fragmentos de fígado . cuja função é solidificar os meios de cultura. a maioria das bactérias não metaboliza o ágar. provas bioquímicas. ou seja. quando Robert Koch e sua equipe introduziram os meios de cultura sólidos. os quais permitiram o estudo de espécies isoladas (culturas puras). Tendo em vista a ampla diversidade metabólica dos microrganismos. Geralmente. separando-as de espécies contaminantes. caldo lactosado (isolamento de Salmonella sp em alimentos). dentre outras. em fontes de carbono. Básicos são aqueles que permitem o crescimento bacteriano sem satisfazer. caldo e ágar simples). meios Shahidi Ferguson Perfringens (SFP). amido de tubérculos. etc.sulfato de ácido poligalacturônico. repiques de microrganismos. quando emprega ingredientes com composição química não definida. Os meios de cultura podem ainda ser classificados quanto à procedência dos constituintes em naturais ou complexos. umidade.) de animais (carne. adicionado de sangue e aquecido a 80°C). extraído de várias espécies de algas. temperatura. água peptonada tamponada. fígado. apresentando-se como um caldo. De acordo com a finalidade bacteriológica ou micológica. vitaminas. pressão osmótica. existem vários tipos de meios de cultura para satisfazerem as variadas exigências nutricionais. peptona de soja. dentre outros. Além dos nutrientes é preciso fornecer condições ambientais favoráveis ao desenvolvimento dos microrganismos. de modo a permitir o crescimento de microrganismos em tensões variadas de oxigênio ou a verificação da motilidade e também para conservação de culturas. energia. etc. microaeróbia ou anaeróbia). como meio de infusão de cérebro e coração. Os meios de cultura são classificados quanto ao estado físico em sólidos. Ex. contudo. de ágar. principalmente ágar entre 1 e 2%. etc. sintéticos ou ainda quimicamente definidos quando a composição química é conhecida (usados para trabalhos de pesquisa) e seus componentes servem para suprir as exigências nutritivas dos microrganismos.para anaeróbios). 16 . ágar chocolate (ágar simples fundido. dentre outros. caseína. dando uma consistência intermediária. utilizados para ativação das culturas. não contêm agentes solidificantes. nitrogênio.INTRODUÇÃO Até cerca de 1880 os microrganismos eram cultivados em meios líquidos.075 a 0. tais como pH. principalmente do gênero Gellidum. Baird-Parker (com gema de ovo) (meios ricos ou meios enriquecidos com as substâncias citadas). nenhuma exigência em especial (Ex.5 %. Especiais quando cumprem com as exigências vitais de determinados microrganismos. Quanto à composição química podem ser simples (meios básicos) ou complexos. Os meios de cultura consistem da associação qualitativa e quantitativa de substâncias que fornecem os nutrientes necessários ao desenvolvimento (cultivo) de microrganismos fora do seu meio natural. tais como extratos de vegetais (malte.) e de microrganismos (levedura) e artificiais. ágar sangue. quando contêm agentes solidificantes. sais minerais. para amostras que sofreram algum tipo de tratamento (térmico ou químico). Os meios semi-sólidos contêm de 0. atmosfera (aeróbia. os meios especiais podem ser classificados em: Meios de pré-enriquecimento são aqueles que permitem a recuperção/multiplicação de microrganismos injuriados. os meios líquidos. tomate.

Seletivos .quando contêm substâncias que permitem estabelecer diferenças entre microrganismos muito parecidos. Caldo Tioglicolato para Clostridium perfringens. meio com leite. mas existem alguns que também podem inibir o crescimento de outros. Diferenciais . meio Escola Paulista de Medicina – EPM. meios com sais biliares e verde brilhante para isolamento seletivo de Salmonella. Ágar MacConkey para a diferenciação de Enterobactérias. garantem a viabilidade de microrganismos (ágar Sabouraud. Ágar sangue. indol. Exemplo: meios com telurito de potássio (para isolamento de Corynebacterium diphtheriae). ágar Salmonella-Shigella (SS) e ágar MacConkey. Dosagem . ágar citrato. meio motilidade. ágar simples. caldo triptofano. Ex. ou seja. etc. meio semi-sólido. 17 . meio semi-sólido. etc. Meios de triagem . etc. Contagem . caldo ou ágar uréia.) Identificação – utilizados na realização de provas bioquímicas e verificação de funções fisiológicas de organismos submetidos à identificação (meios Oxidação/Fermentação.empregados nas determinações de vitaminas. permitindo o crescimento de outros. etc. SFP.meios que avaliam determinadas atividades metabólicas permitindo caracterização e identificação perfunctória ou presuntiva de muitos microrganismos (ágar tríplice açúcar e ferro. antibióticos e aminoácidos.empregados para a determinação quantitativa da população microbiana (ágar de Contagem padrão em placas – PCA. meios com antibióticos para isolamento de diversos microrganismos (TSC. etc). ágar sangue.Meios de Enriquecimento . ágar triptona de soja – TSA.). meio Baird-Parker. permitindo diferenciar as colônias (sólidos) dos microrganismos.quando proporcionam nutrientes adequados ao crescimento de microrganismos presentes usualmente em baixos números ou de crescimento lento. agar Baird-Parker para isolamento e diferenciação de cocos Gram positivos (sólidos). de diluentes. meios com 7. tais como meio de Eosina Azul de Metileno – EMB (diferencial para coliformes). ágar Baird-Parker. II – OBJETIVOS Familiarizar-se com técnicas de preparação e esterilização de meios de cultura sólidos e líquidos. meio de sulfito indol motilidade. Caldo Tetrationato e Selenito-Cistina para cultivo de Salmonella sp (líquidos).os que contêm substâncias que inibem o desenvolvimento de determinados grupos de microrganismos. caldo nitrato. Esses meios têm a propriedade de estimular o crescimento de determinados microrganismos. para isolamento de Staphylococcus aureus.utilizados para conservação de microrganismos no laboratório. ágar triptona de soja.5% de cloreto de sódio. lisina – MILi. para fungos. ágar batata dextrose . A maioria deles é também diferencial. além do preparo de pipetas e placas de Petri para posterior utilização. bem como microrganismos exigentes e fastidiosos.) Estocagem ou manutenção .PDA.

Em um béquer de 250 mL. 4. um béquer de vidro ou lata de alumínio). 2. porém se for necessário utilizar algumas substâncias termolábeis (por exemplo: uréia) ou que reajam com as substâncias dos meios (aminoácidos. Acondicionar os tubos em um suporte adequado (por exemplo. e depois incorporadas. com auxílio de proveta. pesar 0. Esterilizar o meio de cultura em autoclave à temperatura de 121o C por 15 minutos. Preparação de meio de cultura sólido de uso geral 1.22 m de diâmetro (Millipore. açúcares). 2. Preparação de solução fisiológica (0. Adicionar tampão de algodão e gaze. 2. C. armazená-la em geladeira ou em lugar fresco.85 g de cloreto de sódio (NaCl) e adicionar 100 mL de água destilada. protegendo-os com papel manilha ou kraft. 5. Em um Erlenmeyer ou outro recipiente apropriado de 250mL. pesar quantidade necessária para o preparo de 100 mL de meio de cultura não seletivo (por exemplo: Ágar Padrão para Contagem – PCA ou Ágar Triptona de Soja . 5 mL de caldo para tubos de ensaio com tampa rosqueável (Atenção! Não fechar completamente as tampas dos tubos). as mesmas são esterilizadas à parte por filtração. Em um béquer de 150 mL. agitar até completa dissolução do meio e cultura. armazená-la em geladeira ou em lugar fresco. Aquecer em banho-maria (ou em chama de bico de Bunsen).III . agitar até completa dissolução. Observação: Alguns meios de cultura são preparados da mesma forma. Com auxílio de um bastão de vidro. B. através de membranas (de nitrocelulose ou acetato de celulose) com poros de 0. Após esterilização. Preparação de meio de cultura líquido – caldo triptona e soja 1. 5. proteger o tampão com papel manilha ou Kraft (ou similar). Transferir. Acondicionar os tubos em um suporte adequado (por exemplo. protegendo-os com papel manilha ou kraft. Sartorius). até completa dissolução do meio de cultura (o meio torna-se translúcido). 3. um béquer de vidro ou lata de alumínio). Esterilizar o meio de cultura em autoclave a 121o C por 15 minutos. Após a esterilização. com auxílio de pipeta graduada. 4. 5 mL de solução para tubos de ensaio com tampa rosqueável (Atenção! Não fechar completamente as tampas dos tubos). agitando freqüentemente com auxílio de bastão de vidro.85% de NaCl) estéril 1. Esterilizar o meio de cultura em autoclave a 121o C por 15 minutos. 3. Transferir. 18 . 5. armazenar o meio de cultura em geladeira (ou em lugar fresco e ao abrigo da luz). com auxílio de pipeta graduada.PROCEDIMENTOS A. Com auxílio de um bastão de vidro. assepticamente. 4. Após esterilização. ao meio previamente esterilizado.TSA) e adicionar 100 mL de água destilada. 3. pesar quantidade necessária para o preparo 50 mL de caldo triptona e soja – TSB e adicionar 100 mL de água destilada.

IV – Questões para fixação de conhecimento 1.D. embrulhar 4 placas de Petri e 5 pipetas graduadas de 2 mL em papel manilha (ou similar). Esterilizar este material em estufa a 180o C por 1 hora ou em autoclave a 121o C por 15 minutos (neste caso. como os meios de cultura são classificados? 2. Cite dois exemplos de meios de cultura que sejam simultaneamente seletivos e diferenciais. De acordo com orientação de seu professor. Após esterilização. Cite o nome de um meio de cultura utilizado na manutenção de culturas bacterianas. 4. 2. Preparação de pipetas e placas de Petri para esterilização 1. De acordo com o estado físico. 3. armazená-lo em lugar seco. 3. Por que o tempo de esterilização é maior em estufa a 180ºC do que em autoclave a 121ºC? 19 . o material deverá ser seco em estufa antes de ser utilizado).

3. 12. respectivamente). através de calor úmido (vapor d’ água). fechar a válvula. Observar o manômetro/termômetro e aguardar até atingir a pressão e a temperatura desejadas (geralmente: 1 atm e 121ºC. 7. a. a. abrir a válvula (situada na tampa) para que haja saída total do vapor. Fechar a autoclave através de suas presilhas de segurança. A figura II – OBJETIVOS Demonstrar o funcionamento de uma autoclave vertical elétrica e manual. Funciona sob altas pressões e temperaturas. 11. b. Com auxílio de luvas de cano longo retirar da câmara o material esterilizado. 14. 9. como meios de cultura e instrumentação cirúrgica. Com auxílio de luvas de cano longo. b. Abrir todas as presilhas de segurança e finalmente. Assim que se atingirem pressão e temperatura desejadas. 15 minutos). de acordo com as normas de segurança. desligar o equipamento. Aguardar que a temperatura decaia para 100º C (ou menor).PROCEDIMENTO 1. 6. Ligar a autoclave. resistência para aquecimento da água e geração de vapor 20 . 4. 8. III . Após o tempo de esterilização.ESTERILIZAÇÃO DE MATERIAIS EM AUTOCLAVE I – INTRODUÇÃO A autoclave é um equipamento bastante empregado na esterilização de materiais. 13. Adicionar água limpa e em quantidade suficiente à autoclave. deixando o botão de controle de velocidade de aquecimento no máximo. indicando que o ar quente foi expulso e a câmara está saturada de vapor. exigindo muito cuidado e atenção durante sua operação. 2. Deixar a válvula (situada na tampa da autoclave) aberta até perceber a saída de vapor condensado. Abrir cuidadosamente a tampa da autoclave. cesto.Autoclave vertical. levantar a tampa. Assim que o vapor começar a sair pela mangueira. 5. Atenção!!! Não deixar que haja oscilação da pressão e temperatura! Posicionar o contra-peso (situado na tampa da autoclave) para frente para diminuir a pressão ou para trás para aumentar a pressão. reduzir a velocidade de aquecimento e marcar o tempo de esterilização (geralmente. Figura 8 . Colocar o cesto contendo o material a ser autoclavado (distribuir adequadamente os recipientes de maneira a permitir que o vapor permeie todos eles). 10.

3. rampa. 4.OBJETIVOS 1. Selecionar algumas colônias para serem submetidas à coloração de Gram. III – INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS 1. superfícies e ar. IV – Questões para fixação de conhecimento 1. região inferior da unha. língua. ouvido. 3. espalhá-lo na superfície dos meios de cultura. saguão. etc) durante 15 minutos. Expor uma placa com o meio de cultura solidificado em um local de sua preferência (laboratório. unhas sobre os meios de cultura. superfície das mãos. em seguida. Tocar suavemente a extremidade dos dedos na superfície dos meios de cultura. gram) das colônias submetidas à coloração. (Atenção! Realizar esta etapa de distribuição dos meios de cultura na “zona de segurança” da chama do bico de Bunsen para evitar contaminação). espalhá-lo na superfície do ágar (cuidado para não romper o ágar!). Soprar. 2.PROCEDIMENTOS 1.ESTUDO DA CONTAMINAÇÃO AMBIENTAL E DA MICROBIOTA HUMANA 1 . Aplicar as técnicas de manobras assépticas. Depositar alguns fios de cabelo. realizar algumas das seguintes opções: Friccionar um swab previamente umedecido em solução salina estéril na bancada e. Expor as placas abertas ao fluxo de saída de ar de um aparelho de ar-condicionado por alguns segundos. aspectos. Incubar as placas a 35º C por 48 horas. com diferentes tamanhos. tossir ou espirrar sobre a superfície dos meios. em seguida. Verter o meio de cultura “ágar de contagem padrão” ou ágar triptona de soja previamente fundido em banho-maria em placas de Petri estéreis. Com as placas restantes. Descrever as características (morfologia. 5. arranjo. Fazer o mesmo em outro tipo de superfície. Verificar a presença de microrganismos em partes do corpo humano. Com auxílio de um swab. 2. 4. cor. retirar material de partes do corpo humano: saliva. Qual técnica pode ser empregada para se estimar o grau de contaminação microbiana presente em um ambiente? Como esta técnica é denominada? Quais suas vantagens e limitações? 21 . Aguardar a solidificação dos meios de cultura nas placas. Observar os diferentes tipos de bactérias e fungos. Quais os cuidados que devem ser observados durante a distribuição de meio de cultura estéril nas placas de Petri? 2. 2. elevador. 2 . Observar a presença de diferentes colônias na superfície dos meios de cultura. nariz e.

físicos. dentre outras. do Ministério da Saúde (BRASIL. comercialmente disponíveis. NOTAS: (1) Valor Máximo Permitido. apresentado na Tabela abaixo: Padrão microbiológico de potabilidade da água para consumo humano PARÂMETRO Água para consumo humano (2) (3) VMP (1) Escherichia coli ou coliformes termotolerantes Água na saída do tratamento Coliformes totais Ausência em 100mL Ausência em 100mL Água tratada no sistema de distribuição (reservatórios e rede) Escherichia coli ou coliformes termotolerantes Coliformes totais (3) Ausência em 100mL Sistemas que analisam 40 ou mais amostras por mês: Ausência em 100mL em 95% das amostras examinadas no mês.ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DE ÁGUA ONT I – INTRODUÇÃO Entende-se por água potável a água para consumo humano cujos parâmetros microbiológicos. (3) a detecção de Escherichia coli deve ser preferencialmente adotada. 2004). Podem-se também empregar recipientes descartáveis (sacos plásticos) previamente esterilizados. Sistemas que analisam menos de 40 amostras por mês: Apenas uma amostra poderá apresentar mensalmente resultado positivo em 100mL.PROCEDIMENTOS a) Seleção e preparação dos frascos para coleta das amostras de água Utilizar frascos com tampas à prova de vazamentos. de preferência. (2) água para consumo humano em toda e qualquer situação. químicos e radioativos atendam ao padrão de potabilidade e que não ofereça riscos à saúde (BRASIL. minas. nascentes. 22 . 2004). incluindo fontes individuais como poços. II – OBJETIVOS Avaliar a qualidade microbiológica de amostras de água de abastecimento e de água mineral. de material aprovado para contato com água destinada ao consumo humano e. de 25 de março de 2004. III . A água potável deve estar em conformidade com o padrão microbiológico estabelecido pela Portaria nº518. autoclaváveis ou pré-esterilizados.

Inoculação: através de pipeta estéril. para evitar correntes de ar.Procedimento para coleta: . 15 a 20 mL de ágar padrão para contagem (PCA). adicionar 1 mL e 0. chama azulada. numa superfície plana. preferencialmente. Desprezar o volume inicial e coletar a amostra em um frasco estéril. reservando a outra metade como contra-amostra. flambar. Para tal. 8 a 10 vezes no sentido horário e 8 a 10 vezes no sentido anti-horário. ou a eficiência das diversas etapas de tratamento. 3. deve-se submeter metade à análise. etc) devem ser previamente esterilizados em autoclave ou estufa de esterilização ou mergulhados em etanol 70% e flambados no momento do uso. permitindo ainda verificar as condições higiênicas em diferentes pontos da rede de distribuição. no caso de águas tratadas. 0.8% para cada 100 mL de água que se pretende coletar. c) Métodos de análise de água I. distribuindo as placas numa superfície plana. lacrada. se o material for resistente ao calor. 2. inverter as placas e incubar a 35o C por 48 horas. antes da esterilização. deve-se trabalhar na região próxima à chama do bico de Bunsen de tamanho médio. para remoção dos contaminantes presentes. desinfetar o bocal com etanol 70% e. Incubação: aguardar a completa solidificação do meio de cultura. invertendo a embalagem várias vezes.1 mL da amostra de água em placas de Petri vazias estéreis. com as portas e janelas do laboratório fechadas. Após a solidificação.assepticamente. facas. no caso das águas minerais. a partir de embalagens de maior capacidade. adicionar ao frasco de coleta. Havendo necessidade de coletar volumes menores. 23 .plaqueamento em profundidade (“pour plate”) Também conhecida como contagem padrão em placas. particularmente como uma ferramenta para acompanhar variações nas condições de processo.Água de torneira ou tubulações: limpar a área externa da saída com etanol 70%. Contagem de heterotróficos.Água mineral engarrafada: deve ser coletada na embalagem original. 1. A abertura e a retirada da unidade analítica devem ser feitas. Se não houver fluxo laminar. . deixar a água fluir por 2 a 3 minutos. para prevenir qualquer contaminação da amostra. deve-se homogeneizar todo o conteúdo. no interior de câmaras de fluxo laminar.1 mL de solução de tiossulfato de sódio a 1. é um procedimento que objetiva estimar o número de bactérias heterotróficas na água. pinças. previamente fundido e resfriado a 45o C. espátulas. b) Abertura das embalagens e tomada da unidade analítica: antes de abrir as embalagens deve-se desinfetar a área externa com etanol 70%. Amostras de água clorada devem ter o cloro totalmente neutralizado imediatamente após a coleta. Adição do meio de cultura: verter nas placas inoculadas. em movimentos na forma de oito ou em movimentos circulares. Se a quantidade de amostra encaminhada para análise for menor do que a unidade analítica requerida. abrir o lacre com uma faca ou tesoura estéril ou flambada. Misturar o inóculo com o meio de cultura movimentando suavemente as placas. Todos os instrumentos e utensílios empregados na abertura das embalagens e retirada das unidades analíticas (tesouras.

A partir de cada tubo positivo no item anterior.2. não esporogênicos. restringindo-se aos membros capazes de fermentar a lactose com produção de gás. Em caso negativo. adicionar 5 porções de 10 mL em 5 tubos contendo 10 mL de caldo lauril sulfato triptose (LST) em concentração dupla com tubo de Durhan. 2. dada a alta incidência de E. coli. a presença de coliformes fecais em água e alimentos é menos representativa. capazes de fermentar a lactose com produção de gás em 24 a 48 horas a 35o C. Por este motivo. 2. Número Mais Provável de Coliformes Totais e Termotolerantes – Técnica dos Tubos Múltiplos Introdução Grupo dos coliformes totais: este grupo inclui as bactérias na forma de bastonetes Gram negativos. Grupo dos coliformes termotolerantes: a definição é a mesma dos coliformes totais. dentre os quais encontram-se tanto bactérias do trato intestinal de humanos e de outros animais de sangue quente. sua quantificação em água e alimentos é menos representativa. Incubar os tubos a 35o C/24h e observar se há crescimento (turvação) com produção de gás. O grupo inclui cerca de 20 componentes. A não ocorrência gás após 48 h. Esta definição objetivou.Contagem as colônias e cálculo dos resultados: selecionar as placas com 30 a 300 colônias e contar as colônias com o auxílio de uma lupa. reincubar até completar 48 horas e repetir a leitura. UFC/mL = No de colônias/diluição II. confirmativo de coliformes totais. indica ausência de coliformes (totais ou fecais) nos 50 mL de amostra. Usar notação exponencial e apenas uma casa decimal depois da vírgula. como indicação de contaminação fecal. porém muito mais significativa do que a presença de coliformes totais. em caso de crescimento com produção de gás. passando para os itens subseqüentes. 24 . Enterobacter e Klebsiella. como indicação de contaminação fecal do que a enumeração direta de E. selecionar apenas os coliformes originários do trato intestinal. porém. transferir uma alçada bem carregada de cultura para tubos de caldo Verde brilhante (VB). em 24 horas a 45. Confirmação de coliformes totais: 1. Por essa razão. Com uma pipeta de 10 mL estéril. como Serratia e Aeromonas. Anotar o número de tubos de VB com gás e determinar o Número Mais Provável (NMP) de coliformes totais/50mL em tabela de NMP apropriada às diluições inoculadas (Tabela 1). Incubar os tubos a 35 oc por 24 a 48 h e observar se há crescimento com produção de gás. sabe-se. Em caso positivo. Teste presuntivo: 1. passar aos itens subseqüentes.5o C. II. em um contador de colônias. em princípio. Escherichia.1. aeróbias ou anaeróbias facultativas. na apresentação dos resultados. Atualmente. coli. II. dos quais dois (Enterobacter e Klebsiella) incluem cepas de origem não fecal. entretanto que o grupo dos coliformes fecais inclui pelo menos três gêneros. do que a quantificação de coliformes fecais ou de E. coli no grupo fecal. como também diversos gêneros e espécies não entéricas. Calcular o UFC por mL da amostra multiplicando o número de colônias pelo inverso da diluição inoculada.

Expresse os resultados em NMP de coliformes/100mL de amostra.3. Os procedimentos para coleta de amostras de água mineral e de água de torneira ou de tubulações são exatamente os mesmos? Por quê? 3. Explique como os microrganismos coliformes são classificados em nível laboratorial. 2.2 2. 4. As contagens de UFC em cada uma das placas foram: 68 e 77. Expresse o resultado em UFC de heteroróficos por mL de água analisada.4 7. A não ocorrência de gás após 48 h de incubação indica ausência de coliformes totais na amostra. II. seguido de incubação a 35-37ºC por 48 horas.3. Uma alíquota de 0. Confirmação de coliformes termotolerantes: 1. (2005) NMP/50mL < 2.2 10. Número de tubos positivos 1 2 3 4 5 Fonte: SILVA et al. encontraram-se: a) 4 tubos de caldo verde brilhante turvos e com gás b) 3 tubos de tubos de caldo EC turvos e com gás. empregando-se 5 tubos. Incubar os tubos a 45.1mL de água mineral foi inoculada. A não ocorrência de gás após 24 h indica ausência de coliformes termotolerantes na amostra. confirmativo de coliformes termotolerantes. Número Mais Provável (NMP) . IVIIV .nível de 95% de probabilidade. Em uma análise de coliformes em água pela técnica do Número Mais Provável.1) transferir uma alçada bem carregada da cultura para tubos de caldo EC.2 IV – Questões para fixação de conhecimento 1. 2.V NAÇÃO 25 . 3. A partir de cada tubo positivo de LST (item II. para diversas combinações de tubos positivos e negativos na inoculação de 5 alíquotas de 10 g ou 10 mL da amostra por tubo. em duplicata.2 4. 5. através da técnica de semeadura em profundidade (pour plate) em ágar padrão para contagem (PCA). Anotar o número de tubos de EC com gás e determinar o NMP de coliformes fecais/50mL em uma tabela de NMP apropriada às diluições inoculadas (Tabela1).5o C por 24 h e observar se há crescimento com produção de gás.

coli utiliza ßglucuronidase para metabolizar MUG e criar fluorescência. eles utilizam ß-galactosidase para metabolizar o indicador de nutriente ONPG e alterá-lo de incolor para amarelo. Amarelo/Fluorescência azul: teste positivo para presença de E. coli. À medida que os coliformes se reproduzem no Colilert. eles não podem se reproduzir e interferir. E. Amarelo: teste positivo para presença de coliformes totais. Interpretação dos resultados .DETECÇÃO DE COLIFORMES EM ÁGUA – MÉTODO CROMOGÊNICO ONT ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DE ÁGUA Essa metodologia emprega substratos cromogênicos e fluorogênicos para detecção simultânea de coliformes totais e de Escherichia coli.COLILERT Incolor: frasco com 100 mL de amostra de água. Os poucos não coliformes que têm estas enzimas são seletivamente suprimidos pela matriz especificamente formulada do Colilert. Juma vez que a maioria dos não coliformes não conta com estas enzimas. AMBIENTAL 26 . Basta adicionar o reagente à amostra de água e incubar a 3537ºC por 18 a 48h (até 24h para COLILERT – da IDEXX e até 48 h para COLITEST – LKP Diagnósticos). abordagem diminui a incidência de falso-positivos e falso-negativos.

Passos para uso do COLITEST: 1) Coletar a amostra de água até a marca de 100mL 2) Adicionar o meio de cultura COLItest. incubando-o a 37ºC por 18-48h 3) Interpretação dos resultados: 27 .

SILVA. da..REFERÊNCIAS RIBEIRO.. 239 p. A. A. A.. bacterias e fungos . M. 28 . 3. SILVA. 164 p. N. A. Manual de métodos de análise microbiológica da água. M. A. São Paulo: Varela. V. e atual São Paulo. SILVEIRA. F. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan. N. R. S. C. SP: Atheneu. rev. Microbiologia pratica: roteiro e manual. ed. da. F. C. SILVEIRA. 2000. B. JUNQUEIRA. JUNQUEIRA. 112p. M. R. São Paulo. N. 2006. 536 p VERMELHO. SP: Livraria Varela. Manual de métodos de análise microbiológica de alimentos. 2007. C. N. 2005. CANTÚSIO NETO. Práticas de microbiologia. V.. SOARES.