Aulas Práticas do Laboratório de Microbiologia

2011

HAMILTON R. F. BAVUTTI MARCOS LUENGO BLANCO MARIA RAQUEL MANHANI

BIOSSEGURANÇA EM LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA
1. O trabalho no laboratório de microbiologia exige, obrigatoriamente, o uso de epi: avental de mangas longas, com elástico nas mangas, fechado; óculos; touca; máscara facial; luvas; sapatos fechados ou pró-pés; 2. Evitar o uso de lentes de contato (preferir óculos) e maquiagem; 3. Não fumar, não comer, não beber; evitar tocar a boca e outras mucosas ou pele; 4. Não deixar cadernos, canetas, livros, bolsas, sacolas, dentre outros na bancada de trabalho – eles devem ser colocados em locais onde não haja risco de contaminação; 5. Cuidado com a chama do bico de Bunsen (figura 1), que deverá estar acesa durante a maior parte do tempo; 6. Desinfetar a bancada no começo e no fim do trabalho com solução de álcool 70% ou outra similar (cuidado! Verifique se o bico de Bunsen não está aceso!!!); 7. Ler atentamente o protocolo da aula prática e não iniciar o trabalho antes de ter certeza sobre o que fazer, a cada passo; 8. Antes de iniciar o trabalho assegure-se de que tem, à mão, todo o material necessário – não pegar mais material que o necessário nem material indevido; 9. Todo o material deve ser devidamente identificado; 10. Utilizar corretamente as técnicas de manuseio de culturas microbianas: 11. Não falar durante o manuseio das culturas, para minimizar o risco de contaminação das mesmas; 12. Relatar imediatamente, ao professor ou técnico, qualquer evento, acidente ou imprevisto; 13. Quando terminar de trabalhar com culturas, retirar as luvas e descartá-las em lixo infectante, lavar as mãos com sabonete antisséptico ou similar; deixar secar ao ar; 14. Guardar todo material usado no local apropriado e deixar as bancadas em ordem ao fim do trabalho; 15. O lixo deverá ser adequadamente acondicionado e todo material contaminado deve ser autoclavado para descontaminação antes de ser descartado ou reutilizado; 16. Retirar todos os EPIs (avental, luvas, óculos de segurança) quando sair do laboratório; 17. Depois de usar o microscópio, desligar a luz e limpar a objetiva com lenço de papel fino embebido em solução apropriada para limpeza das lentes, para retirar o óleo de imersão. Várias precauções devem ser obrigatoriamente tomadas durante os procedimentos no laboratório de Microbiologia para evitar a contaminação das pessoas, do ambiente e das culturas: Qualquer procedimento só deve se iniciar depois que todos os objetos necessários estejam o mais próximo possível do operador e deve ser realizado o mais rapidamente possível; Os frascos que precisam ser abertos devem ser fechados o mais rapidamente possível; o trabalho deve ser feito ao redor do bico de Bunsen e não são admitidas correntes de ar;

Figura 1 – Bico de Bunsen

2

Os tampões de algodão ou roscas dos frascos não podem ser largados nem colocados sobre nenhuma superfície. mantendo-a na mão. na posição mais horizontal possível e deve ter sua “boca” novamente flambada antes de ser fechado. eles devem ser mantidos abertos ao redor do bico de Bunsen. devem permanecer na mão do operador.essa é a região "fria" da chama. Os movimentos que devem ser realizados na flambagem de alças e agulhas encontram-se na figura 2. 3. Usar imediatamente. num ângulo próximo à posição vertical. 4. 3 . Esfriar a alça no ar. panos. o determinações quantitativas. Quando você flamba o tubo. impedindo a entrada de contaminantes. acima do cone azul claro. Mover lentamente a alça para dentro da região mais quente da chama. Essa posição deixa o dedo mínimo livre para segurar os tampões dos tubos. podendo ser usadas em "Flambagem": aquecimento gradual da ponta da alça.Todos os frascos abertos devem ter suas “bocas” flambadas imediatamente. as superfícies internas estéreis das placas de Petri devem entrar em contato com o ar o menor tempo possível. As partes estéreis de alças ou pipetas que entrarão em contato com as culturas ou com frascos estéreis não podem ser tocadas nem entrar em contato com outras superfícies não estéreis como. indicador e médio). aquecimento rápido pode produzir a liberação de pequenas gotículas e formação de aerossóis. 6. 2. Posicionar a ponta da alça na região azul claro da chama . que força o ar para fora. alternativamente ela pode ser resfriada nas paredes internas de um tubo ou placa de Petri (regiões estéreis). Re-esterilizar a alça imediatamente após o uso. Deve-se proceder da seguinte maneira: 1. paredes externas de placas ou tubos. 1. superfície da bancada. por exemplo. pois depois do uso em culturas.   alças calibradas: que carregam um volume conhecido do material. Mover a alça para que toda a extensão seja aquecida adequadamente ("ao rubro"). Flambagem de alças e agulhas de platina ou de níquel-cromo  alça de níquel-cromo: Segura-se a alça perto de sua parte superior. o calor cria uma corrente de convexão. como se faz com um lápis (dedo polegar. entre o dedo mínimo e a palma da mão durante todo o procedimento Durante as manipulações. mantendo-a até que fique completamente vermelha. sem colocá-la em nenhum local (para que ela não se contamine outra vez). 5. etc.

antes de fechar. rode o frasco e não o tampão . não se esqueça.Segure a alça como se fosse um lápis. rodando o tubo e não o tampão. dentro da chama do bico de Bunsen enquanto isso. Segure o tubo com a mão esquerda e retire o tampão com dedo mínimo da mão direita. recolocando o tampão. Flambagem de tubos e frascos Afrouxe o tampão do frasco ou tubo. Feche o tubo. Depois de usar. A seqüência de flambagem de tubos e frascos encontra-se na figura 3. próximo à chama Aqueça gradualmente toda a extensão "ao rubro" Figura 2 – Seqüência para flambagem de alça e de agulha de inoculação 2. quase na vertical Posicione a ponta na região fria da chama Esfrie no ar. Passe a boca do tubo para frente e para trás. para que ele saia facilmente. mantendo o seguro entre esse dedo e a palma da mão (para retirar o tampão. repita a operação acima.o tampão fica fixo). 4 . o tampão fica preso na mão do operador.

como um lápis. A pipeta contaminada deve ser colocada em um frasco com desinfetante. com algodão na ponta. Não encostar a ponta da pipeta em regiões não estéreis dos tubos. Manuseio de pipetas As pipetas graduadas ou de Pasteur. imediatamente após o uso. colocando o aspirador e mantendo o dedo mínimo livre para abrir o frasco que contem o líquido a ser transferido. previamente esterilizadas. acondicionadas em recipientes especiais ou individualmente embrulhadas devem ser manuseadas na frente do bico de Bunsen.Remova o tampão com o dedo mínimo Segure o tampão entre o dedo e a palma da mão Passe a boca do tubo dentro da chama Recoloque o tampão. girando o tubo Figura 3 – Flambagem de tubos e frascos 3. para ser transportada. Segurá-las pela região do bocal. 5 .

culturas puras de microrganismos. Flambar rapidamente a boca dos tubos contendo microrganismos ou meio estéril. 4. ainda. os recipientes (tubos de ensaio. Flambar ao rubro alça ou agulha antes e após cada inoculação. Trabalhar em áreas submetidas previamente à limpeza e à desinfecção. 2. Os procedimentos 2 a 5 estão ilustrados na Figura 4.INTRODUÇÃO As manobras assépticas são técnicas que impedem a entrada de microrganismos onde estes não são desejados. soluções e equipamentos ou. sem que haja perigo de superaquecimento ou queimaduras.MANOBRAS ASSÉPTICAS I . preferencialmente na parte interna do recipiente que contém o meio de cultura. sendo retirada e mantida segura pelo dedo mínimo da mão que detém a alça ou agulha durante a inoculação. * Operações com microrganismos patogênicos que podem gerar aerossóis. venham a contaminar materiais estéreis do laboratório como meios de cultura. ou seja. dentro da zona de segurança. imediatamente após abri-los. flambá-la rapidamente e mantê-la nesta região durante todo o trabalho. centrifugação. agitação intensa. 5. com tampão de algodão - 6 . placas de Petri. para reduzir o número de potenciais microrganismos contaminantes. ou seja. como por exemplo.MATERIAL NECESSÁRIO pipetador pipetas de 1 mL e 10 mL embaladas em papel kraft ou similar estante para tubos tubos de ensaio contendo 10 mL de solução de corante (simulando meio de cultura estéril) tubos de ensaio contendo 9 mL de água (simulando diluente estéril) alça de platina ou de níquel-cromo tubos de ensaio vazios Erlenmeyer contendo 200 mL de solução de corante (simulando meio de cultura estéril). 3. seguidas da abertura do frasco que contém a suspensão microbiana devem ser realizadas em cabine de segurança (capela de fluxo laminar vertical) e alças e agulhas devem ser esterilizadas em forno esterilizador (Figura 5). garantem a boa assepsia. 6. ou antes de fechá-los. Estas impedirão que microrganismos presentes no ar ou depositados sobre as diversas superfícies com a poeira. Desembrulhar a pipeta estéril dentro da zona de segurança. II . As técnicas referentes à manipulação de culturas envolvem basicamente: 1. Trabalhar dentro da “zona de segurança” do bico de Bunsen*. Deixar esfriar o instrumento antes de obter o inóculo. etc) com meio de cultura devem ser abertos o mais próximo possível da chama do bico. Também impedem que os microrganismos com que estamos trabalhando nos contaminem ou ao ambiente. A tampa nunca deve ser colocada sobre a bancada.

etc) e outros objetos de frequente manipulação (alça. IV . A partir do tubo contendo solução de corante. agitando suavemente. . transferir. Agitar suavemente até que o corante se distribua de maneira uniforme. Repetir quantas vezes julgar necessárias até o domínio da técnica. este procedimento deve ser realizado na zona de segurança do bico de Bunsen). Descrever as principais técnicas de manobras assépticas. etc). 4. Realizar a desinfecção da bancada de trabalho.III . c. b. com auxílio de pipeta de 1 ou 2 mL. 7 . 3.Realização de diluições seriadas 1. Identificar e manipular corretamente a vidraria principal e outros objetos de uso mais frequente em Microbiologia. Realizar a desinfecção da bancada de trabalho. distribuir meios de cultura estéreis em placas de Petri previamente esterilizadas. Deste último tubo. placas. realizar diluições seriadas. de maneira asséptica (próximo ao bico do Bunsen). bico de Bunsen. (Atenção! Este procedimento deve ser realizado na zona de segurança do bico de Bunsen). Desenvolver habilidade de: a.OBJETIVOS bico de Bunsen placas de Petri embaladas em papel Kraft ou similar 1. transferir 1 mL para outro tubo contendo 9 mL de água. (Atenção! flambar rapidamente a boca dos tubos contendo a solução de corante. a válvula da tubulação de gás).PROCEDIMENTOS Parte A. Distribuir 1 mL de solução de corante. Retirar uma pipeta de 1 mL da embalagem e acoplá-la ao pipetador. a válvula da tubulação de gás). A partir deste tubo. . Retirar as placas vazias da embalagem e mantê-las próximas ao bico de Bunsen. Treinamento de manobras assépticas . usando pipeta estéril de 1 mL. contida em um tubo.Transferência de meio de cultura contido em Erlenmeyer para placas de Petri 1. transferir 1 mL para outro tubo contendo 9 mL de água. Mostrar a vidraria principal (pipetas. 2. A tampa nunca deve ser colocada sobre a bancada. 2.Transferência de caldo estéril para tubos previamente esterilizados 1. Acender o bico de Bunsen (abrir primeiramente a válvula do bico de Bunsen e a seguir. 1 mL para tubo contendo 9 mL de água. imediatamente após abri-los e antes de fechá-los. sendo retirada e mantida segura pelo dedo mínimo da mão que detém a alça ou agulha durante a inoculação. 2. 3. tubos. manipular tubos contendo meios estéreis. 3. Acender o bico de Bunsen (abrir primeiramente a válvula do bico de Bunsen e a seguir. Parte B. agulha de inoculação. para outro tubo vazio.

Manobras assépticas. Fonte: VERMELHO (2006) Figura 5 . Transferir aproximadamente 20 mL de solução de corante contida em Erlenmeyer para cada uma das placas. (Atenção! flambar rapidamente a boca do Erlenmeyer contendo a solução de corante. Quais os principais objetivos das manobras assépticas? 2. Figura 4 . ou antes de fechá-lo. Qual a diluição final obtida no procedimento de diluição seriada realizado? 8 . do operador e do material em estudo. 3.Esterilizador de alças e agulhas V – Questões para fixação de conhecimento 1.4. Cite três procedimentos adotados em laboratório de microbiologia que minimizam o risco de contaminação ambiental. Repetir quantas vezes forem necessárias até se obter domínio da técnica. imediatamente após abri-lo.

8 m até 10 por 25 m. a partir daí. se previamente tratadas com solução de iodo.Em cadeias: estreptococos Divisão em dois planos: . Arranjo: grupamentos bacterianos.3 por 0. sendo que as Gram-positivas possuem várias camadas de peptideoglicano e ácidos teicóicos.De forma não organizada: cocos em cachos (estafilococos) . existem as espiroquetas. Durante o processo de coloração de Gram. Dependendo do plano e do número de divisões através das quais as bactérias continuam unidas. Entre as bactérias espiraladas. uma nova metodologia de coloração diferencial. como células isoladas. através do método de Ehrlich (1882). que bactérias que eles continham não eram descoradas pelo álcool.Tétrades Divisão em três planos: . Coloração de Gram Em 1884. podem aparecer os seguintes arranjos: . Espirilos: células espiraladas.Bacilos e Espirilos: Apresentam-se. pode-se observar: bacilos aos pares (diplobacilos) ou em cadeias (estreptobacilos). e as Gram-negativas. fosfolipídeos e lipopolissacarídeos. ao corar cortes histológicos com violeta de genciana. Bacilos: células cilíndricas. porém. o complexo cristal 9 . O mecanismo da coloração de Gram refere-se à composição da parede celular. Forma: as bactérias podem ser classificadas quanto à forma em três grupos básicos:    Cocos: células esféricas. ocasionalmente. medindo desde 0. o tratamento com álcool (ou álcool-acetona) extrai os lipídeos. Assim. o mecanismo da coloração de Gram foi intensamente estudado. Algumas células comportam-se como bacilos curvos.COLORAÇÃO DE GRAM E MORFOLOGIA BACTERIANA I . Surgiram muitas modificações. em geral. em forma de bastonetes. Ele adicionou a este procedimento um contra-corante (safranina.INTRODUÇÃO As células bacterianas são caracterizadas quanto aos seguintes aspectos: Tamanho: as bactérias são microscópicas. que podem ser denominados víbrios. uma fina camada de peptideoglicano sobre a qual encontra-se uma camada constituída de lipoproteínas. contudo sem afetar substancialmente a idéia original. fucsina básica) e estabeleceu.Feixes cúbicos: sarcina . daí resultando uma porosidade ou permeabilidade aumentada da parede celular das bactérias Gram-negativas. precisando de um microscópio óptico comum. não é possível visualizá-las a olho nu. Sendo assim. Ao longo desses anos.Aos pares: diplococos .Cocos: Divisão em um plano: . o médico dinamarquês Christian Gram descobriu. empiricamente. as quais são células flexíveis que se movimentam por rotação e flexão.

Nas bactérias Gram-positivas. pela perda da capacidade de retenção do corante. citar as formas das bactérias e descrever seus arranjos. Conseqüentemente. Os poros da parede das bactérias Gram-negativas permanecem suficientemente grandes.o complexo CV-I é removido da célula pode que permanece 4 – Fucsina ou safranina A célula não é afetada. a porosidade diminui. têm o complexo corado extraído pelo álcool. devido à pequena espessura da camada basal e às descontinuidades existentes nesta camada. A célula adquire o corante. podem causar danos à parede celular. provavelmente. A reação de Gram é extremamente dependente do estado fisiológico da célula. Enzimas líticas. Outra explicação baseia-se também em diferenças de permeabilidade entre os dois grupos de bactérias.OBJETIVOS Executar a técnica de coloração de Gram. classificar as bactérias de acordo com a coloração de Gram. violeta não da e diminuição permeabilidade. o complexo iodo-cristal violeta poderá ser retirado da célula. As culturas jovens respondem melhor à diferenciação tintorial. que permanece violeta permanece violeta parede Extração dos lipídeos da da parede celular. o complexo CV-I é retido na parede após tratamento pelo álcool-acetona. alterando a permeabilidade aos solventes (álcool-acetona). De acordo com Trabulsi (2008). A parede celular das bactérias Gram-positivas. verificar a importância de realizar a coloração de Gram a partir de um material clínico. relacionar a composição da parede celular das bactérias com os corantes de Gram. aumento da da porosidade. 10 . uma diminuição do diâmetro dos poros da camada de peptideoglicano da parede celular. as bactérias Gramnegativas. mesmo após tratamento com álcool-acetona. em pontos de aderência entre a membrana externa e a membrana celular. na etapa diferencial com álcool-acetona. que I no interior da célula.violeta-iodo (CV-I) pode ser retirado e as bactérias Gram-negativas são descoradas. o que causa. sair da o complexo 3 – Álcool-acetona Desidratação celular. em virtude de sua composição diferente.Formação do complexo CVI no interior da célula. II . torna-se desidratada durante o tratamento com álcool. Etapas da coloração de Gram e aspectos das células gram-positivas e gram-negativas Soluções e ordem de aplicação 1 – Cristal violeta 2 – Solução de lugol Reação e aspecto das bactérias Gram-positivas Coradas em violeta Gram-negativas Coradas em violeta Formação do complexo CV. possibilitando a extração do complexo CV-I. que deixa as células descoradas. excretadas normalmente por culturas envelhecidas. permanecendo violeta tornando-se vermelha. porosidade CV-I célula. As culturas velhas de Gram-positivas podem se apresentar com Gram variável. como por exemplo. a permeabilidade é reduzida e o complexo CV-I não pode ser extraído.

11 .III – MATERIAL . Flambar a alça e deixar o esfregaço secar à temperatura ambiente.             Cristal violeta para Gram Solução de Lugol Solução de fucsina ou de safranina para Gram Solução de álcool-acetona Solução salina fisiológica Microscópio óptico Bico de Bunsen Alça e agulha de inoculação Pinça Lâminas para microscopia Lenços de papel absorvente Óleo de imersão IV – MÉTODO As etapas da preparação do esfregaço a partir de meios líquido e sólido encontram-se na figura 6. 4. aguardar um minuto e desprezar o corante na pia. Staphylococcus aureus. Proteus mirabilis. 3. Com auxílio de uma alça de platina (ou de níquel-cromo) estéril. Esperar a lâmina esfriar e realizar a coloração. colocar duas alíquotas de cultura bacteriana preparada no meio líquido sobre a superfície de uma lâmina de microscopia. b) Técnica de coloração de Gram 1. 2. passando duas ou três vezes a lâmina na chama do bico de Bunsen. Deixar o esfregaço secar à temperatura ambiente. Cobrir todo o esfregaço com solução de cristal violeta. Espalhar sobre a lâmina. realizar a fixação. realizar a fixação. 5. esfriá-la e coletar o inóculo bacteriano. fazendo uma suspensão homogênea. 2. Flambar a alça. Colocar uma pequena gota de solução salina fisiológica na superfície de uma lâmina. 6. passando duas ou três vezes a lâmina na chama do bico de Bunsen. Esperar a lâmina esfriar e realizar a coloração. 3. com auxílio de uma alça de platina. 4. Flambar novamente a alça. fazendo movimentos circulares de dentro para fora. a) Preparação de esfregaço de microrganismos A partir de meio líquido: 1. A partir de meio sólido: 1. Em seguida.Culturas de microrganismos (Escherichia coli. etc) mantidas em meio de cultura líquido ou em meio sólido. 5. Em seguida.

Cobrir o esfregaço com fucsina (ou safranina) e aguardar 30 segundos. Desenhar as estruturas e arranjos observados. Lavar a lâmina rapidamente em água corrente. 3. Cobrir todo o esfregaço com solução de lugol. 5. com objetiva de imersão. Figura 6 . Lavar a lâmina e secá-la ao ar (sem esfregá-la).Seqüência de preparação de esfregaço. Inclinar a lâmina e gotejar solução álcool-acetona até que não haja desprendimento de corante (cerca de 30 segundos).2. Fonte: VERMELHO (2006) V – Questões para fixação de conhecimento 1. Explique como pode ser realizada a fixação do esfregaço. 4. Observar ao microscópio. 6. 12 . aguardar um minuto e 30 segundos e desprezar o corante na pia.

As células bacterianas gram-negativas submetidas à coloração de Gram. na qual o operador deixou de realizar a etapa de lavagem com álcool-acetona terão que aspecto ao microscópio? Explique. Descreva a função de cada substância empregada na coloração de Gram. 4. 13 . Qual a importância de se realizar a fixação? 3.2.

localizados no corpo da célula vegetativa em posição central. A desidratação gera uma estrutura muito densa e altamente refrátil (refringente). Algumas células desenvolvem um mecanismo de ordem genética. o qual emprega o verde malaquita e safranina. O esporo também é chamado de endósporo e difere química e fisiologicamente da célula que o originou. É indiscutível que a esporulação é um dos mais importantes eventos da fisiologia celular bacteriana. Mas esta não é a única propriedade associada ao fenômeno. como corante e contra-corante. substância ausente na estrutura de células vegetativas. dificultando (e até mesmo impedindo) a ação de desinfetantes comuns sobre a estrutura queratinóide destas capas. é reflexo da característica particular de seu envoltório. sem uma fonte externa de nutrientes. Normalmente. no interior de uma célula bacteriana. dependendo das condições de cultivo. Existem esporos ovais e esféricos. tais como cristal violeta. localização intracelular) os esporos desempenham importante papel na sistemática bacteriana. Tais propriedades estão associadas em parte à desidratação progressiva por que passa o citoplasma celular. desidratada é aquecida em um meio aquoso. o calor é usado para facilitar a penetração do corante verde-malaquita através da parede do esporo. azul de metileno. e com dimensões variadas. mostrando um aumento de resistência ao calor. está protegido por uma dupla camada oriunda da invaginação da própria membrana interna da forma vegetativa. Este fenômeno biológico é entendido como a formação de uma nova célula – o esporo. Neste método. que lhes permite sobreviver em circunstâncias precárias. Quando colocado em um meio de cultivo adequado. tamanho. indubitavelmente. Do ponto de vista morfológico (forma. A membrana do esporo apresenta em sua composição o ácido dipicolínico. As técnicas de coloração usuais são ineficientes e o esporo se mostra impenetrável a corantes comuns. o esporo pode permanecer estável por muitos anos. alterações químicas e radiações. congelamento. tanto morfológica quanto fisiológica de um grande número de bactérias Gram positivas pertencentes aos gêneros Bacillus e Clostridium é a esporulação. subterminal ou terminal. O material genético. respectivamente. Um dos métodos mais empregados para a coloração de esporos é o de WIRTZ (1908). O contra-corante safranina é aplicado com a finalidade de diferenciar as células vegetativas dos esporos. uma preparação a fresco de bactérias esporuladas pode ser rápida e satisfatoriamente observada através de um microscópio ótico de contraste de fase.COLORAÇÃO DE ESPOROS BACTERIANOS – MÉTODOD DE WIRTZ I – INTRODUÇÃO Uma característica importante. pois estes detalhes não são muito repetidos nas várias espécies. Elas manifestam grande resistência ao calor. o ácido dipicolínico encontra-se na forma de sal – dipicolinato de cálcio. Por esta razão. Tal fenômeno também se verifica quando uma célula vegetativa. devido à grande quantidade de cátions Ca 2+ na célula. pode até ser ativado e dar origem a uma célula vegetativa capaz de se multiplicar. cromossomo. o qual pode levar horas para se completar. A esporulação é um processo demorado. Uma vez formado. causando deformações nas células. dessecação. que vão de valores que permitem a inclusão do esporo no corpo celular até dimensões maiores. Isto. 14 .

8. 7. Deixar secar ao ar naturalmente. a presença. 4. 5. Deixar esfriar. dimensão. III . Lavar em água corrente. Se a coloração de Wirtz tivesse sido aplicada a um esfregaço proveniente de células de Bacillus subtilis reativadas há 24 horas sob condições ideais de cultivo. Corar rapidamente. acrescentando mais corante. Quais gêneros bacterianos são capazes de formar esporos? 3. 10.II – OJBJETIVOS Executar uma técnica de coloração específica para a visualização de esporos bacterianos. Explique o que ocorre com as células de Bacillus subtilis quando estas são deixadas por vários dias em meio de cultura. Deixar secar. Em uma lâmina limpa.PROCEDIMENTO 1. IV . preparar um esfregaço fino a partir de cultura de Bacillus subtilis mantida há vários dias em meio sólido (por exemplo: ágar triptona-soja). Observar ao microscópio ótico com a objetiva de 100 X (imersão). com uma solução aquosa de safranina a 1%. 3. forma e localização celular de esporos em bactérias. 9. Cobrir o esfregaço com uma solução aquosa de verde malaquita a 5% e aquecer até desprendimento de vapores durante 5 minutos sobre a chama do bico de Bunsen (ou em banho-maria a 100o C por 5 a 10 minutos).  Aspecto do bacilo: normal ou dilatado  Forma do endósporo: oval ou esférico  Localização do endósporo: central. 2. Por que o esfregaço e a solução de corante verde-malaquita devem ser aquecidos? 4. subterminal ou terminal V – Questões para fixação de conhecimento 1. Deixar esfriar. por 30 segundos. Identificar através da coloração. Lavar em água corrente. que estruturas seriam observadas na lâmina após a coloração? 15 . Fixar sobre a chama do bico de Bunsen (3 a 4 vezes). em relação à forma. 6. 2. 11.INTERPRETAÇÃO  Células vegetativas: cor vermelha  Endosporo: cor verde  Bactérias não esporuladas: cor vermelha  Esporos bacterianos livres: cor verde Anotar os resultados. Não deixar a preparação secar. dimensão e localização intracelular do esporo.

Além dos nutrientes é preciso fornecer condições ambientais favoráveis ao desenvolvimento dos microrganismos. meio de carne cozida (com fragmentos de fígado . adicionado de sangue e aquecido a 80°C). umidade. tais como pH. Básicos são aqueles que permitem o crescimento bacteriano sem satisfazer.sulfato de ácido poligalacturônico. atmosfera (aeróbia. água peptonada tamponada. Geralmente. 16 . dando uma consistência intermediária. não contêm agentes solidificantes. Tendo em vista a ampla diversidade metabólica dos microrganismos.5 %. cuja função é solidificar os meios de cultura. vitaminas. cérebro. Baird-Parker (com gema de ovo) (meios ricos ou meios enriquecidos com as substâncias citadas).) de animais (carne. contudo. O ágar é um polímero . ou seja. de ágar. De acordo com a finalidade bacteriológica ou micológica. como meio de infusão de cérebro e coração. os meios líquidos. quando emprega ingredientes com composição química não definida. a maioria das bactérias não metaboliza o ágar. etc.PREPARAÇÃO DE MEIOS DE CULTURA I . de modo a permitir o crescimento de microrganismos em tensões variadas de oxigênio ou a verificação da motilidade e também para conservação de culturas. fígado. principalmente do gênero Gellidum. amido de tubérculos. provas bioquímicas. quando contêm agentes solidificantes. repiques de microrganismos. os quais permitiram o estudo de espécies isoladas (culturas puras). Os meios de cultura são classificados quanto ao estado físico em sólidos. Os meios semi-sólidos contêm de 0. pressão osmótica. Ex. Especiais quando cumprem com as exigências vitais de determinados microrganismos. etc. nenhuma exigência em especial (Ex. os meios especiais podem ser classificados em: Meios de pré-enriquecimento são aqueles que permitem a recuperção/multiplicação de microrganismos injuriados.para anaeróbios). etc. quando então são conhecidas as necessidades nutricionais específicas. dentre outras. microaeróbia ou anaeróbia). dentre outros. utilizados para ativação das culturas. extraído de várias espécies de algas. separando-as de espécies contaminantes. ágar sangue.) e de microrganismos (levedura) e artificiais. Triptose Sulfito Ciclosserina (TSC) . peptona de soja.INTRODUÇÃO Até cerca de 1880 os microrganismos eram cultivados em meios líquidos. caldo lactosado (isolamento de Salmonella sp em alimentos). Os meios de cultura podem ainda ser classificados quanto à procedência dos constituintes em naturais ou complexos. para amostras que sofreram algum tipo de tratamento (térmico ou químico). em fontes de carbono. meios Shahidi Ferguson Perfringens (SFP).075 a 0. temperatura. principalmente ágar entre 1 e 2%. tomate. apresentando-se como um caldo. sintéticos ou ainda quimicamente definidos quando a composição química é conhecida (usados para trabalhos de pesquisa) e seus componentes servem para suprir as exigências nutritivas dos microrganismos. sais minerais. Os meios de cultura consistem da associação qualitativa e quantitativa de substâncias que fornecem os nutrientes necessários ao desenvolvimento (cultivo) de microrganismos fora do seu meio natural. caldo e ágar simples). existem vários tipos de meios de cultura para satisfazerem as variadas exigências nutricionais. quando Robert Koch e sua equipe introduziram os meios de cultura sólidos. Quanto à composição química podem ser simples (meios básicos) ou complexos. ágar chocolate (ágar simples fundido. tais como extratos de vegetais (malte. nitrogênio. dentre outros. energia. caseína.

Seletivos . 17 . etc.empregados para a determinação quantitativa da população microbiana (ágar de Contagem padrão em placas – PCA.). Exemplo: meios com telurito de potássio (para isolamento de Corynebacterium diphtheriae).empregados nas determinações de vitaminas.Meios de Enriquecimento . Esses meios têm a propriedade de estimular o crescimento de determinados microrganismos. para isolamento de Staphylococcus aureus. caldo nitrato. ágar Baird-Parker. de diluentes. para fungos. mas existem alguns que também podem inibir o crescimento de outros. bem como microrganismos exigentes e fastidiosos. meio semi-sólido. meio semi-sólido. ou seja. ágar triptona de soja – TSA. Diferenciais . etc. caldo triptofano. ágar sangue. agar Baird-Parker para isolamento e diferenciação de cocos Gram positivos (sólidos). meio Baird-Parker. etc. ágar simples. meios com sais biliares e verde brilhante para isolamento seletivo de Salmonella. Meios de triagem . Caldo Tioglicolato para Clostridium perfringens.meios que avaliam determinadas atividades metabólicas permitindo caracterização e identificação perfunctória ou presuntiva de muitos microrganismos (ágar tríplice açúcar e ferro. meio com leite. SFP.) Identificação – utilizados na realização de provas bioquímicas e verificação de funções fisiológicas de organismos submetidos à identificação (meios Oxidação/Fermentação. etc.) Estocagem ou manutenção .PDA. ágar batata dextrose . Ágar MacConkey para a diferenciação de Enterobactérias. Ex. meio de sulfito indol motilidade. ágar triptona de soja. Contagem . II – OBJETIVOS Familiarizar-se com técnicas de preparação e esterilização de meios de cultura sólidos e líquidos. garantem a viabilidade de microrganismos (ágar Sabouraud. A maioria deles é também diferencial.utilizados para conservação de microrganismos no laboratório. Caldo Tetrationato e Selenito-Cistina para cultivo de Salmonella sp (líquidos). meios com 7.quando proporcionam nutrientes adequados ao crescimento de microrganismos presentes usualmente em baixos números ou de crescimento lento.5% de cloreto de sódio. meios com antibióticos para isolamento de diversos microrganismos (TSC.os que contêm substâncias que inibem o desenvolvimento de determinados grupos de microrganismos. tais como meio de Eosina Azul de Metileno – EMB (diferencial para coliformes).quando contêm substâncias que permitem estabelecer diferenças entre microrganismos muito parecidos. etc). meio Escola Paulista de Medicina – EPM. Ágar sangue. permitindo o crescimento de outros. ágar citrato. indol. Dosagem . além do preparo de pipetas e placas de Petri para posterior utilização. meio motilidade. ágar Salmonella-Shigella (SS) e ágar MacConkey. antibióticos e aminoácidos. lisina – MILi. caldo ou ágar uréia. permitindo diferenciar as colônias (sólidos) dos microrganismos.

protegendo-os com papel manilha ou kraft. um béquer de vidro ou lata de alumínio). Transferir. as mesmas são esterilizadas à parte por filtração. até completa dissolução do meio de cultura (o meio torna-se translúcido). 2.22 m de diâmetro (Millipore. Sartorius). Após esterilização. Preparação de meio de cultura sólido de uso geral 1. 4.85 g de cloreto de sódio (NaCl) e adicionar 100 mL de água destilada. 2. Após esterilização. 5. Preparação de solução fisiológica (0. e depois incorporadas. com auxílio de pipeta graduada. Preparação de meio de cultura líquido – caldo triptona e soja 1. 3. agitar até completa dissolução do meio e cultura. Em um béquer de 150 mL. através de membranas (de nitrocelulose ou acetato de celulose) com poros de 0. Acondicionar os tubos em um suporte adequado (por exemplo. ao meio previamente esterilizado. Esterilizar o meio de cultura em autoclave a 121o C por 15 minutos. Acondicionar os tubos em um suporte adequado (por exemplo. C. B. com auxílio de proveta. açúcares). armazená-la em geladeira ou em lugar fresco. Esterilizar o meio de cultura em autoclave à temperatura de 121o C por 15 minutos. 4. pesar quantidade necessária para o preparo 50 mL de caldo triptona e soja – TSB e adicionar 100 mL de água destilada. Com auxílio de um bastão de vidro. 4. Com auxílio de um bastão de vidro. 18 . protegendo-os com papel manilha ou kraft. agitar até completa dissolução. 5. agitando freqüentemente com auxílio de bastão de vidro. armazená-la em geladeira ou em lugar fresco. um béquer de vidro ou lata de alumínio). Transferir. 5 mL de solução para tubos de ensaio com tampa rosqueável (Atenção! Não fechar completamente as tampas dos tubos). assepticamente. pesar 0. Em um Erlenmeyer ou outro recipiente apropriado de 250mL. Após a esterilização. 5. pesar quantidade necessária para o preparo de 100 mL de meio de cultura não seletivo (por exemplo: Ágar Padrão para Contagem – PCA ou Ágar Triptona de Soja . porém se for necessário utilizar algumas substâncias termolábeis (por exemplo: uréia) ou que reajam com as substâncias dos meios (aminoácidos. Em um béquer de 250 mL.III . Esterilizar o meio de cultura em autoclave a 121o C por 15 minutos. 5 mL de caldo para tubos de ensaio com tampa rosqueável (Atenção! Não fechar completamente as tampas dos tubos).PROCEDIMENTOS A.TSA) e adicionar 100 mL de água destilada. proteger o tampão com papel manilha ou Kraft (ou similar). Adicionar tampão de algodão e gaze. 3. Aquecer em banho-maria (ou em chama de bico de Bunsen). com auxílio de pipeta graduada. Observação: Alguns meios de cultura são preparados da mesma forma. 2. 3.85% de NaCl) estéril 1. armazenar o meio de cultura em geladeira (ou em lugar fresco e ao abrigo da luz).

embrulhar 4 placas de Petri e 5 pipetas graduadas de 2 mL em papel manilha (ou similar). De acordo com o estado físico. Cite dois exemplos de meios de cultura que sejam simultaneamente seletivos e diferenciais. IV – Questões para fixação de conhecimento 1. Preparação de pipetas e placas de Petri para esterilização 1. De acordo com orientação de seu professor. Cite o nome de um meio de cultura utilizado na manutenção de culturas bacterianas. 2. armazená-lo em lugar seco. Por que o tempo de esterilização é maior em estufa a 180ºC do que em autoclave a 121ºC? 19 . Esterilizar este material em estufa a 180o C por 1 hora ou em autoclave a 121o C por 15 minutos (neste caso.D. o material deverá ser seco em estufa antes de ser utilizado). 3. 4. Após esterilização. como os meios de cultura são classificados? 2. 3.

Com auxílio de luvas de cano longo retirar da câmara o material esterilizado. A figura II – OBJETIVOS Demonstrar o funcionamento de uma autoclave vertical elétrica e manual. Abrir cuidadosamente a tampa da autoclave. através de calor úmido (vapor d’ água). 9. abrir a válvula (situada na tampa) para que haja saída total do vapor. 5. respectivamente).Autoclave vertical. a. b. Adicionar água limpa e em quantidade suficiente à autoclave. Fechar a autoclave através de suas presilhas de segurança. Funciona sob altas pressões e temperaturas.PROCEDIMENTO 1. 3. de acordo com as normas de segurança. desligar o equipamento. Observar o manômetro/termômetro e aguardar até atingir a pressão e a temperatura desejadas (geralmente: 1 atm e 121ºC. levantar a tampa. como meios de cultura e instrumentação cirúrgica. exigindo muito cuidado e atenção durante sua operação. 2. Ligar a autoclave. a. Figura 8 . 13. 11. Assim que o vapor começar a sair pela mangueira. 10. 7. cesto. Aguardar que a temperatura decaia para 100º C (ou menor). 12. Abrir todas as presilhas de segurança e finalmente. reduzir a velocidade de aquecimento e marcar o tempo de esterilização (geralmente. 14. Após o tempo de esterilização. resistência para aquecimento da água e geração de vapor 20 . 15 minutos). fechar a válvula. indicando que o ar quente foi expulso e a câmara está saturada de vapor. Atenção!!! Não deixar que haja oscilação da pressão e temperatura! Posicionar o contra-peso (situado na tampa da autoclave) para frente para diminuir a pressão ou para trás para aumentar a pressão. deixando o botão de controle de velocidade de aquecimento no máximo.ESTERILIZAÇÃO DE MATERIAIS EM AUTOCLAVE I – INTRODUÇÃO A autoclave é um equipamento bastante empregado na esterilização de materiais. III . 4. Assim que se atingirem pressão e temperatura desejadas. Colocar o cesto contendo o material a ser autoclavado (distribuir adequadamente os recipientes de maneira a permitir que o vapor permeie todos eles). b. 8. Com auxílio de luvas de cano longo. Deixar a válvula (situada na tampa da autoclave) aberta até perceber a saída de vapor condensado. 6.

(Atenção! Realizar esta etapa de distribuição dos meios de cultura na “zona de segurança” da chama do bico de Bunsen para evitar contaminação). nariz e. 3.ESTUDO DA CONTAMINAÇÃO AMBIENTAL E DA MICROBIOTA HUMANA 1 . elevador. aspectos. Incubar as placas a 35º C por 48 horas. rampa. superfície das mãos. Verter o meio de cultura “ágar de contagem padrão” ou ágar triptona de soja previamente fundido em banho-maria em placas de Petri estéreis. Com auxílio de um swab. Observar a presença de diferentes colônias na superfície dos meios de cultura. Aguardar a solidificação dos meios de cultura nas placas. língua. III – INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS 1. realizar algumas das seguintes opções: Friccionar um swab previamente umedecido em solução salina estéril na bancada e. 2 . unhas sobre os meios de cultura. saguão. região inferior da unha. gram) das colônias submetidas à coloração. 4. com diferentes tamanhos. Soprar.OBJETIVOS 1. 4. 3. em seguida. em seguida. Expor uma placa com o meio de cultura solidificado em um local de sua preferência (laboratório. Com as placas restantes. espalhá-lo na superfície do ágar (cuidado para não romper o ágar!). 5. Descrever as características (morfologia. Tocar suavemente a extremidade dos dedos na superfície dos meios de cultura. Aplicar as técnicas de manobras assépticas. IV – Questões para fixação de conhecimento 1. tossir ou espirrar sobre a superfície dos meios. 2. espalhá-lo na superfície dos meios de cultura. 2. Qual técnica pode ser empregada para se estimar o grau de contaminação microbiana presente em um ambiente? Como esta técnica é denominada? Quais suas vantagens e limitações? 21 . superfícies e ar. etc) durante 15 minutos. Expor as placas abertas ao fluxo de saída de ar de um aparelho de ar-condicionado por alguns segundos. cor. ouvido. Quais os cuidados que devem ser observados durante a distribuição de meio de cultura estéril nas placas de Petri? 2. Verificar a presença de microrganismos em partes do corpo humano. Selecionar algumas colônias para serem submetidas à coloração de Gram. Fazer o mesmo em outro tipo de superfície. Depositar alguns fios de cabelo. arranjo. retirar material de partes do corpo humano: saliva.PROCEDIMENTOS 1. 2. Observar os diferentes tipos de bactérias e fungos.

22 . Sistemas que analisam menos de 40 amostras por mês: Apenas uma amostra poderá apresentar mensalmente resultado positivo em 100mL. NOTAS: (1) Valor Máximo Permitido. (2) água para consumo humano em toda e qualquer situação. A água potável deve estar em conformidade com o padrão microbiológico estabelecido pela Portaria nº518. apresentado na Tabela abaixo: Padrão microbiológico de potabilidade da água para consumo humano PARÂMETRO Água para consumo humano (2) (3) VMP (1) Escherichia coli ou coliformes termotolerantes Água na saída do tratamento Coliformes totais Ausência em 100mL Ausência em 100mL Água tratada no sistema de distribuição (reservatórios e rede) Escherichia coli ou coliformes termotolerantes Coliformes totais (3) Ausência em 100mL Sistemas que analisam 40 ou mais amostras por mês: Ausência em 100mL em 95% das amostras examinadas no mês. III . (3) a detecção de Escherichia coli deve ser preferencialmente adotada. químicos e radioativos atendam ao padrão de potabilidade e que não ofereça riscos à saúde (BRASIL. do Ministério da Saúde (BRASIL. de 25 de março de 2004. autoclaváveis ou pré-esterilizados. incluindo fontes individuais como poços.ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DE ÁGUA ONT I – INTRODUÇÃO Entende-se por água potável a água para consumo humano cujos parâmetros microbiológicos. 2004). de material aprovado para contato com água destinada ao consumo humano e. comercialmente disponíveis. nascentes.PROCEDIMENTOS a) Seleção e preparação dos frascos para coleta das amostras de água Utilizar frascos com tampas à prova de vazamentos. II – OBJETIVOS Avaliar a qualidade microbiológica de amostras de água de abastecimento e de água mineral. de preferência. físicos. Podem-se também empregar recipientes descartáveis (sacos plásticos) previamente esterilizados. dentre outras. minas. 2004).

preferencialmente. lacrada. c) Métodos de análise de água I. b) Abertura das embalagens e tomada da unidade analítica: antes de abrir as embalagens deve-se desinfetar a área externa com etanol 70%. A abertura e a retirada da unidade analítica devem ser feitas. flambar.1 mL de solução de tiossulfato de sódio a 1.Água mineral engarrafada: deve ser coletada na embalagem original.plaqueamento em profundidade (“pour plate”) Também conhecida como contagem padrão em placas. é um procedimento que objetiva estimar o número de bactérias heterotróficas na água. abrir o lacre com uma faca ou tesoura estéril ou flambada. numa superfície plana.Procedimento para coleta: . Inoculação: através de pipeta estéril. Havendo necessidade de coletar volumes menores. etc) devem ser previamente esterilizados em autoclave ou estufa de esterilização ou mergulhados em etanol 70% e flambados no momento do uso. Após a solidificação. Incubação: aguardar a completa solidificação do meio de cultura. deve-se trabalhar na região próxima à chama do bico de Bunsen de tamanho médio. deixar a água fluir por 2 a 3 minutos. pinças. em movimentos na forma de oito ou em movimentos circulares. chama azulada. Amostras de água clorada devem ter o cloro totalmente neutralizado imediatamente após a coleta. no caso de águas tratadas. Se a quantidade de amostra encaminhada para análise for menor do que a unidade analítica requerida. Desprezar o volume inicial e coletar a amostra em um frasco estéril. Adição do meio de cultura: verter nas placas inoculadas. reservando a outra metade como contra-amostra. 3. inverter as placas e incubar a 35o C por 48 horas. com as portas e janelas do laboratório fechadas. invertendo a embalagem várias vezes. para remoção dos contaminantes presentes. desinfetar o bocal com etanol 70% e. para prevenir qualquer contaminação da amostra. distribuindo as placas numa superfície plana. Misturar o inóculo com o meio de cultura movimentando suavemente as placas. para evitar correntes de ar. 1. deve-se homogeneizar todo o conteúdo. 8 a 10 vezes no sentido horário e 8 a 10 vezes no sentido anti-horário. 15 a 20 mL de ágar padrão para contagem (PCA). Contagem de heterotróficos. deve-se submeter metade à análise. a partir de embalagens de maior capacidade. antes da esterilização. 23 . . previamente fundido e resfriado a 45o C.assepticamente. facas. espátulas. ou a eficiência das diversas etapas de tratamento. Para tal. Se não houver fluxo laminar. 0. se o material for resistente ao calor. permitindo ainda verificar as condições higiênicas em diferentes pontos da rede de distribuição. particularmente como uma ferramenta para acompanhar variações nas condições de processo. adicionar ao frasco de coleta. no interior de câmaras de fluxo laminar. 2.Água de torneira ou tubulações: limpar a área externa da saída com etanol 70%.8% para cada 100 mL de água que se pretende coletar. adicionar 1 mL e 0.1 mL da amostra de água em placas de Petri vazias estéreis. Todos os instrumentos e utensílios empregados na abertura das embalagens e retirada das unidades analíticas (tesouras. no caso das águas minerais.

como também diversos gêneros e espécies não entéricas. passar aos itens subseqüentes. do que a quantificação de coliformes fecais ou de E. aeróbias ou anaeróbias facultativas. sabe-se. Esta definição objetivou. UFC/mL = No de colônias/diluição II.2. passando para os itens subseqüentes. Escherichia. II. Usar notação exponencial e apenas uma casa decimal depois da vírgula. Em caso positivo. selecionar apenas os coliformes originários do trato intestinal. dada a alta incidência de E.5o C. Atualmente. Incubar os tubos a 35o C/24h e observar se há crescimento (turvação) com produção de gás. Grupo dos coliformes termotolerantes: a definição é a mesma dos coliformes totais. coli. adicionar 5 porções de 10 mL em 5 tubos contendo 10 mL de caldo lauril sulfato triptose (LST) em concentração dupla com tubo de Durhan. entretanto que o grupo dos coliformes fecais inclui pelo menos três gêneros. II. Número Mais Provável de Coliformes Totais e Termotolerantes – Técnica dos Tubos Múltiplos Introdução Grupo dos coliformes totais: este grupo inclui as bactérias na forma de bastonetes Gram negativos. Enterobacter e Klebsiella. dentre os quais encontram-se tanto bactérias do trato intestinal de humanos e de outros animais de sangue quente. Por este motivo. coli. reincubar até completar 48 horas e repetir a leitura. Com uma pipeta de 10 mL estéril. coli no grupo fecal. a presença de coliformes fecais em água e alimentos é menos representativa. como indicação de contaminação fecal. 2. em princípio.Contagem as colônias e cálculo dos resultados: selecionar as placas com 30 a 300 colônias e contar as colônias com o auxílio de uma lupa. na apresentação dos resultados. não esporogênicos. indica ausência de coliformes (totais ou fecais) nos 50 mL de amostra. restringindo-se aos membros capazes de fermentar a lactose com produção de gás. Incubar os tubos a 35 oc por 24 a 48 h e observar se há crescimento com produção de gás. Anotar o número de tubos de VB com gás e determinar o Número Mais Provável (NMP) de coliformes totais/50mL em tabela de NMP apropriada às diluições inoculadas (Tabela 1). 2. A partir de cada tubo positivo no item anterior. em caso de crescimento com produção de gás. como Serratia e Aeromonas. confirmativo de coliformes totais. transferir uma alçada bem carregada de cultura para tubos de caldo Verde brilhante (VB). 24 . Por essa razão. sua quantificação em água e alimentos é menos representativa. Em caso negativo. capazes de fermentar a lactose com produção de gás em 24 a 48 horas a 35o C. em 24 horas a 45. em um contador de colônias. A não ocorrência gás após 48 h. porém muito mais significativa do que a presença de coliformes totais. Teste presuntivo: 1. dos quais dois (Enterobacter e Klebsiella) incluem cepas de origem não fecal.1. Confirmação de coliformes totais: 1. porém. como indicação de contaminação fecal do que a enumeração direta de E. Calcular o UFC por mL da amostra multiplicando o número de colônias pelo inverso da diluição inoculada. O grupo inclui cerca de 20 componentes.

confirmativo de coliformes termotolerantes.2 2. II. seguido de incubação a 35-37ºC por 48 horas. Explique como os microrganismos coliformes são classificados em nível laboratorial.1mL de água mineral foi inoculada. A não ocorrência de gás após 24 h indica ausência de coliformes termotolerantes na amostra. Anotar o número de tubos de EC com gás e determinar o NMP de coliformes fecais/50mL em uma tabela de NMP apropriada às diluições inoculadas (Tabela1). 2. através da técnica de semeadura em profundidade (pour plate) em ágar padrão para contagem (PCA). Incubar os tubos a 45. (2005) NMP/50mL < 2. Expresse os resultados em NMP de coliformes/100mL de amostra. 2. encontraram-se: a) 4 tubos de caldo verde brilhante turvos e com gás b) 3 tubos de tubos de caldo EC turvos e com gás. para diversas combinações de tubos positivos e negativos na inoculação de 5 alíquotas de 10 g ou 10 mL da amostra por tubo. Confirmação de coliformes termotolerantes: 1. Em uma análise de coliformes em água pela técnica do Número Mais Provável.3.4 7.5o C por 24 h e observar se há crescimento com produção de gás. A partir de cada tubo positivo de LST (item II. Os procedimentos para coleta de amostras de água mineral e de água de torneira ou de tubulações são exatamente os mesmos? Por quê? 3. 3. Expresse o resultado em UFC de heteroróficos por mL de água analisada. Uma alíquota de 0. 4. IVIIV .2 IV – Questões para fixação de conhecimento 1.nível de 95% de probabilidade.2 4. A não ocorrência de gás após 48 h de incubação indica ausência de coliformes totais na amostra. Número de tubos positivos 1 2 3 4 5 Fonte: SILVA et al.1) transferir uma alçada bem carregada da cultura para tubos de caldo EC. empregando-se 5 tubos. As contagens de UFC em cada uma das placas foram: 68 e 77.3. Número Mais Provável (NMP) .V NAÇÃO 25 . 5.2 10. em duplicata.

Juma vez que a maioria dos não coliformes não conta com estas enzimas. Interpretação dos resultados . Amarelo: teste positivo para presença de coliformes totais. AMBIENTAL 26 . Os poucos não coliformes que têm estas enzimas são seletivamente suprimidos pela matriz especificamente formulada do Colilert. coli utiliza ßglucuronidase para metabolizar MUG e criar fluorescência. Basta adicionar o reagente à amostra de água e incubar a 3537ºC por 18 a 48h (até 24h para COLILERT – da IDEXX e até 48 h para COLITEST – LKP Diagnósticos).DETECÇÃO DE COLIFORMES EM ÁGUA – MÉTODO CROMOGÊNICO ONT ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DE ÁGUA Essa metodologia emprega substratos cromogênicos e fluorogênicos para detecção simultânea de coliformes totais e de Escherichia coli. eles não podem se reproduzir e interferir. eles utilizam ß-galactosidase para metabolizar o indicador de nutriente ONPG e alterá-lo de incolor para amarelo. coli. Amarelo/Fluorescência azul: teste positivo para presença de E.COLILERT Incolor: frasco com 100 mL de amostra de água. À medida que os coliformes se reproduzem no Colilert. abordagem diminui a incidência de falso-positivos e falso-negativos. E.

Passos para uso do COLITEST: 1) Coletar a amostra de água até a marca de 100mL 2) Adicionar o meio de cultura COLItest. incubando-o a 37ºC por 18-48h 3) Interpretação dos resultados: 27 .

. F. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan. São Paulo. C. SILVEIRA. e atual São Paulo. 2007. rev. Manual de métodos de análise microbiológica de alimentos. A. N. bacterias e fungos .. JUNQUEIRA. 2000.. V. B. 536 p VERMELHO. Manual de métodos de análise microbiológica da água. SILVEIRA. SOARES. F.REFERÊNCIAS RIBEIRO. 2006. SILVA. 3. A. R. SP: Livraria Varela. 2005. C.. da. M. M. A. A. N. Microbiologia pratica: roteiro e manual. R. Práticas de microbiologia. N. SILVA. 239 p. JUNQUEIRA. SP: Atheneu. M. 28 . V. N. 112p. ed. 164 p. C. CANTÚSIO NETO. da. A. S. São Paulo: Varela.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful