Aulas Práticas do Laboratório de Microbiologia

2011

HAMILTON R. F. BAVUTTI MARCOS LUENGO BLANCO MARIA RAQUEL MANHANI

BIOSSEGURANÇA EM LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA
1. O trabalho no laboratório de microbiologia exige, obrigatoriamente, o uso de epi: avental de mangas longas, com elástico nas mangas, fechado; óculos; touca; máscara facial; luvas; sapatos fechados ou pró-pés; 2. Evitar o uso de lentes de contato (preferir óculos) e maquiagem; 3. Não fumar, não comer, não beber; evitar tocar a boca e outras mucosas ou pele; 4. Não deixar cadernos, canetas, livros, bolsas, sacolas, dentre outros na bancada de trabalho – eles devem ser colocados em locais onde não haja risco de contaminação; 5. Cuidado com a chama do bico de Bunsen (figura 1), que deverá estar acesa durante a maior parte do tempo; 6. Desinfetar a bancada no começo e no fim do trabalho com solução de álcool 70% ou outra similar (cuidado! Verifique se o bico de Bunsen não está aceso!!!); 7. Ler atentamente o protocolo da aula prática e não iniciar o trabalho antes de ter certeza sobre o que fazer, a cada passo; 8. Antes de iniciar o trabalho assegure-se de que tem, à mão, todo o material necessário – não pegar mais material que o necessário nem material indevido; 9. Todo o material deve ser devidamente identificado; 10. Utilizar corretamente as técnicas de manuseio de culturas microbianas: 11. Não falar durante o manuseio das culturas, para minimizar o risco de contaminação das mesmas; 12. Relatar imediatamente, ao professor ou técnico, qualquer evento, acidente ou imprevisto; 13. Quando terminar de trabalhar com culturas, retirar as luvas e descartá-las em lixo infectante, lavar as mãos com sabonete antisséptico ou similar; deixar secar ao ar; 14. Guardar todo material usado no local apropriado e deixar as bancadas em ordem ao fim do trabalho; 15. O lixo deverá ser adequadamente acondicionado e todo material contaminado deve ser autoclavado para descontaminação antes de ser descartado ou reutilizado; 16. Retirar todos os EPIs (avental, luvas, óculos de segurança) quando sair do laboratório; 17. Depois de usar o microscópio, desligar a luz e limpar a objetiva com lenço de papel fino embebido em solução apropriada para limpeza das lentes, para retirar o óleo de imersão. Várias precauções devem ser obrigatoriamente tomadas durante os procedimentos no laboratório de Microbiologia para evitar a contaminação das pessoas, do ambiente e das culturas: Qualquer procedimento só deve se iniciar depois que todos os objetos necessários estejam o mais próximo possível do operador e deve ser realizado o mais rapidamente possível; Os frascos que precisam ser abertos devem ser fechados o mais rapidamente possível; o trabalho deve ser feito ao redor do bico de Bunsen e não são admitidas correntes de ar;

Figura 1 – Bico de Bunsen

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superfície da bancada. 3.Todos os frascos abertos devem ter suas “bocas” flambadas imediatamente. sem colocá-la em nenhum local (para que ela não se contamine outra vez). impedindo a entrada de contaminantes. Os movimentos que devem ser realizados na flambagem de alças e agulhas encontram-se na figura 2. Usar imediatamente.   alças calibradas: que carregam um volume conhecido do material. aquecimento rápido pode produzir a liberação de pequenas gotículas e formação de aerossóis. podendo ser usadas em "Flambagem": aquecimento gradual da ponta da alça. por exemplo. 6. Quando você flamba o tubo. Mover a alça para que toda a extensão seja aquecida adequadamente ("ao rubro"). 3 . Posicionar a ponta da alça na região azul claro da chama . alternativamente ela pode ser resfriada nas paredes internas de um tubo ou placa de Petri (regiões estéreis). o determinações quantitativas. mantendo-a na mão. panos. Esfriar a alça no ar. pois depois do uso em culturas. Essa posição deixa o dedo mínimo livre para segurar os tampões dos tubos. etc. 4. Os tampões de algodão ou roscas dos frascos não podem ser largados nem colocados sobre nenhuma superfície. paredes externas de placas ou tubos. como se faz com um lápis (dedo polegar. que força o ar para fora. num ângulo próximo à posição vertical. na posição mais horizontal possível e deve ter sua “boca” novamente flambada antes de ser fechado. Flambagem de alças e agulhas de platina ou de níquel-cromo  alça de níquel-cromo: Segura-se a alça perto de sua parte superior. eles devem ser mantidos abertos ao redor do bico de Bunsen. as superfícies internas estéreis das placas de Petri devem entrar em contato com o ar o menor tempo possível. entre o dedo mínimo e a palma da mão durante todo o procedimento Durante as manipulações.essa é a região "fria" da chama. o calor cria uma corrente de convexão. 5. Deve-se proceder da seguinte maneira: 1. devem permanecer na mão do operador. acima do cone azul claro. As partes estéreis de alças ou pipetas que entrarão em contato com as culturas ou com frascos estéreis não podem ser tocadas nem entrar em contato com outras superfícies não estéreis como. 2. Mover lentamente a alça para dentro da região mais quente da chama. indicador e médio). 1. mantendo-a até que fique completamente vermelha. Re-esterilizar a alça imediatamente após o uso.

Depois de usar. não se esqueça. mantendo o seguro entre esse dedo e a palma da mão (para retirar o tampão. Segure o tubo com a mão esquerda e retire o tampão com dedo mínimo da mão direita. próximo à chama Aqueça gradualmente toda a extensão "ao rubro" Figura 2 – Seqüência para flambagem de alça e de agulha de inoculação 2. recolocando o tampão. Feche o tubo. rodando o tubo e não o tampão. para que ele saia facilmente. dentro da chama do bico de Bunsen enquanto isso. Flambagem de tubos e frascos Afrouxe o tampão do frasco ou tubo. A seqüência de flambagem de tubos e frascos encontra-se na figura 3. 4 .Segure a alça como se fosse um lápis. antes de fechar. Passe a boca do tubo para frente e para trás.o tampão fica fixo). rode o frasco e não o tampão . quase na vertical Posicione a ponta na região fria da chama Esfrie no ar. o tampão fica preso na mão do operador. repita a operação acima.

imediatamente após o uso. previamente esterilizadas. Manuseio de pipetas As pipetas graduadas ou de Pasteur. com algodão na ponta. acondicionadas em recipientes especiais ou individualmente embrulhadas devem ser manuseadas na frente do bico de Bunsen.Remova o tampão com o dedo mínimo Segure o tampão entre o dedo e a palma da mão Passe a boca do tubo dentro da chama Recoloque o tampão. Não encostar a ponta da pipeta em regiões não estéreis dos tubos. para ser transportada. 5 . A pipeta contaminada deve ser colocada em um frasco com desinfetante. girando o tubo Figura 3 – Flambagem de tubos e frascos 3. Segurá-las pela região do bocal. como um lápis. colocando o aspirador e mantendo o dedo mínimo livre para abrir o frasco que contem o líquido a ser transferido.

3. As técnicas referentes à manipulação de culturas envolvem basicamente: 1. Estas impedirão que microrganismos presentes no ar ou depositados sobre as diversas superfícies com a poeira. Trabalhar em áreas submetidas previamente à limpeza e à desinfecção. Flambar rapidamente a boca dos tubos contendo microrganismos ou meio estéril.INTRODUÇÃO As manobras assépticas são técnicas que impedem a entrada de microrganismos onde estes não são desejados. 4. os recipientes (tubos de ensaio. dentro da zona de segurança. agitação intensa. sem que haja perigo de superaquecimento ou queimaduras. Também impedem que os microrganismos com que estamos trabalhando nos contaminem ou ao ambiente. etc) com meio de cultura devem ser abertos o mais próximo possível da chama do bico. garantem a boa assepsia. placas de Petri. 5. ou seja.MATERIAL NECESSÁRIO pipetador pipetas de 1 mL e 10 mL embaladas em papel kraft ou similar estante para tubos tubos de ensaio contendo 10 mL de solução de corante (simulando meio de cultura estéril) tubos de ensaio contendo 9 mL de água (simulando diluente estéril) alça de platina ou de níquel-cromo tubos de ensaio vazios Erlenmeyer contendo 200 mL de solução de corante (simulando meio de cultura estéril). como por exemplo.MANOBRAS ASSÉPTICAS I . venham a contaminar materiais estéreis do laboratório como meios de cultura. seguidas da abertura do frasco que contém a suspensão microbiana devem ser realizadas em cabine de segurança (capela de fluxo laminar vertical) e alças e agulhas devem ser esterilizadas em forno esterilizador (Figura 5). culturas puras de microrganismos. imediatamente após abri-los. A tampa nunca deve ser colocada sobre a bancada. centrifugação. Flambar ao rubro alça ou agulha antes e após cada inoculação. Desembrulhar a pipeta estéril dentro da zona de segurança. flambá-la rapidamente e mantê-la nesta região durante todo o trabalho. com tampão de algodão - 6 . para reduzir o número de potenciais microrganismos contaminantes. 2. ou antes de fechá-los. * Operações com microrganismos patogênicos que podem gerar aerossóis. Trabalhar dentro da “zona de segurança” do bico de Bunsen*. preferencialmente na parte interna do recipiente que contém o meio de cultura. Deixar esfriar o instrumento antes de obter o inóculo. ou seja. soluções e equipamentos ou. ainda. II . 6. sendo retirada e mantida segura pelo dedo mínimo da mão que detém a alça ou agulha durante a inoculação. Os procedimentos 2 a 5 estão ilustrados na Figura 4.

OBJETIVOS bico de Bunsen placas de Petri embaladas em papel Kraft ou similar 1. . transferir. a válvula da tubulação de gás). transferir 1 mL para outro tubo contendo 9 mL de água. sendo retirada e mantida segura pelo dedo mínimo da mão que detém a alça ou agulha durante a inoculação. 2. Agitar suavemente até que o corante se distribua de maneira uniforme. 3. Parte B. Repetir quantas vezes julgar necessárias até o domínio da técnica. Retirar uma pipeta de 1 mL da embalagem e acoplá-la ao pipetador. etc) e outros objetos de frequente manipulação (alça. Mostrar a vidraria principal (pipetas. usando pipeta estéril de 1 mL. para outro tubo vazio. c.Transferência de meio de cultura contido em Erlenmeyer para placas de Petri 1. etc). Retirar as placas vazias da embalagem e mantê-las próximas ao bico de Bunsen. de maneira asséptica (próximo ao bico do Bunsen).Transferência de caldo estéril para tubos previamente esterilizados 1. A partir do tubo contendo solução de corante. Deste último tubo. realizar diluições seriadas. transferir 1 mL para outro tubo contendo 9 mL de água. Identificar e manipular corretamente a vidraria principal e outros objetos de uso mais frequente em Microbiologia. bico de Bunsen. 4.PROCEDIMENTOS Parte A. a válvula da tubulação de gás). agulha de inoculação. este procedimento deve ser realizado na zona de segurança do bico de Bunsen). 3. Treinamento de manobras assépticas . Realizar a desinfecção da bancada de trabalho. 1 mL para tubo contendo 9 mL de água. A tampa nunca deve ser colocada sobre a bancada. distribuir meios de cultura estéreis em placas de Petri previamente esterilizadas. manipular tubos contendo meios estéreis.III . imediatamente após abri-los e antes de fechá-los. agitando suavemente. Acender o bico de Bunsen (abrir primeiramente a válvula do bico de Bunsen e a seguir. (Atenção! Este procedimento deve ser realizado na zona de segurança do bico de Bunsen). 7 . b. IV . . tubos. placas. contida em um tubo. (Atenção! flambar rapidamente a boca dos tubos contendo a solução de corante. 2. Desenvolver habilidade de: a. Descrever as principais técnicas de manobras assépticas.Realização de diluições seriadas 1. com auxílio de pipeta de 1 ou 2 mL. A partir deste tubo. Realizar a desinfecção da bancada de trabalho. 2. Acender o bico de Bunsen (abrir primeiramente a válvula do bico de Bunsen e a seguir. 3. Distribuir 1 mL de solução de corante.

imediatamente após abri-lo.Manobras assépticas. ou antes de fechá-lo. Repetir quantas vezes forem necessárias até se obter domínio da técnica. Cite três procedimentos adotados em laboratório de microbiologia que minimizam o risco de contaminação ambiental.4. Fonte: VERMELHO (2006) Figura 5 . do operador e do material em estudo. 3. Quais os principais objetivos das manobras assépticas? 2. Figura 4 .Esterilizador de alças e agulhas V – Questões para fixação de conhecimento 1. Transferir aproximadamente 20 mL de solução de corante contida em Erlenmeyer para cada uma das placas. Qual a diluição final obtida no procedimento de diluição seriada realizado? 8 . (Atenção! flambar rapidamente a boca do Erlenmeyer contendo a solução de corante.

INTRODUÇÃO As células bacterianas são caracterizadas quanto aos seguintes aspectos: Tamanho: as bactérias são microscópicas. que bactérias que eles continham não eram descoradas pelo álcool.Tétrades Divisão em três planos: . uma nova metodologia de coloração diferencial. Dependendo do plano e do número de divisões através das quais as bactérias continuam unidas. Entre as bactérias espiraladas. Surgiram muitas modificações. Bacilos: células cilíndricas. Sendo assim. o mecanismo da coloração de Gram foi intensamente estudado. a partir daí. empiricamente. Arranjo: grupamentos bacterianos. uma fina camada de peptideoglicano sobre a qual encontra-se uma camada constituída de lipoproteínas.Feixes cúbicos: sarcina . que podem ser denominados víbrios. O mecanismo da coloração de Gram refere-se à composição da parede celular.8 m até 10 por 25 m. fosfolipídeos e lipopolissacarídeos. Ao longo desses anos. ao corar cortes histológicos com violeta de genciana. em geral. sendo que as Gram-positivas possuem várias camadas de peptideoglicano e ácidos teicóicos. não é possível visualizá-las a olho nu. o complexo cristal 9 . como células isoladas. daí resultando uma porosidade ou permeabilidade aumentada da parede celular das bactérias Gram-negativas. Forma: as bactérias podem ser classificadas quanto à forma em três grupos básicos:    Cocos: células esféricas. Algumas células comportam-se como bacilos curvos.3 por 0. ocasionalmente.Bacilos e Espirilos: Apresentam-se. Assim. se previamente tratadas com solução de iodo.De forma não organizada: cocos em cachos (estafilococos) . Coloração de Gram Em 1884.Cocos: Divisão em um plano: . Durante o processo de coloração de Gram.Em cadeias: estreptococos Divisão em dois planos: . em forma de bastonetes. medindo desde 0. pode-se observar: bacilos aos pares (diplobacilos) ou em cadeias (estreptobacilos). fucsina básica) e estabeleceu.Aos pares: diplococos . o médico dinamarquês Christian Gram descobriu. existem as espiroquetas. através do método de Ehrlich (1882). podem aparecer os seguintes arranjos: . Ele adicionou a este procedimento um contra-corante (safranina. precisando de um microscópio óptico comum. porém. o tratamento com álcool (ou álcool-acetona) extrai os lipídeos. contudo sem afetar substancialmente a idéia original. Espirilos: células espiraladas.COLORAÇÃO DE GRAM E MORFOLOGIA BACTERIANA I . as quais são células flexíveis que se movimentam por rotação e flexão. e as Gram-negativas.

A célula adquire o corante. Outra explicação baseia-se também em diferenças de permeabilidade entre os dois grupos de bactérias.Formação do complexo CVI no interior da célula. sair da o complexo 3 – Álcool-acetona Desidratação celular. relacionar a composição da parede celular das bactérias com os corantes de Gram. o que causa. podem causar danos à parede celular. classificar as bactérias de acordo com a coloração de Gram. As culturas velhas de Gram-positivas podem se apresentar com Gram variável. permanecendo violeta tornando-se vermelha. a porosidade diminui. II . que permanece violeta permanece violeta parede Extração dos lipídeos da da parede celular. Os poros da parede das bactérias Gram-negativas permanecem suficientemente grandes. uma diminuição do diâmetro dos poros da camada de peptideoglicano da parede celular. Etapas da coloração de Gram e aspectos das células gram-positivas e gram-negativas Soluções e ordem de aplicação 1 – Cristal violeta 2 – Solução de lugol Reação e aspecto das bactérias Gram-positivas Coradas em violeta Gram-negativas Coradas em violeta Formação do complexo CV. Conseqüentemente. pela perda da capacidade de retenção do corante. têm o complexo corado extraído pelo álcool. o complexo CV-I é retido na parede após tratamento pelo álcool-acetona. A reação de Gram é extremamente dependente do estado fisiológico da célula. torna-se desidratada durante o tratamento com álcool. Nas bactérias Gram-positivas. As culturas jovens respondem melhor à diferenciação tintorial.OBJETIVOS Executar a técnica de coloração de Gram. provavelmente. como por exemplo. Enzimas líticas. a permeabilidade é reduzida e o complexo CV-I não pode ser extraído. aumento da da porosidade. possibilitando a extração do complexo CV-I. que deixa as células descoradas. na etapa diferencial com álcool-acetona. em pontos de aderência entre a membrana externa e a membrana celular. mesmo após tratamento com álcool-acetona. que I no interior da célula. excretadas normalmente por culturas envelhecidas. devido à pequena espessura da camada basal e às descontinuidades existentes nesta camada. violeta não da e diminuição permeabilidade. em virtude de sua composição diferente. o complexo iodo-cristal violeta poderá ser retirado da célula.violeta-iodo (CV-I) pode ser retirado e as bactérias Gram-negativas são descoradas. citar as formas das bactérias e descrever seus arranjos. De acordo com Trabulsi (2008).o complexo CV-I é removido da célula pode que permanece 4 – Fucsina ou safranina A célula não é afetada. porosidade CV-I célula. alterando a permeabilidade aos solventes (álcool-acetona). A parede celular das bactérias Gram-positivas. verificar a importância de realizar a coloração de Gram a partir de um material clínico. as bactérias Gramnegativas. 10 .

Em seguida. Flambar novamente a alça. 3. Flambar a alça e deixar o esfregaço secar à temperatura ambiente. 2. fazendo movimentos circulares de dentro para fora. 5. 2. 6. com auxílio de uma alça de platina. Colocar uma pequena gota de solução salina fisiológica na superfície de uma lâmina.             Cristal violeta para Gram Solução de Lugol Solução de fucsina ou de safranina para Gram Solução de álcool-acetona Solução salina fisiológica Microscópio óptico Bico de Bunsen Alça e agulha de inoculação Pinça Lâminas para microscopia Lenços de papel absorvente Óleo de imersão IV – MÉTODO As etapas da preparação do esfregaço a partir de meios líquido e sólido encontram-se na figura 6. realizar a fixação. 11 .III – MATERIAL . Deixar o esfregaço secar à temperatura ambiente. Flambar a alça. realizar a fixação. Com auxílio de uma alça de platina (ou de níquel-cromo) estéril. Staphylococcus aureus. passando duas ou três vezes a lâmina na chama do bico de Bunsen. 4. colocar duas alíquotas de cultura bacteriana preparada no meio líquido sobre a superfície de uma lâmina de microscopia.Culturas de microrganismos (Escherichia coli. 5. 3. etc) mantidas em meio de cultura líquido ou em meio sólido. fazendo uma suspensão homogênea. a) Preparação de esfregaço de microrganismos A partir de meio líquido: 1. Esperar a lâmina esfriar e realizar a coloração. Cobrir todo o esfregaço com solução de cristal violeta. Proteus mirabilis. b) Técnica de coloração de Gram 1. passando duas ou três vezes a lâmina na chama do bico de Bunsen. Espalhar sobre a lâmina. A partir de meio sólido: 1. esfriá-la e coletar o inóculo bacteriano. 4. Em seguida. Esperar a lâmina esfriar e realizar a coloração. aguardar um minuto e desprezar o corante na pia.

6.Seqüência de preparação de esfregaço. Inclinar a lâmina e gotejar solução álcool-acetona até que não haja desprendimento de corante (cerca de 30 segundos). 4. Desenhar as estruturas e arranjos observados. com objetiva de imersão. 3. Observar ao microscópio. 5. Fonte: VERMELHO (2006) V – Questões para fixação de conhecimento 1. Cobrir o esfregaço com fucsina (ou safranina) e aguardar 30 segundos. Lavar a lâmina e secá-la ao ar (sem esfregá-la). aguardar um minuto e 30 segundos e desprezar o corante na pia. Lavar a lâmina rapidamente em água corrente. Figura 6 . Cobrir todo o esfregaço com solução de lugol.2. Explique como pode ser realizada a fixação do esfregaço. 12 .

As células bacterianas gram-negativas submetidas à coloração de Gram. 4. Descreva a função de cada substância empregada na coloração de Gram. Qual a importância de se realizar a fixação? 3. na qual o operador deixou de realizar a etapa de lavagem com álcool-acetona terão que aspecto ao microscópio? Explique.2. 13 .

e com dimensões variadas. subterminal ou terminal. Tais propriedades estão associadas em parte à desidratação progressiva por que passa o citoplasma celular. tais como cristal violeta. dependendo das condições de cultivo. Algumas células desenvolvem um mecanismo de ordem genética. Mas esta não é a única propriedade associada ao fenômeno. azul de metileno. O material genético. é reflexo da característica particular de seu envoltório. Neste método. localização intracelular) os esporos desempenham importante papel na sistemática bacteriana. tanto morfológica quanto fisiológica de um grande número de bactérias Gram positivas pertencentes aos gêneros Bacillus e Clostridium é a esporulação. o ácido dipicolínico encontra-se na forma de sal – dipicolinato de cálcio. cromossomo. pode até ser ativado e dar origem a uma célula vegetativa capaz de se multiplicar. o esporo pode permanecer estável por muitos anos. o calor é usado para facilitar a penetração do corante verde-malaquita através da parede do esporo. localizados no corpo da célula vegetativa em posição central. sem uma fonte externa de nutrientes. 14 . pois estes detalhes não são muito repetidos nas várias espécies. devido à grande quantidade de cátions Ca 2+ na célula. respectivamente. Um dos métodos mais empregados para a coloração de esporos é o de WIRTZ (1908).COLORAÇÃO DE ESPOROS BACTERIANOS – MÉTODOD DE WIRTZ I – INTRODUÇÃO Uma característica importante. Normalmente. o qual pode levar horas para se completar. no interior de uma célula bacteriana. Elas manifestam grande resistência ao calor. dificultando (e até mesmo impedindo) a ação de desinfetantes comuns sobre a estrutura queratinóide destas capas. O esporo também é chamado de endósporo e difere química e fisiologicamente da célula que o originou. Este fenômeno biológico é entendido como a formação de uma nova célula – o esporo. É indiscutível que a esporulação é um dos mais importantes eventos da fisiologia celular bacteriana. que lhes permite sobreviver em circunstâncias precárias. desidratada é aquecida em um meio aquoso. alterações químicas e radiações. está protegido por uma dupla camada oriunda da invaginação da própria membrana interna da forma vegetativa. uma preparação a fresco de bactérias esporuladas pode ser rápida e satisfatoriamente observada através de um microscópio ótico de contraste de fase. As técnicas de coloração usuais são ineficientes e o esporo se mostra impenetrável a corantes comuns. congelamento. mostrando um aumento de resistência ao calor. Tal fenômeno também se verifica quando uma célula vegetativa. como corante e contra-corante. dessecação. Por esta razão. Quando colocado em um meio de cultivo adequado. Isto. O contra-corante safranina é aplicado com a finalidade de diferenciar as células vegetativas dos esporos. causando deformações nas células. A desidratação gera uma estrutura muito densa e altamente refrátil (refringente). A esporulação é um processo demorado. A membrana do esporo apresenta em sua composição o ácido dipicolínico. Existem esporos ovais e esféricos. indubitavelmente. Do ponto de vista morfológico (forma. tamanho. o qual emprega o verde malaquita e safranina. substância ausente na estrutura de células vegetativas. Uma vez formado. que vão de valores que permitem a inclusão do esporo no corpo celular até dimensões maiores.

Não deixar a preparação secar. com uma solução aquosa de safranina a 1%. preparar um esfregaço fino a partir de cultura de Bacillus subtilis mantida há vários dias em meio sólido (por exemplo: ágar triptona-soja). dimensão. Em uma lâmina limpa. acrescentando mais corante. Quais gêneros bacterianos são capazes de formar esporos? 3. Deixar esfriar. Deixar esfriar. Explique o que ocorre com as células de Bacillus subtilis quando estas são deixadas por vários dias em meio de cultura. 3. Deixar secar ao ar naturalmente. Lavar em água corrente. subterminal ou terminal V – Questões para fixação de conhecimento 1.INTERPRETAÇÃO  Células vegetativas: cor vermelha  Endosporo: cor verde  Bactérias não esporuladas: cor vermelha  Esporos bacterianos livres: cor verde Anotar os resultados. Deixar secar. Se a coloração de Wirtz tivesse sido aplicada a um esfregaço proveniente de células de Bacillus subtilis reativadas há 24 horas sob condições ideais de cultivo. Corar rapidamente. dimensão e localização intracelular do esporo. 10. 8. 4. 2. 11. 7. Por que o esfregaço e a solução de corante verde-malaquita devem ser aquecidos? 4. em relação à forma. por 30 segundos. Observar ao microscópio ótico com a objetiva de 100 X (imersão). 5.PROCEDIMENTO 1. a presença. 9. 2. Lavar em água corrente. Fixar sobre a chama do bico de Bunsen (3 a 4 vezes).  Aspecto do bacilo: normal ou dilatado  Forma do endósporo: oval ou esférico  Localização do endósporo: central. III .II – OJBJETIVOS Executar uma técnica de coloração específica para a visualização de esporos bacterianos. forma e localização celular de esporos em bactérias. Identificar através da coloração. Cobrir o esfregaço com uma solução aquosa de verde malaquita a 5% e aquecer até desprendimento de vapores durante 5 minutos sobre a chama do bico de Bunsen (ou em banho-maria a 100o C por 5 a 10 minutos). que estruturas seriam observadas na lâmina após a coloração? 15 . 6. IV .

Tendo em vista a ampla diversidade metabólica dos microrganismos. dando uma consistência intermediária. os quais permitiram o estudo de espécies isoladas (culturas puras). de ágar. os meios especiais podem ser classificados em: Meios de pré-enriquecimento são aqueles que permitem a recuperção/multiplicação de microrganismos injuriados.para anaeróbios). Os meios de cultura são classificados quanto ao estado físico em sólidos. apresentando-se como um caldo. dentre outros. nitrogênio. ou seja. nenhuma exigência em especial (Ex. peptona de soja. Os meios de cultura podem ainda ser classificados quanto à procedência dos constituintes em naturais ou complexos. Além dos nutrientes é preciso fornecer condições ambientais favoráveis ao desenvolvimento dos microrganismos. Geralmente. tais como extratos de vegetais (malte. atmosfera (aeróbia. Ex. cuja função é solidificar os meios de cultura. adicionado de sangue e aquecido a 80°C). Especiais quando cumprem com as exigências vitais de determinados microrganismos. contudo. etc. não contêm agentes solidificantes. dentre outras. provas bioquímicas. tais como pH. principalmente do gênero Gellidum. caldo e ágar simples). cérebro.INTRODUÇÃO Até cerca de 1880 os microrganismos eram cultivados em meios líquidos. quando Robert Koch e sua equipe introduziram os meios de cultura sólidos. meio de carne cozida (com fragmentos de fígado . sintéticos ou ainda quimicamente definidos quando a composição química é conhecida (usados para trabalhos de pesquisa) e seus componentes servem para suprir as exigências nutritivas dos microrganismos. etc. pressão osmótica. utilizados para ativação das culturas. ágar sangue. tomate. Triptose Sulfito Ciclosserina (TSC) . energia. água peptonada tamponada. sais minerais. amido de tubérculos. dentre outros. etc. meios Shahidi Ferguson Perfringens (SFP).075 a 0. caseína. de modo a permitir o crescimento de microrganismos em tensões variadas de oxigênio ou a verificação da motilidade e também para conservação de culturas. Básicos são aqueles que permitem o crescimento bacteriano sem satisfazer. De acordo com a finalidade bacteriológica ou micológica. separando-as de espécies contaminantes. fígado. ágar chocolate (ágar simples fundido. vitaminas. Quanto à composição química podem ser simples (meios básicos) ou complexos. a maioria das bactérias não metaboliza o ágar. como meio de infusão de cérebro e coração.sulfato de ácido poligalacturônico. 16 .5 %. umidade. microaeróbia ou anaeróbia). temperatura. O ágar é um polímero .) e de microrganismos (levedura) e artificiais. Baird-Parker (com gema de ovo) (meios ricos ou meios enriquecidos com as substâncias citadas). em fontes de carbono. quando emprega ingredientes com composição química não definida.) de animais (carne. Os meios de cultura consistem da associação qualitativa e quantitativa de substâncias que fornecem os nutrientes necessários ao desenvolvimento (cultivo) de microrganismos fora do seu meio natural.PREPARAÇÃO DE MEIOS DE CULTURA I . existem vários tipos de meios de cultura para satisfazerem as variadas exigências nutricionais. quando então são conhecidas as necessidades nutricionais específicas. repiques de microrganismos. Os meios semi-sólidos contêm de 0. para amostras que sofreram algum tipo de tratamento (térmico ou químico). caldo lactosado (isolamento de Salmonella sp em alimentos). principalmente ágar entre 1 e 2%. quando contêm agentes solidificantes. extraído de várias espécies de algas. os meios líquidos.

ou seja.quando contêm substâncias que permitem estabelecer diferenças entre microrganismos muito parecidos. além do preparo de pipetas e placas de Petri para posterior utilização. permitindo o crescimento de outros.Meios de Enriquecimento .empregados para a determinação quantitativa da população microbiana (ágar de Contagem padrão em placas – PCA. Caldo Tetrationato e Selenito-Cistina para cultivo de Salmonella sp (líquidos).) Estocagem ou manutenção . Caldo Tioglicolato para Clostridium perfringens. meio semi-sólido.utilizados para conservação de microrganismos no laboratório. caldo ou ágar uréia. meios com antibióticos para isolamento de diversos microrganismos (TSC. meio com leite. Dosagem . II – OBJETIVOS Familiarizar-se com técnicas de preparação e esterilização de meios de cultura sólidos e líquidos. ágar triptona de soja – TSA. etc. antibióticos e aminoácidos. Contagem . Exemplo: meios com telurito de potássio (para isolamento de Corynebacterium diphtheriae). caldo triptofano. ágar citrato.os que contêm substâncias que inibem o desenvolvimento de determinados grupos de microrganismos. ágar sangue. meio motilidade. ágar Salmonella-Shigella (SS) e ágar MacConkey. etc. Seletivos . Ágar sangue.5% de cloreto de sódio.PDA. 17 . para fungos. Esses meios têm a propriedade de estimular o crescimento de determinados microrganismos. ágar simples. meio de sulfito indol motilidade. meios com 7.empregados nas determinações de vitaminas. etc).) Identificação – utilizados na realização de provas bioquímicas e verificação de funções fisiológicas de organismos submetidos à identificação (meios Oxidação/Fermentação. meio semi-sólido. meios com sais biliares e verde brilhante para isolamento seletivo de Salmonella. Meios de triagem . ágar batata dextrose . permitindo diferenciar as colônias (sólidos) dos microrganismos. meio Escola Paulista de Medicina – EPM. garantem a viabilidade de microrganismos (ágar Sabouraud.meios que avaliam determinadas atividades metabólicas permitindo caracterização e identificação perfunctória ou presuntiva de muitos microrganismos (ágar tríplice açúcar e ferro. caldo nitrato. tais como meio de Eosina Azul de Metileno – EMB (diferencial para coliformes).). etc. agar Baird-Parker para isolamento e diferenciação de cocos Gram positivos (sólidos). de diluentes. para isolamento de Staphylococcus aureus. meio Baird-Parker. Diferenciais .quando proporcionam nutrientes adequados ao crescimento de microrganismos presentes usualmente em baixos números ou de crescimento lento. Ex. mas existem alguns que também podem inibir o crescimento de outros. indol. ágar triptona de soja. Ágar MacConkey para a diferenciação de Enterobactérias. bem como microrganismos exigentes e fastidiosos. SFP. etc. A maioria deles é também diferencial. lisina – MILi. ágar Baird-Parker.

protegendo-os com papel manilha ou kraft. armazená-la em geladeira ou em lugar fresco. proteger o tampão com papel manilha ou Kraft (ou similar). Transferir. Com auxílio de um bastão de vidro. ao meio previamente esterilizado. Preparação de meio de cultura líquido – caldo triptona e soja 1. 5. pesar 0. Esterilizar o meio de cultura em autoclave à temperatura de 121o C por 15 minutos. Em um béquer de 150 mL. 3. pesar quantidade necessária para o preparo 50 mL de caldo triptona e soja – TSB e adicionar 100 mL de água destilada. Observação: Alguns meios de cultura são preparados da mesma forma. Em um béquer de 250 mL. Adicionar tampão de algodão e gaze. 2. um béquer de vidro ou lata de alumínio). com auxílio de proveta. Em um Erlenmeyer ou outro recipiente apropriado de 250mL. agitar até completa dissolução. 2. Com auxílio de um bastão de vidro. armazenar o meio de cultura em geladeira (ou em lugar fresco e ao abrigo da luz). Aquecer em banho-maria (ou em chama de bico de Bunsen). 3. Após a esterilização. Acondicionar os tubos em um suporte adequado (por exemplo. Transferir. Esterilizar o meio de cultura em autoclave a 121o C por 15 minutos. Após esterilização.22 m de diâmetro (Millipore. agitando freqüentemente com auxílio de bastão de vidro. assepticamente.TSA) e adicionar 100 mL de água destilada. 5. um béquer de vidro ou lata de alumínio). 3. e depois incorporadas. 5. Esterilizar o meio de cultura em autoclave a 121o C por 15 minutos. C. Acondicionar os tubos em um suporte adequado (por exemplo.85% de NaCl) estéril 1. 2. 4. 5 mL de solução para tubos de ensaio com tampa rosqueável (Atenção! Não fechar completamente as tampas dos tubos). através de membranas (de nitrocelulose ou acetato de celulose) com poros de 0. Sartorius). açúcares). armazená-la em geladeira ou em lugar fresco.III . 18 . até completa dissolução do meio de cultura (o meio torna-se translúcido). Preparação de solução fisiológica (0.85 g de cloreto de sódio (NaCl) e adicionar 100 mL de água destilada. Preparação de meio de cultura sólido de uso geral 1. com auxílio de pipeta graduada. as mesmas são esterilizadas à parte por filtração. agitar até completa dissolução do meio e cultura. B. pesar quantidade necessária para o preparo de 100 mL de meio de cultura não seletivo (por exemplo: Ágar Padrão para Contagem – PCA ou Ágar Triptona de Soja . Após esterilização. porém se for necessário utilizar algumas substâncias termolábeis (por exemplo: uréia) ou que reajam com as substâncias dos meios (aminoácidos. com auxílio de pipeta graduada.PROCEDIMENTOS A. 4. 4. protegendo-os com papel manilha ou kraft. 5 mL de caldo para tubos de ensaio com tampa rosqueável (Atenção! Não fechar completamente as tampas dos tubos).

De acordo com orientação de seu professor. como os meios de cultura são classificados? 2. De acordo com o estado físico. embrulhar 4 placas de Petri e 5 pipetas graduadas de 2 mL em papel manilha (ou similar). Preparação de pipetas e placas de Petri para esterilização 1. armazená-lo em lugar seco. 3. Cite o nome de um meio de cultura utilizado na manutenção de culturas bacterianas. Esterilizar este material em estufa a 180o C por 1 hora ou em autoclave a 121o C por 15 minutos (neste caso. 3. Após esterilização. Cite dois exemplos de meios de cultura que sejam simultaneamente seletivos e diferenciais.D. IV – Questões para fixação de conhecimento 1. Por que o tempo de esterilização é maior em estufa a 180ºC do que em autoclave a 121ºC? 19 . 4. 2. o material deverá ser seco em estufa antes de ser utilizado).

a.Autoclave vertical. cesto. b. Com auxílio de luvas de cano longo retirar da câmara o material esterilizado. 15 minutos). 8. Funciona sob altas pressões e temperaturas. reduzir a velocidade de aquecimento e marcar o tempo de esterilização (geralmente.ESTERILIZAÇÃO DE MATERIAIS EM AUTOCLAVE I – INTRODUÇÃO A autoclave é um equipamento bastante empregado na esterilização de materiais. de acordo com as normas de segurança. Abrir cuidadosamente a tampa da autoclave. Após o tempo de esterilização. 12. deixando o botão de controle de velocidade de aquecimento no máximo. desligar o equipamento. 9. Figura 8 . resistência para aquecimento da água e geração de vapor 20 . 10. através de calor úmido (vapor d’ água). 5. Adicionar água limpa e em quantidade suficiente à autoclave. como meios de cultura e instrumentação cirúrgica. A figura II – OBJETIVOS Demonstrar o funcionamento de uma autoclave vertical elétrica e manual. levantar a tampa. Fechar a autoclave através de suas presilhas de segurança. respectivamente). fechar a válvula. 7. 11. Colocar o cesto contendo o material a ser autoclavado (distribuir adequadamente os recipientes de maneira a permitir que o vapor permeie todos eles). 13.PROCEDIMENTO 1. Ligar a autoclave. a. indicando que o ar quente foi expulso e a câmara está saturada de vapor. Assim que se atingirem pressão e temperatura desejadas. 14. 2. Observar o manômetro/termômetro e aguardar até atingir a pressão e a temperatura desejadas (geralmente: 1 atm e 121ºC. 4. exigindo muito cuidado e atenção durante sua operação. 6. Atenção!!! Não deixar que haja oscilação da pressão e temperatura! Posicionar o contra-peso (situado na tampa da autoclave) para frente para diminuir a pressão ou para trás para aumentar a pressão. Aguardar que a temperatura decaia para 100º C (ou menor). Assim que o vapor começar a sair pela mangueira. abrir a válvula (situada na tampa) para que haja saída total do vapor. b. Deixar a válvula (situada na tampa da autoclave) aberta até perceber a saída de vapor condensado. III . 3. Abrir todas as presilhas de segurança e finalmente. Com auxílio de luvas de cano longo.

Verter o meio de cultura “ágar de contagem padrão” ou ágar triptona de soja previamente fundido em banho-maria em placas de Petri estéreis. espalhá-lo na superfície dos meios de cultura. 2. Aguardar a solidificação dos meios de cultura nas placas. região inferior da unha. superfícies e ar. saguão. Expor uma placa com o meio de cultura solidificado em um local de sua preferência (laboratório. Com as placas restantes. elevador. 3. Verificar a presença de microrganismos em partes do corpo humano. Observar a presença de diferentes colônias na superfície dos meios de cultura. Depositar alguns fios de cabelo.OBJETIVOS 1. arranjo. em seguida. rampa. IV – Questões para fixação de conhecimento 1. Incubar as placas a 35º C por 48 horas. superfície das mãos. com diferentes tamanhos. nariz e. em seguida.PROCEDIMENTOS 1. etc) durante 15 minutos. Quais os cuidados que devem ser observados durante a distribuição de meio de cultura estéril nas placas de Petri? 2. Observar os diferentes tipos de bactérias e fungos. Soprar. 5. cor. Qual técnica pode ser empregada para se estimar o grau de contaminação microbiana presente em um ambiente? Como esta técnica é denominada? Quais suas vantagens e limitações? 21 . unhas sobre os meios de cultura. realizar algumas das seguintes opções: Friccionar um swab previamente umedecido em solução salina estéril na bancada e. 2 . língua. aspectos. gram) das colônias submetidas à coloração. Aplicar as técnicas de manobras assépticas. 2. 4. Tocar suavemente a extremidade dos dedos na superfície dos meios de cultura. 4. Fazer o mesmo em outro tipo de superfície. 2. ouvido. (Atenção! Realizar esta etapa de distribuição dos meios de cultura na “zona de segurança” da chama do bico de Bunsen para evitar contaminação). tossir ou espirrar sobre a superfície dos meios. Selecionar algumas colônias para serem submetidas à coloração de Gram.ESTUDO DA CONTAMINAÇÃO AMBIENTAL E DA MICROBIOTA HUMANA 1 . 3. III – INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS 1. Expor as placas abertas ao fluxo de saída de ar de um aparelho de ar-condicionado por alguns segundos. Com auxílio de um swab. retirar material de partes do corpo humano: saliva. Descrever as características (morfologia. espalhá-lo na superfície do ágar (cuidado para não romper o ágar!).

de 25 de março de 2004. químicos e radioativos atendam ao padrão de potabilidade e que não ofereça riscos à saúde (BRASIL. autoclaváveis ou pré-esterilizados.PROCEDIMENTOS a) Seleção e preparação dos frascos para coleta das amostras de água Utilizar frascos com tampas à prova de vazamentos. comercialmente disponíveis. II – OBJETIVOS Avaliar a qualidade microbiológica de amostras de água de abastecimento e de água mineral. Sistemas que analisam menos de 40 amostras por mês: Apenas uma amostra poderá apresentar mensalmente resultado positivo em 100mL. (2) água para consumo humano em toda e qualquer situação. Podem-se também empregar recipientes descartáveis (sacos plásticos) previamente esterilizados. físicos. (3) a detecção de Escherichia coli deve ser preferencialmente adotada. nascentes. minas. III . incluindo fontes individuais como poços.ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DE ÁGUA ONT I – INTRODUÇÃO Entende-se por água potável a água para consumo humano cujos parâmetros microbiológicos. apresentado na Tabela abaixo: Padrão microbiológico de potabilidade da água para consumo humano PARÂMETRO Água para consumo humano (2) (3) VMP (1) Escherichia coli ou coliformes termotolerantes Água na saída do tratamento Coliformes totais Ausência em 100mL Ausência em 100mL Água tratada no sistema de distribuição (reservatórios e rede) Escherichia coli ou coliformes termotolerantes Coliformes totais (3) Ausência em 100mL Sistemas que analisam 40 ou mais amostras por mês: Ausência em 100mL em 95% das amostras examinadas no mês. dentre outras. 2004). 22 . 2004). NOTAS: (1) Valor Máximo Permitido. de preferência. do Ministério da Saúde (BRASIL. de material aprovado para contato com água destinada ao consumo humano e. A água potável deve estar em conformidade com o padrão microbiológico estabelecido pela Portaria nº518.

etc) devem ser previamente esterilizados em autoclave ou estufa de esterilização ou mergulhados em etanol 70% e flambados no momento do uso. no interior de câmaras de fluxo laminar. numa superfície plana. com as portas e janelas do laboratório fechadas. Para tal. 0. preferencialmente. Havendo necessidade de coletar volumes menores. para remoção dos contaminantes presentes. espátulas. particularmente como uma ferramenta para acompanhar variações nas condições de processo. adicionar ao frasco de coleta.plaqueamento em profundidade (“pour plate”) Também conhecida como contagem padrão em placas. Todos os instrumentos e utensílios empregados na abertura das embalagens e retirada das unidades analíticas (tesouras. no caso das águas minerais. Se não houver fluxo laminar. invertendo a embalagem várias vezes. Se a quantidade de amostra encaminhada para análise for menor do que a unidade analítica requerida. deve-se submeter metade à análise. b) Abertura das embalagens e tomada da unidade analítica: antes de abrir as embalagens deve-se desinfetar a área externa com etanol 70%. pinças. flambar. Amostras de água clorada devem ter o cloro totalmente neutralizado imediatamente após a coleta. 8 a 10 vezes no sentido horário e 8 a 10 vezes no sentido anti-horário. se o material for resistente ao calor. 3. c) Métodos de análise de água I. reservando a outra metade como contra-amostra.1 mL da amostra de água em placas de Petri vazias estéreis. abrir o lacre com uma faca ou tesoura estéril ou flambada. a partir de embalagens de maior capacidade. A abertura e a retirada da unidade analítica devem ser feitas.Água de torneira ou tubulações: limpar a área externa da saída com etanol 70%. adicionar 1 mL e 0. deixar a água fluir por 2 a 3 minutos. 23 . deve-se trabalhar na região próxima à chama do bico de Bunsen de tamanho médio. é um procedimento que objetiva estimar o número de bactérias heterotróficas na água. Misturar o inóculo com o meio de cultura movimentando suavemente as placas. facas. previamente fundido e resfriado a 45o C. Inoculação: através de pipeta estéril. Incubação: aguardar a completa solidificação do meio de cultura. Contagem de heterotróficos. inverter as placas e incubar a 35o C por 48 horas.1 mL de solução de tiossulfato de sódio a 1. em movimentos na forma de oito ou em movimentos circulares. para prevenir qualquer contaminação da amostra.Procedimento para coleta: . deve-se homogeneizar todo o conteúdo. para evitar correntes de ar. Após a solidificação. ou a eficiência das diversas etapas de tratamento. 2. desinfetar o bocal com etanol 70% e. 1. antes da esterilização. permitindo ainda verificar as condições higiênicas em diferentes pontos da rede de distribuição. lacrada. distribuindo as placas numa superfície plana. chama azulada. no caso de águas tratadas. 15 a 20 mL de ágar padrão para contagem (PCA).Água mineral engarrafada: deve ser coletada na embalagem original.assepticamente. Adição do meio de cultura: verter nas placas inoculadas. Desprezar o volume inicial e coletar a amostra em um frasco estéril.8% para cada 100 mL de água que se pretende coletar. .

II. Usar notação exponencial e apenas uma casa decimal depois da vírgula. Com uma pipeta de 10 mL estéril. como Serratia e Aeromonas. entretanto que o grupo dos coliformes fecais inclui pelo menos três gêneros. como indicação de contaminação fecal. transferir uma alçada bem carregada de cultura para tubos de caldo Verde brilhante (VB). selecionar apenas os coliformes originários do trato intestinal. passando para os itens subseqüentes. UFC/mL = No de colônias/diluição II. O grupo inclui cerca de 20 componentes. Por essa razão. coli. em caso de crescimento com produção de gás. em um contador de colônias. a presença de coliformes fecais em água e alimentos é menos representativa. coli no grupo fecal. Em caso positivo. em 24 horas a 45.1. Anotar o número de tubos de VB com gás e determinar o Número Mais Provável (NMP) de coliformes totais/50mL em tabela de NMP apropriada às diluições inoculadas (Tabela 1). dentre os quais encontram-se tanto bactérias do trato intestinal de humanos e de outros animais de sangue quente. indica ausência de coliformes (totais ou fecais) nos 50 mL de amostra. passar aos itens subseqüentes. como também diversos gêneros e espécies não entéricas.Contagem as colônias e cálculo dos resultados: selecionar as placas com 30 a 300 colônias e contar as colônias com o auxílio de uma lupa. Número Mais Provável de Coliformes Totais e Termotolerantes – Técnica dos Tubos Múltiplos Introdução Grupo dos coliformes totais: este grupo inclui as bactérias na forma de bastonetes Gram negativos. Grupo dos coliformes termotolerantes: a definição é a mesma dos coliformes totais. Teste presuntivo: 1. coli. Enterobacter e Klebsiella. não esporogênicos. II. 2.2. porém. sua quantificação em água e alimentos é menos representativa. confirmativo de coliformes totais. Esta definição objetivou. restringindo-se aos membros capazes de fermentar a lactose com produção de gás. adicionar 5 porções de 10 mL em 5 tubos contendo 10 mL de caldo lauril sulfato triptose (LST) em concentração dupla com tubo de Durhan. Incubar os tubos a 35 oc por 24 a 48 h e observar se há crescimento com produção de gás. Confirmação de coliformes totais: 1. 24 . reincubar até completar 48 horas e repetir a leitura. dos quais dois (Enterobacter e Klebsiella) incluem cepas de origem não fecal. em princípio. do que a quantificação de coliformes fecais ou de E. aeróbias ou anaeróbias facultativas. A partir de cada tubo positivo no item anterior. Incubar os tubos a 35o C/24h e observar se há crescimento (turvação) com produção de gás.5o C. Atualmente. Escherichia. A não ocorrência gás após 48 h. porém muito mais significativa do que a presença de coliformes totais. Por este motivo. sabe-se. Em caso negativo. como indicação de contaminação fecal do que a enumeração direta de E. dada a alta incidência de E. 2. Calcular o UFC por mL da amostra multiplicando o número de colônias pelo inverso da diluição inoculada. na apresentação dos resultados. capazes de fermentar a lactose com produção de gás em 24 a 48 horas a 35o C.

4 7.V NAÇÃO 25 . Número de tubos positivos 1 2 3 4 5 Fonte: SILVA et al. A partir de cada tubo positivo de LST (item II. II. Confirmação de coliformes termotolerantes: 1. IVIIV . Incubar os tubos a 45. Uma alíquota de 0. Expresse os resultados em NMP de coliformes/100mL de amostra.3.2 4. Em uma análise de coliformes em água pela técnica do Número Mais Provável. em duplicata.5o C por 24 h e observar se há crescimento com produção de gás. para diversas combinações de tubos positivos e negativos na inoculação de 5 alíquotas de 10 g ou 10 mL da amostra por tubo. confirmativo de coliformes termotolerantes. seguido de incubação a 35-37ºC por 48 horas. 2. 3.1) transferir uma alçada bem carregada da cultura para tubos de caldo EC. Expresse o resultado em UFC de heteroróficos por mL de água analisada.2 2. As contagens de UFC em cada uma das placas foram: 68 e 77. Os procedimentos para coleta de amostras de água mineral e de água de torneira ou de tubulações são exatamente os mesmos? Por quê? 3. Explique como os microrganismos coliformes são classificados em nível laboratorial. 4. empregando-se 5 tubos. encontraram-se: a) 4 tubos de caldo verde brilhante turvos e com gás b) 3 tubos de tubos de caldo EC turvos e com gás.3.nível de 95% de probabilidade. (2005) NMP/50mL < 2. Número Mais Provável (NMP) . A não ocorrência de gás após 24 h indica ausência de coliformes termotolerantes na amostra. 2.2 10. 5. através da técnica de semeadura em profundidade (pour plate) em ágar padrão para contagem (PCA). A não ocorrência de gás após 48 h de incubação indica ausência de coliformes totais na amostra. Anotar o número de tubos de EC com gás e determinar o NMP de coliformes fecais/50mL em uma tabela de NMP apropriada às diluições inoculadas (Tabela1).2 IV – Questões para fixação de conhecimento 1.1mL de água mineral foi inoculada.

AMBIENTAL 26 . coli utiliza ßglucuronidase para metabolizar MUG e criar fluorescência. eles utilizam ß-galactosidase para metabolizar o indicador de nutriente ONPG e alterá-lo de incolor para amarelo. À medida que os coliformes se reproduzem no Colilert. eles não podem se reproduzir e interferir.DETECÇÃO DE COLIFORMES EM ÁGUA – MÉTODO CROMOGÊNICO ONT ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DE ÁGUA Essa metodologia emprega substratos cromogênicos e fluorogênicos para detecção simultânea de coliformes totais e de Escherichia coli. Juma vez que a maioria dos não coliformes não conta com estas enzimas. Basta adicionar o reagente à amostra de água e incubar a 3537ºC por 18 a 48h (até 24h para COLILERT – da IDEXX e até 48 h para COLITEST – LKP Diagnósticos). E. Interpretação dos resultados . Os poucos não coliformes que têm estas enzimas são seletivamente suprimidos pela matriz especificamente formulada do Colilert. coli. abordagem diminui a incidência de falso-positivos e falso-negativos. Amarelo/Fluorescência azul: teste positivo para presença de E.COLILERT Incolor: frasco com 100 mL de amostra de água. Amarelo: teste positivo para presença de coliformes totais.

Passos para uso do COLITEST: 1) Coletar a amostra de água até a marca de 100mL 2) Adicionar o meio de cultura COLItest. incubando-o a 37ºC por 18-48h 3) Interpretação dos resultados: 27 .

A. A.. e atual São Paulo. M. M. V. 112p. SP: Livraria Varela. SILVEIRA. V. N. SILVEIRA. SP: Atheneu. da. 536 p VERMELHO. SOARES. N. 2000. São Paulo: Varela.. Práticas de microbiologia. C. SILVA. S. Manual de métodos de análise microbiológica de alimentos. C. M. da. CANTÚSIO NETO. 2005.. JUNQUEIRA. São Paulo. Microbiologia pratica: roteiro e manual. F. N. R. A. F. JUNQUEIRA. N. 2007. A. 28 .REFERÊNCIAS RIBEIRO. 3. B. 239 p. rev. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan.. C. ed. Manual de métodos de análise microbiológica da água. 164 p. bacterias e fungos . SILVA. 2006. R. A.

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