Aulas Práticas do Laboratório de Microbiologia

2011

HAMILTON R. F. BAVUTTI MARCOS LUENGO BLANCO MARIA RAQUEL MANHANI

BIOSSEGURANÇA EM LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA
1. O trabalho no laboratório de microbiologia exige, obrigatoriamente, o uso de epi: avental de mangas longas, com elástico nas mangas, fechado; óculos; touca; máscara facial; luvas; sapatos fechados ou pró-pés; 2. Evitar o uso de lentes de contato (preferir óculos) e maquiagem; 3. Não fumar, não comer, não beber; evitar tocar a boca e outras mucosas ou pele; 4. Não deixar cadernos, canetas, livros, bolsas, sacolas, dentre outros na bancada de trabalho – eles devem ser colocados em locais onde não haja risco de contaminação; 5. Cuidado com a chama do bico de Bunsen (figura 1), que deverá estar acesa durante a maior parte do tempo; 6. Desinfetar a bancada no começo e no fim do trabalho com solução de álcool 70% ou outra similar (cuidado! Verifique se o bico de Bunsen não está aceso!!!); 7. Ler atentamente o protocolo da aula prática e não iniciar o trabalho antes de ter certeza sobre o que fazer, a cada passo; 8. Antes de iniciar o trabalho assegure-se de que tem, à mão, todo o material necessário – não pegar mais material que o necessário nem material indevido; 9. Todo o material deve ser devidamente identificado; 10. Utilizar corretamente as técnicas de manuseio de culturas microbianas: 11. Não falar durante o manuseio das culturas, para minimizar o risco de contaminação das mesmas; 12. Relatar imediatamente, ao professor ou técnico, qualquer evento, acidente ou imprevisto; 13. Quando terminar de trabalhar com culturas, retirar as luvas e descartá-las em lixo infectante, lavar as mãos com sabonete antisséptico ou similar; deixar secar ao ar; 14. Guardar todo material usado no local apropriado e deixar as bancadas em ordem ao fim do trabalho; 15. O lixo deverá ser adequadamente acondicionado e todo material contaminado deve ser autoclavado para descontaminação antes de ser descartado ou reutilizado; 16. Retirar todos os EPIs (avental, luvas, óculos de segurança) quando sair do laboratório; 17. Depois de usar o microscópio, desligar a luz e limpar a objetiva com lenço de papel fino embebido em solução apropriada para limpeza das lentes, para retirar o óleo de imersão. Várias precauções devem ser obrigatoriamente tomadas durante os procedimentos no laboratório de Microbiologia para evitar a contaminação das pessoas, do ambiente e das culturas: Qualquer procedimento só deve se iniciar depois que todos os objetos necessários estejam o mais próximo possível do operador e deve ser realizado o mais rapidamente possível; Os frascos que precisam ser abertos devem ser fechados o mais rapidamente possível; o trabalho deve ser feito ao redor do bico de Bunsen e não são admitidas correntes de ar;

Figura 1 – Bico de Bunsen

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que força o ar para fora. 1. num ângulo próximo à posição vertical. Usar imediatamente. alternativamente ela pode ser resfriada nas paredes internas de um tubo ou placa de Petri (regiões estéreis). Posicionar a ponta da alça na região azul claro da chama . Esfriar a alça no ar. Re-esterilizar a alça imediatamente após o uso. pois depois do uso em culturas. como se faz com um lápis (dedo polegar. mantendo-a até que fique completamente vermelha. o determinações quantitativas. superfície da bancada. panos. 5. 4. acima do cone azul claro.   alças calibradas: que carregam um volume conhecido do material. As partes estéreis de alças ou pipetas que entrarão em contato com as culturas ou com frascos estéreis não podem ser tocadas nem entrar em contato com outras superfícies não estéreis como. o calor cria uma corrente de convexão. 3. devem permanecer na mão do operador. as superfícies internas estéreis das placas de Petri devem entrar em contato com o ar o menor tempo possível. Os tampões de algodão ou roscas dos frascos não podem ser largados nem colocados sobre nenhuma superfície. indicador e médio). Flambagem de alças e agulhas de platina ou de níquel-cromo  alça de níquel-cromo: Segura-se a alça perto de sua parte superior. 3 . sem colocá-la em nenhum local (para que ela não se contamine outra vez). entre o dedo mínimo e a palma da mão durante todo o procedimento Durante as manipulações. Deve-se proceder da seguinte maneira: 1. etc. Quando você flamba o tubo. paredes externas de placas ou tubos. 6. Mover lentamente a alça para dentro da região mais quente da chama. impedindo a entrada de contaminantes. Mover a alça para que toda a extensão seja aquecida adequadamente ("ao rubro"). podendo ser usadas em "Flambagem": aquecimento gradual da ponta da alça.essa é a região "fria" da chama. Essa posição deixa o dedo mínimo livre para segurar os tampões dos tubos. aquecimento rápido pode produzir a liberação de pequenas gotículas e formação de aerossóis. eles devem ser mantidos abertos ao redor do bico de Bunsen. mantendo-a na mão. por exemplo.Todos os frascos abertos devem ter suas “bocas” flambadas imediatamente. 2. na posição mais horizontal possível e deve ter sua “boca” novamente flambada antes de ser fechado. Os movimentos que devem ser realizados na flambagem de alças e agulhas encontram-se na figura 2.

Passe a boca do tubo para frente e para trás. antes de fechar. para que ele saia facilmente. o tampão fica preso na mão do operador.o tampão fica fixo). recolocando o tampão. Segure o tubo com a mão esquerda e retire o tampão com dedo mínimo da mão direita. dentro da chama do bico de Bunsen enquanto isso. 4 . Depois de usar. rode o frasco e não o tampão . quase na vertical Posicione a ponta na região fria da chama Esfrie no ar. Feche o tubo. rodando o tubo e não o tampão. Flambagem de tubos e frascos Afrouxe o tampão do frasco ou tubo. mantendo o seguro entre esse dedo e a palma da mão (para retirar o tampão. não se esqueça. repita a operação acima.Segure a alça como se fosse um lápis. A seqüência de flambagem de tubos e frascos encontra-se na figura 3. próximo à chama Aqueça gradualmente toda a extensão "ao rubro" Figura 2 – Seqüência para flambagem de alça e de agulha de inoculação 2.

acondicionadas em recipientes especiais ou individualmente embrulhadas devem ser manuseadas na frente do bico de Bunsen. Segurá-las pela região do bocal. colocando o aspirador e mantendo o dedo mínimo livre para abrir o frasco que contem o líquido a ser transferido. como um lápis. previamente esterilizadas. 5 . para ser transportada.Remova o tampão com o dedo mínimo Segure o tampão entre o dedo e a palma da mão Passe a boca do tubo dentro da chama Recoloque o tampão. Não encostar a ponta da pipeta em regiões não estéreis dos tubos. A pipeta contaminada deve ser colocada em um frasco com desinfetante. imediatamente após o uso. com algodão na ponta. Manuseio de pipetas As pipetas graduadas ou de Pasteur. girando o tubo Figura 3 – Flambagem de tubos e frascos 3.

MATERIAL NECESSÁRIO pipetador pipetas de 1 mL e 10 mL embaladas em papel kraft ou similar estante para tubos tubos de ensaio contendo 10 mL de solução de corante (simulando meio de cultura estéril) tubos de ensaio contendo 9 mL de água (simulando diluente estéril) alça de platina ou de níquel-cromo tubos de ensaio vazios Erlenmeyer contendo 200 mL de solução de corante (simulando meio de cultura estéril). * Operações com microrganismos patogênicos que podem gerar aerossóis. 3. 2. como por exemplo. Trabalhar dentro da “zona de segurança” do bico de Bunsen*. preferencialmente na parte interna do recipiente que contém o meio de cultura. A tampa nunca deve ser colocada sobre a bancada. centrifugação. Os procedimentos 2 a 5 estão ilustrados na Figura 4. para reduzir o número de potenciais microrganismos contaminantes. Flambar rapidamente a boca dos tubos contendo microrganismos ou meio estéril. Trabalhar em áreas submetidas previamente à limpeza e à desinfecção. placas de Petri. II . Desembrulhar a pipeta estéril dentro da zona de segurança. com tampão de algodão - 6 . 5. venham a contaminar materiais estéreis do laboratório como meios de cultura. ou seja. Estas impedirão que microrganismos presentes no ar ou depositados sobre as diversas superfícies com a poeira. agitação intensa. ou seja. sendo retirada e mantida segura pelo dedo mínimo da mão que detém a alça ou agulha durante a inoculação. etc) com meio de cultura devem ser abertos o mais próximo possível da chama do bico. imediatamente após abri-los. 4. os recipientes (tubos de ensaio. Também impedem que os microrganismos com que estamos trabalhando nos contaminem ou ao ambiente. seguidas da abertura do frasco que contém a suspensão microbiana devem ser realizadas em cabine de segurança (capela de fluxo laminar vertical) e alças e agulhas devem ser esterilizadas em forno esterilizador (Figura 5). As técnicas referentes à manipulação de culturas envolvem basicamente: 1. culturas puras de microrganismos.MANOBRAS ASSÉPTICAS I .INTRODUÇÃO As manobras assépticas são técnicas que impedem a entrada de microrganismos onde estes não são desejados. ainda. ou antes de fechá-los. sem que haja perigo de superaquecimento ou queimaduras. 6. soluções e equipamentos ou. dentro da zona de segurança. Flambar ao rubro alça ou agulha antes e após cada inoculação. flambá-la rapidamente e mantê-la nesta região durante todo o trabalho. garantem a boa assepsia. Deixar esfriar o instrumento antes de obter o inóculo.

placas. de maneira asséptica (próximo ao bico do Bunsen). 1 mL para tubo contendo 9 mL de água. a válvula da tubulação de gás). agitando suavemente. Parte B. para outro tubo vazio. 4. 3. c.PROCEDIMENTOS Parte A. (Atenção! flambar rapidamente a boca dos tubos contendo a solução de corante.OBJETIVOS bico de Bunsen placas de Petri embaladas em papel Kraft ou similar 1. etc) e outros objetos de frequente manipulação (alça. transferir 1 mL para outro tubo contendo 9 mL de água. . 2. 2. sendo retirada e mantida segura pelo dedo mínimo da mão que detém a alça ou agulha durante a inoculação. Distribuir 1 mL de solução de corante. bico de Bunsen. este procedimento deve ser realizado na zona de segurança do bico de Bunsen). A tampa nunca deve ser colocada sobre a bancada. A partir do tubo contendo solução de corante. Agitar suavemente até que o corante se distribua de maneira uniforme. realizar diluições seriadas. Retirar as placas vazias da embalagem e mantê-las próximas ao bico de Bunsen. tubos. 3. etc). 3. 2. Acender o bico de Bunsen (abrir primeiramente a válvula do bico de Bunsen e a seguir. com auxílio de pipeta de 1 ou 2 mL. Repetir quantas vezes julgar necessárias até o domínio da técnica. Descrever as principais técnicas de manobras assépticas. . contida em um tubo. Desenvolver habilidade de: a. distribuir meios de cultura estéreis em placas de Petri previamente esterilizadas. Treinamento de manobras assépticas . Mostrar a vidraria principal (pipetas. transferir 1 mL para outro tubo contendo 9 mL de água. 7 . manipular tubos contendo meios estéreis. a válvula da tubulação de gás). Realizar a desinfecção da bancada de trabalho. A partir deste tubo. usando pipeta estéril de 1 mL. imediatamente após abri-los e antes de fechá-los. (Atenção! Este procedimento deve ser realizado na zona de segurança do bico de Bunsen). Realizar a desinfecção da bancada de trabalho.Transferência de meio de cultura contido em Erlenmeyer para placas de Petri 1. Deste último tubo.Transferência de caldo estéril para tubos previamente esterilizados 1.Realização de diluições seriadas 1. IV . b.III . transferir. agulha de inoculação. Identificar e manipular corretamente a vidraria principal e outros objetos de uso mais frequente em Microbiologia. Retirar uma pipeta de 1 mL da embalagem e acoplá-la ao pipetador. Acender o bico de Bunsen (abrir primeiramente a válvula do bico de Bunsen e a seguir.

4. ou antes de fechá-lo.Esterilizador de alças e agulhas V – Questões para fixação de conhecimento 1. 3. Figura 4 . Quais os principais objetivos das manobras assépticas? 2. Repetir quantas vezes forem necessárias até se obter domínio da técnica. Qual a diluição final obtida no procedimento de diluição seriada realizado? 8 . Cite três procedimentos adotados em laboratório de microbiologia que minimizam o risco de contaminação ambiental. Transferir aproximadamente 20 mL de solução de corante contida em Erlenmeyer para cada uma das placas. imediatamente após abri-lo. Fonte: VERMELHO (2006) Figura 5 . do operador e do material em estudo.Manobras assépticas. (Atenção! flambar rapidamente a boca do Erlenmeyer contendo a solução de corante.

Sendo assim. medindo desde 0. o mecanismo da coloração de Gram foi intensamente estudado.Feixes cúbicos: sarcina . em forma de bastonetes. Ao longo desses anos. precisando de um microscópio óptico comum. se previamente tratadas com solução de iodo.COLORAÇÃO DE GRAM E MORFOLOGIA BACTERIANA I .Aos pares: diplococos . podem aparecer os seguintes arranjos: . empiricamente. fucsina básica) e estabeleceu. Dependendo do plano e do número de divisões através das quais as bactérias continuam unidas. a partir daí. existem as espiroquetas. e as Gram-negativas. ocasionalmente. Forma: as bactérias podem ser classificadas quanto à forma em três grupos básicos:    Cocos: células esféricas.Bacilos e Espirilos: Apresentam-se. ao corar cortes histológicos com violeta de genciana. uma fina camada de peptideoglicano sobre a qual encontra-se uma camada constituída de lipoproteínas. através do método de Ehrlich (1882).INTRODUÇÃO As células bacterianas são caracterizadas quanto aos seguintes aspectos: Tamanho: as bactérias são microscópicas. que bactérias que eles continham não eram descoradas pelo álcool. Coloração de Gram Em 1884.De forma não organizada: cocos em cachos (estafilococos) . como células isoladas. o complexo cristal 9 . Arranjo: grupamentos bacterianos. daí resultando uma porosidade ou permeabilidade aumentada da parede celular das bactérias Gram-negativas. Durante o processo de coloração de Gram. Espirilos: células espiraladas. o médico dinamarquês Christian Gram descobriu. Surgiram muitas modificações. Entre as bactérias espiraladas. Assim. pode-se observar: bacilos aos pares (diplobacilos) ou em cadeias (estreptobacilos). Algumas células comportam-se como bacilos curvos. não é possível visualizá-las a olho nu. O mecanismo da coloração de Gram refere-se à composição da parede celular.3 por 0.Cocos: Divisão em um plano: . as quais são células flexíveis que se movimentam por rotação e flexão. Bacilos: células cilíndricas.Tétrades Divisão em três planos: . em geral.8 m até 10 por 25 m. fosfolipídeos e lipopolissacarídeos. sendo que as Gram-positivas possuem várias camadas de peptideoglicano e ácidos teicóicos. que podem ser denominados víbrios. Ele adicionou a este procedimento um contra-corante (safranina. o tratamento com álcool (ou álcool-acetona) extrai os lipídeos.Em cadeias: estreptococos Divisão em dois planos: . uma nova metodologia de coloração diferencial. contudo sem afetar substancialmente a idéia original. porém.

sair da o complexo 3 – Álcool-acetona Desidratação celular. possibilitando a extração do complexo CV-I. De acordo com Trabulsi (2008). II . Os poros da parede das bactérias Gram-negativas permanecem suficientemente grandes. a porosidade diminui. como por exemplo. Outra explicação baseia-se também em diferenças de permeabilidade entre os dois grupos de bactérias. excretadas normalmente por culturas envelhecidas. Enzimas líticas.Formação do complexo CVI no interior da célula. provavelmente. devido à pequena espessura da camada basal e às descontinuidades existentes nesta camada.o complexo CV-I é removido da célula pode que permanece 4 – Fucsina ou safranina A célula não é afetada. alterando a permeabilidade aos solventes (álcool-acetona). o complexo CV-I é retido na parede após tratamento pelo álcool-acetona. uma diminuição do diâmetro dos poros da camada de peptideoglicano da parede celular. Conseqüentemente. o que causa. o complexo iodo-cristal violeta poderá ser retirado da célula. em pontos de aderência entre a membrana externa e a membrana celular. que permanece violeta permanece violeta parede Extração dos lipídeos da da parede celular. na etapa diferencial com álcool-acetona. mesmo após tratamento com álcool-acetona. A parede celular das bactérias Gram-positivas. permanecendo violeta tornando-se vermelha. relacionar a composição da parede celular das bactérias com os corantes de Gram. A célula adquire o corante. que I no interior da célula. A reação de Gram é extremamente dependente do estado fisiológico da célula. em virtude de sua composição diferente. as bactérias Gramnegativas. Etapas da coloração de Gram e aspectos das células gram-positivas e gram-negativas Soluções e ordem de aplicação 1 – Cristal violeta 2 – Solução de lugol Reação e aspecto das bactérias Gram-positivas Coradas em violeta Gram-negativas Coradas em violeta Formação do complexo CV.OBJETIVOS Executar a técnica de coloração de Gram. 10 . verificar a importância de realizar a coloração de Gram a partir de um material clínico. a permeabilidade é reduzida e o complexo CV-I não pode ser extraído. As culturas velhas de Gram-positivas podem se apresentar com Gram variável. violeta não da e diminuição permeabilidade. classificar as bactérias de acordo com a coloração de Gram. torna-se desidratada durante o tratamento com álcool. pela perda da capacidade de retenção do corante. aumento da da porosidade. Nas bactérias Gram-positivas. As culturas jovens respondem melhor à diferenciação tintorial. citar as formas das bactérias e descrever seus arranjos. que deixa as células descoradas. podem causar danos à parede celular.violeta-iodo (CV-I) pode ser retirado e as bactérias Gram-negativas são descoradas. têm o complexo corado extraído pelo álcool. porosidade CV-I célula.

Esperar a lâmina esfriar e realizar a coloração. Esperar a lâmina esfriar e realizar a coloração. Cobrir todo o esfregaço com solução de cristal violeta. 4. Flambar a alça e deixar o esfregaço secar à temperatura ambiente. Staphylococcus aureus. com auxílio de uma alça de platina. Proteus mirabilis. esfriá-la e coletar o inóculo bacteriano. Deixar o esfregaço secar à temperatura ambiente. Em seguida. 6. fazendo uma suspensão homogênea. 11 . 2. 4.Culturas de microrganismos (Escherichia coli. 3. colocar duas alíquotas de cultura bacteriana preparada no meio líquido sobre a superfície de uma lâmina de microscopia. fazendo movimentos circulares de dentro para fora. passando duas ou três vezes a lâmina na chama do bico de Bunsen. etc) mantidas em meio de cultura líquido ou em meio sólido. a) Preparação de esfregaço de microrganismos A partir de meio líquido: 1.             Cristal violeta para Gram Solução de Lugol Solução de fucsina ou de safranina para Gram Solução de álcool-acetona Solução salina fisiológica Microscópio óptico Bico de Bunsen Alça e agulha de inoculação Pinça Lâminas para microscopia Lenços de papel absorvente Óleo de imersão IV – MÉTODO As etapas da preparação do esfregaço a partir de meios líquido e sólido encontram-se na figura 6. 3. passando duas ou três vezes a lâmina na chama do bico de Bunsen. b) Técnica de coloração de Gram 1. Espalhar sobre a lâmina. realizar a fixação. 5. Flambar novamente a alça. realizar a fixação. 2. Com auxílio de uma alça de platina (ou de níquel-cromo) estéril. aguardar um minuto e desprezar o corante na pia. 5. Em seguida. A partir de meio sólido: 1. Flambar a alça.III – MATERIAL . Colocar uma pequena gota de solução salina fisiológica na superfície de uma lâmina.

3. aguardar um minuto e 30 segundos e desprezar o corante na pia. Observar ao microscópio. Fonte: VERMELHO (2006) V – Questões para fixação de conhecimento 1. Lavar a lâmina e secá-la ao ar (sem esfregá-la). Cobrir o esfregaço com fucsina (ou safranina) e aguardar 30 segundos. 4. Inclinar a lâmina e gotejar solução álcool-acetona até que não haja desprendimento de corante (cerca de 30 segundos). com objetiva de imersão.Seqüência de preparação de esfregaço. Lavar a lâmina rapidamente em água corrente.2. Cobrir todo o esfregaço com solução de lugol. Explique como pode ser realizada a fixação do esfregaço. 5. Figura 6 . Desenhar as estruturas e arranjos observados. 12 . 6.

na qual o operador deixou de realizar a etapa de lavagem com álcool-acetona terão que aspecto ao microscópio? Explique. 13 .2. As células bacterianas gram-negativas submetidas à coloração de Gram. Descreva a função de cada substância empregada na coloração de Gram. 4. Qual a importância de se realizar a fixação? 3.

o qual pode levar horas para se completar. localizados no corpo da célula vegetativa em posição central. O contra-corante safranina é aplicado com a finalidade de diferenciar as células vegetativas dos esporos. que vão de valores que permitem a inclusão do esporo no corpo celular até dimensões maiores. o ácido dipicolínico encontra-se na forma de sal – dipicolinato de cálcio. cromossomo. Elas manifestam grande resistência ao calor. alterações químicas e radiações. congelamento. Normalmente. Algumas células desenvolvem um mecanismo de ordem genética. indubitavelmente. Este fenômeno biológico é entendido como a formação de uma nova célula – o esporo. A esporulação é um processo demorado. O esporo também é chamado de endósporo e difere química e fisiologicamente da célula que o originou. no interior de uma célula bacteriana. e com dimensões variadas. mostrando um aumento de resistência ao calor. Quando colocado em um meio de cultivo adequado. é reflexo da característica particular de seu envoltório. causando deformações nas células. o qual emprega o verde malaquita e safranina.COLORAÇÃO DE ESPOROS BACTERIANOS – MÉTODOD DE WIRTZ I – INTRODUÇÃO Uma característica importante. subterminal ou terminal. Mas esta não é a única propriedade associada ao fenômeno. que lhes permite sobreviver em circunstâncias precárias. substância ausente na estrutura de células vegetativas. pode até ser ativado e dar origem a uma célula vegetativa capaz de se multiplicar. respectivamente. pois estes detalhes não são muito repetidos nas várias espécies. dificultando (e até mesmo impedindo) a ação de desinfetantes comuns sobre a estrutura queratinóide destas capas. A desidratação gera uma estrutura muito densa e altamente refrátil (refringente). dessecação. está protegido por uma dupla camada oriunda da invaginação da própria membrana interna da forma vegetativa. Por esta razão. Uma vez formado. localização intracelular) os esporos desempenham importante papel na sistemática bacteriana. Existem esporos ovais e esféricos. As técnicas de coloração usuais são ineficientes e o esporo se mostra impenetrável a corantes comuns. O material genético. desidratada é aquecida em um meio aquoso. sem uma fonte externa de nutrientes. tais como cristal violeta. Isto. azul de metileno. É indiscutível que a esporulação é um dos mais importantes eventos da fisiologia celular bacteriana. A membrana do esporo apresenta em sua composição o ácido dipicolínico. Do ponto de vista morfológico (forma. 14 . Neste método. dependendo das condições de cultivo. Tal fenômeno também se verifica quando uma célula vegetativa. o calor é usado para facilitar a penetração do corante verde-malaquita através da parede do esporo. Um dos métodos mais empregados para a coloração de esporos é o de WIRTZ (1908). tanto morfológica quanto fisiológica de um grande número de bactérias Gram positivas pertencentes aos gêneros Bacillus e Clostridium é a esporulação. devido à grande quantidade de cátions Ca 2+ na célula. tamanho. como corante e contra-corante. Tais propriedades estão associadas em parte à desidratação progressiva por que passa o citoplasma celular. uma preparação a fresco de bactérias esporuladas pode ser rápida e satisfatoriamente observada através de um microscópio ótico de contraste de fase. o esporo pode permanecer estável por muitos anos.

Quais gêneros bacterianos são capazes de formar esporos? 3. a presença. Por que o esfregaço e a solução de corante verde-malaquita devem ser aquecidos? 4. Lavar em água corrente. Corar rapidamente. 6. Explique o que ocorre com as células de Bacillus subtilis quando estas são deixadas por vários dias em meio de cultura. Deixar secar ao ar naturalmente. Identificar através da coloração. Deixar esfriar. III .PROCEDIMENTO 1. Observar ao microscópio ótico com a objetiva de 100 X (imersão). IV .  Aspecto do bacilo: normal ou dilatado  Forma do endósporo: oval ou esférico  Localização do endósporo: central. 4.II – OJBJETIVOS Executar uma técnica de coloração específica para a visualização de esporos bacterianos. subterminal ou terminal V – Questões para fixação de conhecimento 1. 5. em relação à forma. dimensão e localização intracelular do esporo. acrescentando mais corante. Lavar em água corrente. 10. preparar um esfregaço fino a partir de cultura de Bacillus subtilis mantida há vários dias em meio sólido (por exemplo: ágar triptona-soja). dimensão. 7. 11.INTERPRETAÇÃO  Células vegetativas: cor vermelha  Endosporo: cor verde  Bactérias não esporuladas: cor vermelha  Esporos bacterianos livres: cor verde Anotar os resultados. 2. 3. por 30 segundos. Deixar secar. que estruturas seriam observadas na lâmina após a coloração? 15 . Se a coloração de Wirtz tivesse sido aplicada a um esfregaço proveniente de células de Bacillus subtilis reativadas há 24 horas sob condições ideais de cultivo. 2. Em uma lâmina limpa. Não deixar a preparação secar. forma e localização celular de esporos em bactérias. Deixar esfriar. 9. Fixar sobre a chama do bico de Bunsen (3 a 4 vezes). com uma solução aquosa de safranina a 1%. Cobrir o esfregaço com uma solução aquosa de verde malaquita a 5% e aquecer até desprendimento de vapores durante 5 minutos sobre a chama do bico de Bunsen (ou em banho-maria a 100o C por 5 a 10 minutos). 8.

extraído de várias espécies de algas. atmosfera (aeróbia. a maioria das bactérias não metaboliza o ágar. os meios líquidos. quando Robert Koch e sua equipe introduziram os meios de cultura sólidos.5 %. dando uma consistência intermediária. utilizados para ativação das culturas. Além dos nutrientes é preciso fornecer condições ambientais favoráveis ao desenvolvimento dos microrganismos. para amostras que sofreram algum tipo de tratamento (térmico ou químico). principalmente do gênero Gellidum. tais como extratos de vegetais (malte. Básicos são aqueles que permitem o crescimento bacteriano sem satisfazer. temperatura. amido de tubérculos. meio de carne cozida (com fragmentos de fígado . umidade. principalmente ágar entre 1 e 2%. separando-as de espécies contaminantes. como meio de infusão de cérebro e coração. 16 . contudo. Os meios semi-sólidos contêm de 0.para anaeróbios). quando contêm agentes solidificantes. água peptonada tamponada. peptona de soja. caldo e ágar simples). Os meios de cultura consistem da associação qualitativa e quantitativa de substâncias que fornecem os nutrientes necessários ao desenvolvimento (cultivo) de microrganismos fora do seu meio natural. fígado.) de animais (carne. ágar chocolate (ágar simples fundido. dentre outros.) e de microrganismos (levedura) e artificiais. cuja função é solidificar os meios de cultura. provas bioquímicas. Tendo em vista a ampla diversidade metabólica dos microrganismos. De acordo com a finalidade bacteriológica ou micológica. Os meios de cultura podem ainda ser classificados quanto à procedência dos constituintes em naturais ou complexos. etc. microaeróbia ou anaeróbia). pressão osmótica. Geralmente.075 a 0. Triptose Sulfito Ciclosserina (TSC) . sintéticos ou ainda quimicamente definidos quando a composição química é conhecida (usados para trabalhos de pesquisa) e seus componentes servem para suprir as exigências nutritivas dos microrganismos. dentre outros. de modo a permitir o crescimento de microrganismos em tensões variadas de oxigênio ou a verificação da motilidade e também para conservação de culturas. meios Shahidi Ferguson Perfringens (SFP). etc. ou seja. sais minerais. adicionado de sangue e aquecido a 80°C). tais como pH. os quais permitiram o estudo de espécies isoladas (culturas puras). Os meios de cultura são classificados quanto ao estado físico em sólidos. energia. Quanto à composição química podem ser simples (meios básicos) ou complexos.PREPARAÇÃO DE MEIOS DE CULTURA I . quando emprega ingredientes com composição química não definida. cérebro. dentre outras. caldo lactosado (isolamento de Salmonella sp em alimentos). quando então são conhecidas as necessidades nutricionais específicas. os meios especiais podem ser classificados em: Meios de pré-enriquecimento são aqueles que permitem a recuperção/multiplicação de microrganismos injuriados. existem vários tipos de meios de cultura para satisfazerem as variadas exigências nutricionais. O ágar é um polímero . Baird-Parker (com gema de ovo) (meios ricos ou meios enriquecidos com as substâncias citadas). repiques de microrganismos. de ágar. Ex. caseína. apresentando-se como um caldo. em fontes de carbono.sulfato de ácido poligalacturônico. etc. nitrogênio. nenhuma exigência em especial (Ex. Especiais quando cumprem com as exigências vitais de determinados microrganismos. ágar sangue. vitaminas. tomate. não contêm agentes solidificantes.INTRODUÇÃO Até cerca de 1880 os microrganismos eram cultivados em meios líquidos.

Contagem . antibióticos e aminoácidos. bem como microrganismos exigentes e fastidiosos. Meios de triagem . Caldo Tetrationato e Selenito-Cistina para cultivo de Salmonella sp (líquidos).PDA. ágar Baird-Parker.) Estocagem ou manutenção . ágar citrato. caldo triptofano. meio semi-sólido. etc. tais como meio de Eosina Azul de Metileno – EMB (diferencial para coliformes). ágar simples. agar Baird-Parker para isolamento e diferenciação de cocos Gram positivos (sólidos).utilizados para conservação de microrganismos no laboratório. Ágar sangue. 17 .os que contêm substâncias que inibem o desenvolvimento de determinados grupos de microrganismos.).quando contêm substâncias que permitem estabelecer diferenças entre microrganismos muito parecidos. Exemplo: meios com telurito de potássio (para isolamento de Corynebacterium diphtheriae). meios com 7. Dosagem . de diluentes. SFP. permitindo o crescimento de outros. Esses meios têm a propriedade de estimular o crescimento de determinados microrganismos. meios com antibióticos para isolamento de diversos microrganismos (TSC. meio semi-sólido. etc.empregados para a determinação quantitativa da população microbiana (ágar de Contagem padrão em placas – PCA. caldo ou ágar uréia. mas existem alguns que também podem inibir o crescimento de outros. lisina – MILi. permitindo diferenciar as colônias (sólidos) dos microrganismos. Seletivos . ou seja. Ágar MacConkey para a diferenciação de Enterobactérias.meios que avaliam determinadas atividades metabólicas permitindo caracterização e identificação perfunctória ou presuntiva de muitos microrganismos (ágar tríplice açúcar e ferro. II – OBJETIVOS Familiarizar-se com técnicas de preparação e esterilização de meios de cultura sólidos e líquidos. etc. ágar batata dextrose . meios com sais biliares e verde brilhante para isolamento seletivo de Salmonella. Ex.Meios de Enriquecimento . ágar sangue. para fungos.) Identificação – utilizados na realização de provas bioquímicas e verificação de funções fisiológicas de organismos submetidos à identificação (meios Oxidação/Fermentação.empregados nas determinações de vitaminas. além do preparo de pipetas e placas de Petri para posterior utilização. Caldo Tioglicolato para Clostridium perfringens. meio Baird-Parker.quando proporcionam nutrientes adequados ao crescimento de microrganismos presentes usualmente em baixos números ou de crescimento lento. ágar triptona de soja. etc. caldo nitrato. Diferenciais . etc). garantem a viabilidade de microrganismos (ágar Sabouraud. para isolamento de Staphylococcus aureus. ágar triptona de soja – TSA.5% de cloreto de sódio. meio motilidade. indol. meio de sulfito indol motilidade. meio com leite. A maioria deles é também diferencial. meio Escola Paulista de Medicina – EPM. ágar Salmonella-Shigella (SS) e ágar MacConkey.

agitando freqüentemente com auxílio de bastão de vidro.22 m de diâmetro (Millipore. Preparação de meio de cultura líquido – caldo triptona e soja 1. 18 . Com auxílio de um bastão de vidro. com auxílio de pipeta graduada. Acondicionar os tubos em um suporte adequado (por exemplo. Aquecer em banho-maria (ou em chama de bico de Bunsen). 5 mL de caldo para tubos de ensaio com tampa rosqueável (Atenção! Não fechar completamente as tampas dos tubos). Sartorius).85 g de cloreto de sódio (NaCl) e adicionar 100 mL de água destilada. agitar até completa dissolução. 2. Após esterilização. um béquer de vidro ou lata de alumínio). Em um béquer de 150 mL. Preparação de meio de cultura sólido de uso geral 1. Esterilizar o meio de cultura em autoclave a 121o C por 15 minutos. 5. proteger o tampão com papel manilha ou Kraft (ou similar). pesar quantidade necessária para o preparo 50 mL de caldo triptona e soja – TSB e adicionar 100 mL de água destilada. Transferir. porém se for necessário utilizar algumas substâncias termolábeis (por exemplo: uréia) ou que reajam com as substâncias dos meios (aminoácidos. protegendo-os com papel manilha ou kraft. até completa dissolução do meio de cultura (o meio torna-se translúcido). armazená-la em geladeira ou em lugar fresco. 4.III . 4.85% de NaCl) estéril 1. protegendo-os com papel manilha ou kraft. 4. as mesmas são esterilizadas à parte por filtração. B. com auxílio de pipeta graduada. Esterilizar o meio de cultura em autoclave a 121o C por 15 minutos. Transferir. através de membranas (de nitrocelulose ou acetato de celulose) com poros de 0. 2. assepticamente. armazenar o meio de cultura em geladeira (ou em lugar fresco e ao abrigo da luz). armazená-la em geladeira ou em lugar fresco. 3. Observação: Alguns meios de cultura são preparados da mesma forma. um béquer de vidro ou lata de alumínio). pesar 0. 5 mL de solução para tubos de ensaio com tampa rosqueável (Atenção! Não fechar completamente as tampas dos tubos). e depois incorporadas. Adicionar tampão de algodão e gaze. Após esterilização. 3. 5. Em um Erlenmeyer ou outro recipiente apropriado de 250mL. Em um béquer de 250 mL. Acondicionar os tubos em um suporte adequado (por exemplo. 2.PROCEDIMENTOS A. com auxílio de proveta.TSA) e adicionar 100 mL de água destilada. C. ao meio previamente esterilizado. açúcares). Após a esterilização. 5. Com auxílio de um bastão de vidro. agitar até completa dissolução do meio e cultura. pesar quantidade necessária para o preparo de 100 mL de meio de cultura não seletivo (por exemplo: Ágar Padrão para Contagem – PCA ou Ágar Triptona de Soja . 3. Preparação de solução fisiológica (0. Esterilizar o meio de cultura em autoclave à temperatura de 121o C por 15 minutos.

4. Preparação de pipetas e placas de Petri para esterilização 1. IV – Questões para fixação de conhecimento 1. Cite dois exemplos de meios de cultura que sejam simultaneamente seletivos e diferenciais. Esterilizar este material em estufa a 180o C por 1 hora ou em autoclave a 121o C por 15 minutos (neste caso.D. De acordo com o estado físico. Cite o nome de um meio de cultura utilizado na manutenção de culturas bacterianas. Após esterilização. 3. como os meios de cultura são classificados? 2. embrulhar 4 placas de Petri e 5 pipetas graduadas de 2 mL em papel manilha (ou similar). 3. o material deverá ser seco em estufa antes de ser utilizado). 2. Por que o tempo de esterilização é maior em estufa a 180ºC do que em autoclave a 121ºC? 19 . armazená-lo em lugar seco. De acordo com orientação de seu professor.

Autoclave vertical. exigindo muito cuidado e atenção durante sua operação. b. 11.PROCEDIMENTO 1. 14. respectivamente). Com auxílio de luvas de cano longo retirar da câmara o material esterilizado. Abrir todas as presilhas de segurança e finalmente. Observar o manômetro/termômetro e aguardar até atingir a pressão e a temperatura desejadas (geralmente: 1 atm e 121ºC. 12. 5. Com auxílio de luvas de cano longo. Adicionar água limpa e em quantidade suficiente à autoclave. 9. Após o tempo de esterilização. através de calor úmido (vapor d’ água). Fechar a autoclave através de suas presilhas de segurança. levantar a tampa. 4. desligar o equipamento. resistência para aquecimento da água e geração de vapor 20 . como meios de cultura e instrumentação cirúrgica.ESTERILIZAÇÃO DE MATERIAIS EM AUTOCLAVE I – INTRODUÇÃO A autoclave é um equipamento bastante empregado na esterilização de materiais. cesto. Funciona sob altas pressões e temperaturas. 3. Colocar o cesto contendo o material a ser autoclavado (distribuir adequadamente os recipientes de maneira a permitir que o vapor permeie todos eles). A figura II – OBJETIVOS Demonstrar o funcionamento de uma autoclave vertical elétrica e manual. Assim que se atingirem pressão e temperatura desejadas. Aguardar que a temperatura decaia para 100º C (ou menor). Figura 8 . abrir a válvula (situada na tampa) para que haja saída total do vapor. Assim que o vapor começar a sair pela mangueira. Abrir cuidadosamente a tampa da autoclave. a. a. Atenção!!! Não deixar que haja oscilação da pressão e temperatura! Posicionar o contra-peso (situado na tampa da autoclave) para frente para diminuir a pressão ou para trás para aumentar a pressão. de acordo com as normas de segurança. Deixar a válvula (situada na tampa da autoclave) aberta até perceber a saída de vapor condensado. 13. 2. fechar a válvula. deixando o botão de controle de velocidade de aquecimento no máximo. Ligar a autoclave. 8. reduzir a velocidade de aquecimento e marcar o tempo de esterilização (geralmente. 7. b. 15 minutos). indicando que o ar quente foi expulso e a câmara está saturada de vapor. 10. 6. III .

Soprar. superfícies e ar. Quais os cuidados que devem ser observados durante a distribuição de meio de cultura estéril nas placas de Petri? 2. região inferior da unha. aspectos. elevador. gram) das colônias submetidas à coloração. com diferentes tamanhos. Verificar a presença de microrganismos em partes do corpo humano. Expor uma placa com o meio de cultura solidificado em um local de sua preferência (laboratório. 3. Com auxílio de um swab.ESTUDO DA CONTAMINAÇÃO AMBIENTAL E DA MICROBIOTA HUMANA 1 . Verter o meio de cultura “ágar de contagem padrão” ou ágar triptona de soja previamente fundido em banho-maria em placas de Petri estéreis. 5.PROCEDIMENTOS 1. espalhá-lo na superfície dos meios de cultura. cor. 4.OBJETIVOS 1. Observar a presença de diferentes colônias na superfície dos meios de cultura. língua. 2. Tocar suavemente a extremidade dos dedos na superfície dos meios de cultura. realizar algumas das seguintes opções: Friccionar um swab previamente umedecido em solução salina estéril na bancada e. Aplicar as técnicas de manobras assépticas. em seguida. rampa. Descrever as características (morfologia. 3. arranjo. Expor as placas abertas ao fluxo de saída de ar de um aparelho de ar-condicionado por alguns segundos. III – INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS 1. retirar material de partes do corpo humano: saliva. Qual técnica pode ser empregada para se estimar o grau de contaminação microbiana presente em um ambiente? Como esta técnica é denominada? Quais suas vantagens e limitações? 21 . superfície das mãos. Com as placas restantes. IV – Questões para fixação de conhecimento 1. 2. etc) durante 15 minutos. (Atenção! Realizar esta etapa de distribuição dos meios de cultura na “zona de segurança” da chama do bico de Bunsen para evitar contaminação). unhas sobre os meios de cultura. Incubar as placas a 35º C por 48 horas. nariz e. Selecionar algumas colônias para serem submetidas à coloração de Gram. em seguida. saguão. ouvido. tossir ou espirrar sobre a superfície dos meios. 4. 2 . 2. Aguardar a solidificação dos meios de cultura nas placas. Observar os diferentes tipos de bactérias e fungos. Depositar alguns fios de cabelo. espalhá-lo na superfície do ágar (cuidado para não romper o ágar!). Fazer o mesmo em outro tipo de superfície.

do Ministério da Saúde (BRASIL. NOTAS: (1) Valor Máximo Permitido. comercialmente disponíveis. autoclaváveis ou pré-esterilizados. 22 . minas. III . químicos e radioativos atendam ao padrão de potabilidade e que não ofereça riscos à saúde (BRASIL. 2004). de material aprovado para contato com água destinada ao consumo humano e. (3) a detecção de Escherichia coli deve ser preferencialmente adotada. Sistemas que analisam menos de 40 amostras por mês: Apenas uma amostra poderá apresentar mensalmente resultado positivo em 100mL. dentre outras. Podem-se também empregar recipientes descartáveis (sacos plásticos) previamente esterilizados. de preferência.PROCEDIMENTOS a) Seleção e preparação dos frascos para coleta das amostras de água Utilizar frascos com tampas à prova de vazamentos. de 25 de março de 2004. A água potável deve estar em conformidade com o padrão microbiológico estabelecido pela Portaria nº518. nascentes. físicos. incluindo fontes individuais como poços. 2004).ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DE ÁGUA ONT I – INTRODUÇÃO Entende-se por água potável a água para consumo humano cujos parâmetros microbiológicos. II – OBJETIVOS Avaliar a qualidade microbiológica de amostras de água de abastecimento e de água mineral. (2) água para consumo humano em toda e qualquer situação. apresentado na Tabela abaixo: Padrão microbiológico de potabilidade da água para consumo humano PARÂMETRO Água para consumo humano (2) (3) VMP (1) Escherichia coli ou coliformes termotolerantes Água na saída do tratamento Coliformes totais Ausência em 100mL Ausência em 100mL Água tratada no sistema de distribuição (reservatórios e rede) Escherichia coli ou coliformes termotolerantes Coliformes totais (3) Ausência em 100mL Sistemas que analisam 40 ou mais amostras por mês: Ausência em 100mL em 95% das amostras examinadas no mês.

preferencialmente. distribuindo as placas numa superfície plana. a partir de embalagens de maior capacidade. permitindo ainda verificar as condições higiênicas em diferentes pontos da rede de distribuição. Se não houver fluxo laminar. Se a quantidade de amostra encaminhada para análise for menor do que a unidade analítica requerida. com as portas e janelas do laboratório fechadas. 1.plaqueamento em profundidade (“pour plate”) Também conhecida como contagem padrão em placas. abrir o lacre com uma faca ou tesoura estéril ou flambada. no caso das águas minerais. deve-se submeter metade à análise. Incubação: aguardar a completa solidificação do meio de cultura. numa superfície plana. lacrada. 0.assepticamente. Misturar o inóculo com o meio de cultura movimentando suavemente as placas.Água mineral engarrafada: deve ser coletada na embalagem original. 3. desinfetar o bocal com etanol 70% e. invertendo a embalagem várias vezes. Para tal. adicionar ao frasco de coleta.1 mL da amostra de água em placas de Petri vazias estéreis. 2. espátulas. antes da esterilização. A abertura e a retirada da unidade analítica devem ser feitas. 8 a 10 vezes no sentido horário e 8 a 10 vezes no sentido anti-horário. Adição do meio de cultura: verter nas placas inoculadas. no caso de águas tratadas. Todos os instrumentos e utensílios empregados na abertura das embalagens e retirada das unidades analíticas (tesouras. é um procedimento que objetiva estimar o número de bactérias heterotróficas na água.Água de torneira ou tubulações: limpar a área externa da saída com etanol 70%. b) Abertura das embalagens e tomada da unidade analítica: antes de abrir as embalagens deve-se desinfetar a área externa com etanol 70%. 23 . Contagem de heterotróficos.1 mL de solução de tiossulfato de sódio a 1. etc) devem ser previamente esterilizados em autoclave ou estufa de esterilização ou mergulhados em etanol 70% e flambados no momento do uso. 15 a 20 mL de ágar padrão para contagem (PCA).Procedimento para coleta: . deixar a água fluir por 2 a 3 minutos. deve-se homogeneizar todo o conteúdo.8% para cada 100 mL de água que se pretende coletar. facas. para prevenir qualquer contaminação da amostra. em movimentos na forma de oito ou em movimentos circulares. adicionar 1 mL e 0. Inoculação: através de pipeta estéril. se o material for resistente ao calor. inverter as placas e incubar a 35o C por 48 horas. chama azulada. previamente fundido e resfriado a 45o C. para remoção dos contaminantes presentes. deve-se trabalhar na região próxima à chama do bico de Bunsen de tamanho médio. particularmente como uma ferramenta para acompanhar variações nas condições de processo. flambar. . Após a solidificação. Amostras de água clorada devem ter o cloro totalmente neutralizado imediatamente após a coleta. c) Métodos de análise de água I. Desprezar o volume inicial e coletar a amostra em um frasco estéril. Havendo necessidade de coletar volumes menores. no interior de câmaras de fluxo laminar. reservando a outra metade como contra-amostra. pinças. para evitar correntes de ar. ou a eficiência das diversas etapas de tratamento.

O grupo inclui cerca de 20 componentes. Esta definição objetivou. dentre os quais encontram-se tanto bactérias do trato intestinal de humanos e de outros animais de sangue quente. coli no grupo fecal. Usar notação exponencial e apenas uma casa decimal depois da vírgula.5o C. passar aos itens subseqüentes. Com uma pipeta de 10 mL estéril. A partir de cada tubo positivo no item anterior. Em caso positivo. em um contador de colônias. capazes de fermentar a lactose com produção de gás em 24 a 48 horas a 35o C. Em caso negativo. Calcular o UFC por mL da amostra multiplicando o número de colônias pelo inverso da diluição inoculada. II. como Serratia e Aeromonas. dos quais dois (Enterobacter e Klebsiella) incluem cepas de origem não fecal. Número Mais Provável de Coliformes Totais e Termotolerantes – Técnica dos Tubos Múltiplos Introdução Grupo dos coliformes totais: este grupo inclui as bactérias na forma de bastonetes Gram negativos.Contagem as colônias e cálculo dos resultados: selecionar as placas com 30 a 300 colônias e contar as colônias com o auxílio de uma lupa. em 24 horas a 45. transferir uma alçada bem carregada de cultura para tubos de caldo Verde brilhante (VB). II. na apresentação dos resultados. passando para os itens subseqüentes. Confirmação de coliformes totais: 1. selecionar apenas os coliformes originários do trato intestinal. do que a quantificação de coliformes fecais ou de E. coli. Grupo dos coliformes termotolerantes: a definição é a mesma dos coliformes totais. sabe-se. Teste presuntivo: 1. adicionar 5 porções de 10 mL em 5 tubos contendo 10 mL de caldo lauril sulfato triptose (LST) em concentração dupla com tubo de Durhan. 24 . não esporogênicos. em caso de crescimento com produção de gás. em princípio. Por essa razão. Incubar os tubos a 35 oc por 24 a 48 h e observar se há crescimento com produção de gás. confirmativo de coliformes totais. entretanto que o grupo dos coliformes fecais inclui pelo menos três gêneros. sua quantificação em água e alimentos é menos representativa. Atualmente. reincubar até completar 48 horas e repetir a leitura. coli. como indicação de contaminação fecal. porém muito mais significativa do que a presença de coliformes totais.2. UFC/mL = No de colônias/diluição II. Incubar os tubos a 35o C/24h e observar se há crescimento (turvação) com produção de gás. aeróbias ou anaeróbias facultativas. a presença de coliformes fecais em água e alimentos é menos representativa. Escherichia. Anotar o número de tubos de VB com gás e determinar o Número Mais Provável (NMP) de coliformes totais/50mL em tabela de NMP apropriada às diluições inoculadas (Tabela 1). porém.1. indica ausência de coliformes (totais ou fecais) nos 50 mL de amostra. dada a alta incidência de E. como indicação de contaminação fecal do que a enumeração direta de E. como também diversos gêneros e espécies não entéricas. A não ocorrência gás após 48 h. 2. 2. Enterobacter e Klebsiella. Por este motivo. restringindo-se aos membros capazes de fermentar a lactose com produção de gás.

seguido de incubação a 35-37ºC por 48 horas. para diversas combinações de tubos positivos e negativos na inoculação de 5 alíquotas de 10 g ou 10 mL da amostra por tubo.1mL de água mineral foi inoculada.5o C por 24 h e observar se há crescimento com produção de gás. Explique como os microrganismos coliformes são classificados em nível laboratorial. em duplicata. encontraram-se: a) 4 tubos de caldo verde brilhante turvos e com gás b) 3 tubos de tubos de caldo EC turvos e com gás. As contagens de UFC em cada uma das placas foram: 68 e 77.2 IV – Questões para fixação de conhecimento 1. 4. A não ocorrência de gás após 24 h indica ausência de coliformes termotolerantes na amostra. Número Mais Provável (NMP) . Expresse o resultado em UFC de heteroróficos por mL de água analisada. A partir de cada tubo positivo de LST (item II.2 10.2 4.4 7. Confirmação de coliformes termotolerantes: 1.3. confirmativo de coliformes termotolerantes. A não ocorrência de gás após 48 h de incubação indica ausência de coliformes totais na amostra. Em uma análise de coliformes em água pela técnica do Número Mais Provável. 3. IVIIV . Número de tubos positivos 1 2 3 4 5 Fonte: SILVA et al. Os procedimentos para coleta de amostras de água mineral e de água de torneira ou de tubulações são exatamente os mesmos? Por quê? 3. através da técnica de semeadura em profundidade (pour plate) em ágar padrão para contagem (PCA). 5.2 2. Uma alíquota de 0. Incubar os tubos a 45. 2.3. Anotar o número de tubos de EC com gás e determinar o NMP de coliformes fecais/50mL em uma tabela de NMP apropriada às diluições inoculadas (Tabela1).1) transferir uma alçada bem carregada da cultura para tubos de caldo EC. II. 2. Expresse os resultados em NMP de coliformes/100mL de amostra. empregando-se 5 tubos. (2005) NMP/50mL < 2.nível de 95% de probabilidade.V NAÇÃO 25 .

coli. E. AMBIENTAL 26 .DETECÇÃO DE COLIFORMES EM ÁGUA – MÉTODO CROMOGÊNICO ONT ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DE ÁGUA Essa metodologia emprega substratos cromogênicos e fluorogênicos para detecção simultânea de coliformes totais e de Escherichia coli. Basta adicionar o reagente à amostra de água e incubar a 3537ºC por 18 a 48h (até 24h para COLILERT – da IDEXX e até 48 h para COLITEST – LKP Diagnósticos). eles não podem se reproduzir e interferir. Interpretação dos resultados . Amarelo: teste positivo para presença de coliformes totais. Juma vez que a maioria dos não coliformes não conta com estas enzimas. eles utilizam ß-galactosidase para metabolizar o indicador de nutriente ONPG e alterá-lo de incolor para amarelo. coli utiliza ßglucuronidase para metabolizar MUG e criar fluorescência.COLILERT Incolor: frasco com 100 mL de amostra de água. abordagem diminui a incidência de falso-positivos e falso-negativos. Amarelo/Fluorescência azul: teste positivo para presença de E. À medida que os coliformes se reproduzem no Colilert. Os poucos não coliformes que têm estas enzimas são seletivamente suprimidos pela matriz especificamente formulada do Colilert.

incubando-o a 37ºC por 18-48h 3) Interpretação dos resultados: 27 .Passos para uso do COLITEST: 1) Coletar a amostra de água até a marca de 100mL 2) Adicionar o meio de cultura COLItest.

R.REFERÊNCIAS RIBEIRO. M. 2005. N. B. 2000. A. rev. SILVA.. SOARES. da.. Microbiologia pratica: roteiro e manual. A. São Paulo... SILVEIRA. SP: Atheneu. A. C. SP: Livraria Varela. 112p. SILVEIRA. 239 p. F. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan. SILVA. 3. N. V. A. bacterias e fungos . V. R. JUNQUEIRA. Práticas de microbiologia. N. C. ed. da. Manual de métodos de análise microbiológica de alimentos. M. M. 28 . N. 2007. S. F. CANTÚSIO NETO. e atual São Paulo. JUNQUEIRA. C. 2006. A. 536 p VERMELHO. 164 p. Manual de métodos de análise microbiológica da água. São Paulo: Varela.

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