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apostila microbiologia primeiro semestre BIOLOGIA 2011

apostila microbiologia primeiro semestre BIOLOGIA 2011

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Aulas Práticas do Laboratório de Microbiologia

2011

HAMILTON R. F. BAVUTTI MARCOS LUENGO BLANCO MARIA RAQUEL MANHANI

BIOSSEGURANÇA EM LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA
1. O trabalho no laboratório de microbiologia exige, obrigatoriamente, o uso de epi: avental de mangas longas, com elástico nas mangas, fechado; óculos; touca; máscara facial; luvas; sapatos fechados ou pró-pés; 2. Evitar o uso de lentes de contato (preferir óculos) e maquiagem; 3. Não fumar, não comer, não beber; evitar tocar a boca e outras mucosas ou pele; 4. Não deixar cadernos, canetas, livros, bolsas, sacolas, dentre outros na bancada de trabalho – eles devem ser colocados em locais onde não haja risco de contaminação; 5. Cuidado com a chama do bico de Bunsen (figura 1), que deverá estar acesa durante a maior parte do tempo; 6. Desinfetar a bancada no começo e no fim do trabalho com solução de álcool 70% ou outra similar (cuidado! Verifique se o bico de Bunsen não está aceso!!!); 7. Ler atentamente o protocolo da aula prática e não iniciar o trabalho antes de ter certeza sobre o que fazer, a cada passo; 8. Antes de iniciar o trabalho assegure-se de que tem, à mão, todo o material necessário – não pegar mais material que o necessário nem material indevido; 9. Todo o material deve ser devidamente identificado; 10. Utilizar corretamente as técnicas de manuseio de culturas microbianas: 11. Não falar durante o manuseio das culturas, para minimizar o risco de contaminação das mesmas; 12. Relatar imediatamente, ao professor ou técnico, qualquer evento, acidente ou imprevisto; 13. Quando terminar de trabalhar com culturas, retirar as luvas e descartá-las em lixo infectante, lavar as mãos com sabonete antisséptico ou similar; deixar secar ao ar; 14. Guardar todo material usado no local apropriado e deixar as bancadas em ordem ao fim do trabalho; 15. O lixo deverá ser adequadamente acondicionado e todo material contaminado deve ser autoclavado para descontaminação antes de ser descartado ou reutilizado; 16. Retirar todos os EPIs (avental, luvas, óculos de segurança) quando sair do laboratório; 17. Depois de usar o microscópio, desligar a luz e limpar a objetiva com lenço de papel fino embebido em solução apropriada para limpeza das lentes, para retirar o óleo de imersão. Várias precauções devem ser obrigatoriamente tomadas durante os procedimentos no laboratório de Microbiologia para evitar a contaminação das pessoas, do ambiente e das culturas: Qualquer procedimento só deve se iniciar depois que todos os objetos necessários estejam o mais próximo possível do operador e deve ser realizado o mais rapidamente possível; Os frascos que precisam ser abertos devem ser fechados o mais rapidamente possível; o trabalho deve ser feito ao redor do bico de Bunsen e não são admitidas correntes de ar;

Figura 1 – Bico de Bunsen

2

Quando você flamba o tubo. Os tampões de algodão ou roscas dos frascos não podem ser largados nem colocados sobre nenhuma superfície. Esfriar a alça no ar. Flambagem de alças e agulhas de platina ou de níquel-cromo  alça de níquel-cromo: Segura-se a alça perto de sua parte superior. Usar imediatamente. sem colocá-la em nenhum local (para que ela não se contamine outra vez). 3 . como se faz com um lápis (dedo polegar. eles devem ser mantidos abertos ao redor do bico de Bunsen. mantendo-a na mão. 1. devem permanecer na mão do operador. Re-esterilizar a alça imediatamente após o uso. podendo ser usadas em "Flambagem": aquecimento gradual da ponta da alça. panos. por exemplo. na posição mais horizontal possível e deve ter sua “boca” novamente flambada antes de ser fechado. etc. Os movimentos que devem ser realizados na flambagem de alças e agulhas encontram-se na figura 2. superfície da bancada. entre o dedo mínimo e a palma da mão durante todo o procedimento Durante as manipulações. 2. Mover a alça para que toda a extensão seja aquecida adequadamente ("ao rubro"). Essa posição deixa o dedo mínimo livre para segurar os tampões dos tubos. num ângulo próximo à posição vertical.   alças calibradas: que carregam um volume conhecido do material. acima do cone azul claro. 4. paredes externas de placas ou tubos. Deve-se proceder da seguinte maneira: 1. alternativamente ela pode ser resfriada nas paredes internas de um tubo ou placa de Petri (regiões estéreis). impedindo a entrada de contaminantes. 3.essa é a região "fria" da chama. que força o ar para fora. As partes estéreis de alças ou pipetas que entrarão em contato com as culturas ou com frascos estéreis não podem ser tocadas nem entrar em contato com outras superfícies não estéreis como. o calor cria uma corrente de convexão.Todos os frascos abertos devem ter suas “bocas” flambadas imediatamente. pois depois do uso em culturas. aquecimento rápido pode produzir a liberação de pequenas gotículas e formação de aerossóis. Mover lentamente a alça para dentro da região mais quente da chama. 6. mantendo-a até que fique completamente vermelha. o determinações quantitativas. as superfícies internas estéreis das placas de Petri devem entrar em contato com o ar o menor tempo possível. 5. Posicionar a ponta da alça na região azul claro da chama . indicador e médio).

Segure a alça como se fosse um lápis. quase na vertical Posicione a ponta na região fria da chama Esfrie no ar. próximo à chama Aqueça gradualmente toda a extensão "ao rubro" Figura 2 – Seqüência para flambagem de alça e de agulha de inoculação 2. rode o frasco e não o tampão . Segure o tubo com a mão esquerda e retire o tampão com dedo mínimo da mão direita. Flambagem de tubos e frascos Afrouxe o tampão do frasco ou tubo. o tampão fica preso na mão do operador. mantendo o seguro entre esse dedo e a palma da mão (para retirar o tampão. recolocando o tampão. para que ele saia facilmente. 4 . não se esqueça. Depois de usar. rodando o tubo e não o tampão. Feche o tubo. A seqüência de flambagem de tubos e frascos encontra-se na figura 3. dentro da chama do bico de Bunsen enquanto isso.o tampão fica fixo). Passe a boca do tubo para frente e para trás. repita a operação acima. antes de fechar.

5 . Não encostar a ponta da pipeta em regiões não estéreis dos tubos. Segurá-las pela região do bocal. como um lápis. acondicionadas em recipientes especiais ou individualmente embrulhadas devem ser manuseadas na frente do bico de Bunsen. imediatamente após o uso. para ser transportada.Remova o tampão com o dedo mínimo Segure o tampão entre o dedo e a palma da mão Passe a boca do tubo dentro da chama Recoloque o tampão. A pipeta contaminada deve ser colocada em um frasco com desinfetante. girando o tubo Figura 3 – Flambagem de tubos e frascos 3. colocando o aspirador e mantendo o dedo mínimo livre para abrir o frasco que contem o líquido a ser transferido. Manuseio de pipetas As pipetas graduadas ou de Pasteur. previamente esterilizadas. com algodão na ponta.

culturas puras de microrganismos. Desembrulhar a pipeta estéril dentro da zona de segurança. com tampão de algodão - 6 .MANOBRAS ASSÉPTICAS I . Deixar esfriar o instrumento antes de obter o inóculo. Trabalhar dentro da “zona de segurança” do bico de Bunsen*.INTRODUÇÃO As manobras assépticas são técnicas que impedem a entrada de microrganismos onde estes não são desejados. flambá-la rapidamente e mantê-la nesta região durante todo o trabalho. os recipientes (tubos de ensaio. sendo retirada e mantida segura pelo dedo mínimo da mão que detém a alça ou agulha durante a inoculação. agitação intensa. 4. * Operações com microrganismos patogênicos que podem gerar aerossóis. As técnicas referentes à manipulação de culturas envolvem basicamente: 1. II . etc) com meio de cultura devem ser abertos o mais próximo possível da chama do bico. sem que haja perigo de superaquecimento ou queimaduras. venham a contaminar materiais estéreis do laboratório como meios de cultura. centrifugação. ou antes de fechá-los. ou seja. Flambar ao rubro alça ou agulha antes e após cada inoculação. A tampa nunca deve ser colocada sobre a bancada. dentro da zona de segurança. 3. imediatamente após abri-los. preferencialmente na parte interna do recipiente que contém o meio de cultura. Também impedem que os microrganismos com que estamos trabalhando nos contaminem ou ao ambiente. como por exemplo. ainda. soluções e equipamentos ou. Os procedimentos 2 a 5 estão ilustrados na Figura 4. Flambar rapidamente a boca dos tubos contendo microrganismos ou meio estéril. Trabalhar em áreas submetidas previamente à limpeza e à desinfecção. 2. placas de Petri. 6. ou seja. garantem a boa assepsia. seguidas da abertura do frasco que contém a suspensão microbiana devem ser realizadas em cabine de segurança (capela de fluxo laminar vertical) e alças e agulhas devem ser esterilizadas em forno esterilizador (Figura 5).MATERIAL NECESSÁRIO pipetador pipetas de 1 mL e 10 mL embaladas em papel kraft ou similar estante para tubos tubos de ensaio contendo 10 mL de solução de corante (simulando meio de cultura estéril) tubos de ensaio contendo 9 mL de água (simulando diluente estéril) alça de platina ou de níquel-cromo tubos de ensaio vazios Erlenmeyer contendo 200 mL de solução de corante (simulando meio de cultura estéril). Estas impedirão que microrganismos presentes no ar ou depositados sobre as diversas superfícies com a poeira. para reduzir o número de potenciais microrganismos contaminantes. 5.

b. Descrever as principais técnicas de manobras assépticas. Parte B.Transferência de caldo estéril para tubos previamente esterilizados 1. Realizar a desinfecção da bancada de trabalho. Repetir quantas vezes julgar necessárias até o domínio da técnica. 3. tubos. usando pipeta estéril de 1 mL. Acender o bico de Bunsen (abrir primeiramente a válvula do bico de Bunsen e a seguir. 4. (Atenção! Este procedimento deve ser realizado na zona de segurança do bico de Bunsen). 7 . 2.Transferência de meio de cultura contido em Erlenmeyer para placas de Petri 1. 1 mL para tubo contendo 9 mL de água. Retirar uma pipeta de 1 mL da embalagem e acoplá-la ao pipetador. de maneira asséptica (próximo ao bico do Bunsen). este procedimento deve ser realizado na zona de segurança do bico de Bunsen). placas. realizar diluições seriadas. Desenvolver habilidade de: a. 3. c. 2. bico de Bunsen. A partir deste tubo. imediatamente após abri-los e antes de fechá-los. (Atenção! flambar rapidamente a boca dos tubos contendo a solução de corante. etc) e outros objetos de frequente manipulação (alça. A partir do tubo contendo solução de corante. Acender o bico de Bunsen (abrir primeiramente a válvula do bico de Bunsen e a seguir. Mostrar a vidraria principal (pipetas. Deste último tubo. . 3. agitando suavemente. com auxílio de pipeta de 1 ou 2 mL. Identificar e manipular corretamente a vidraria principal e outros objetos de uso mais frequente em Microbiologia.III .PROCEDIMENTOS Parte A.OBJETIVOS bico de Bunsen placas de Petri embaladas em papel Kraft ou similar 1. distribuir meios de cultura estéreis em placas de Petri previamente esterilizadas. sendo retirada e mantida segura pelo dedo mínimo da mão que detém a alça ou agulha durante a inoculação. transferir 1 mL para outro tubo contendo 9 mL de água. A tampa nunca deve ser colocada sobre a bancada. Distribuir 1 mL de solução de corante. manipular tubos contendo meios estéreis. Agitar suavemente até que o corante se distribua de maneira uniforme. Retirar as placas vazias da embalagem e mantê-las próximas ao bico de Bunsen. IV . a válvula da tubulação de gás). para outro tubo vazio. Treinamento de manobras assépticas . transferir. 2. transferir 1 mL para outro tubo contendo 9 mL de água. Realizar a desinfecção da bancada de trabalho. . a válvula da tubulação de gás).Realização de diluições seriadas 1. contida em um tubo. agulha de inoculação. etc).

4. Cite três procedimentos adotados em laboratório de microbiologia que minimizam o risco de contaminação ambiental. Transferir aproximadamente 20 mL de solução de corante contida em Erlenmeyer para cada uma das placas. Quais os principais objetivos das manobras assépticas? 2. Fonte: VERMELHO (2006) Figura 5 . Qual a diluição final obtida no procedimento de diluição seriada realizado? 8 .Esterilizador de alças e agulhas V – Questões para fixação de conhecimento 1.Manobras assépticas. do operador e do material em estudo. (Atenção! flambar rapidamente a boca do Erlenmeyer contendo a solução de corante. Figura 4 . 3. ou antes de fechá-lo. Repetir quantas vezes forem necessárias até se obter domínio da técnica. imediatamente após abri-lo.

contudo sem afetar substancialmente a idéia original. o mecanismo da coloração de Gram foi intensamente estudado. o tratamento com álcool (ou álcool-acetona) extrai os lipídeos. Dependendo do plano e do número de divisões através das quais as bactérias continuam unidas. Arranjo: grupamentos bacterianos.Aos pares: diplococos . Bacilos: células cilíndricas.Tétrades Divisão em três planos: . ocasionalmente.Feixes cúbicos: sarcina . Espirilos: células espiraladas. Surgiram muitas modificações. Ele adicionou a este procedimento um contra-corante (safranina. a partir daí. Forma: as bactérias podem ser classificadas quanto à forma em três grupos básicos:    Cocos: células esféricas.Bacilos e Espirilos: Apresentam-se. em geral.Cocos: Divisão em um plano: .8 m até 10 por 25 m. Assim. Sendo assim.De forma não organizada: cocos em cachos (estafilococos) . ao corar cortes histológicos com violeta de genciana. as quais são células flexíveis que se movimentam por rotação e flexão. que podem ser denominados víbrios. podem aparecer os seguintes arranjos: . Algumas células comportam-se como bacilos curvos. o médico dinamarquês Christian Gram descobriu. uma fina camada de peptideoglicano sobre a qual encontra-se uma camada constituída de lipoproteínas. Durante o processo de coloração de Gram. precisando de um microscópio óptico comum. se previamente tratadas com solução de iodo. uma nova metodologia de coloração diferencial. o complexo cristal 9 .Em cadeias: estreptococos Divisão em dois planos: . medindo desde 0. como células isoladas. não é possível visualizá-las a olho nu. existem as espiroquetas. e as Gram-negativas. fucsina básica) e estabeleceu. Coloração de Gram Em 1884. através do método de Ehrlich (1882). Entre as bactérias espiraladas. em forma de bastonetes. pode-se observar: bacilos aos pares (diplobacilos) ou em cadeias (estreptobacilos).COLORAÇÃO DE GRAM E MORFOLOGIA BACTERIANA I . sendo que as Gram-positivas possuem várias camadas de peptideoglicano e ácidos teicóicos. Ao longo desses anos. O mecanismo da coloração de Gram refere-se à composição da parede celular. porém.3 por 0. que bactérias que eles continham não eram descoradas pelo álcool. fosfolipídeos e lipopolissacarídeos. daí resultando uma porosidade ou permeabilidade aumentada da parede celular das bactérias Gram-negativas.INTRODUÇÃO As células bacterianas são caracterizadas quanto aos seguintes aspectos: Tamanho: as bactérias são microscópicas. empiricamente.

A reação de Gram é extremamente dependente do estado fisiológico da célula. o complexo CV-I é retido na parede após tratamento pelo álcool-acetona. possibilitando a extração do complexo CV-I. que I no interior da célula. que permanece violeta permanece violeta parede Extração dos lipídeos da da parede celular. o complexo iodo-cristal violeta poderá ser retirado da célula. as bactérias Gramnegativas.Formação do complexo CVI no interior da célula. em pontos de aderência entre a membrana externa e a membrana celular.violeta-iodo (CV-I) pode ser retirado e as bactérias Gram-negativas são descoradas.OBJETIVOS Executar a técnica de coloração de Gram. Os poros da parede das bactérias Gram-negativas permanecem suficientemente grandes. classificar as bactérias de acordo com a coloração de Gram. relacionar a composição da parede celular das bactérias com os corantes de Gram. pela perda da capacidade de retenção do corante. uma diminuição do diâmetro dos poros da camada de peptideoglicano da parede celular. verificar a importância de realizar a coloração de Gram a partir de um material clínico. devido à pequena espessura da camada basal e às descontinuidades existentes nesta camada. excretadas normalmente por culturas envelhecidas. A célula adquire o corante. Enzimas líticas.o complexo CV-I é removido da célula pode que permanece 4 – Fucsina ou safranina A célula não é afetada. A parede celular das bactérias Gram-positivas. têm o complexo corado extraído pelo álcool. 10 . citar as formas das bactérias e descrever seus arranjos. II . o que causa. podem causar danos à parede celular. porosidade CV-I célula. violeta não da e diminuição permeabilidade. provavelmente. alterando a permeabilidade aos solventes (álcool-acetona). mesmo após tratamento com álcool-acetona. torna-se desidratada durante o tratamento com álcool. Etapas da coloração de Gram e aspectos das células gram-positivas e gram-negativas Soluções e ordem de aplicação 1 – Cristal violeta 2 – Solução de lugol Reação e aspecto das bactérias Gram-positivas Coradas em violeta Gram-negativas Coradas em violeta Formação do complexo CV. De acordo com Trabulsi (2008). Nas bactérias Gram-positivas. em virtude de sua composição diferente. Outra explicação baseia-se também em diferenças de permeabilidade entre os dois grupos de bactérias. sair da o complexo 3 – Álcool-acetona Desidratação celular. aumento da da porosidade. que deixa as células descoradas. a porosidade diminui. na etapa diferencial com álcool-acetona. permanecendo violeta tornando-se vermelha. Conseqüentemente. como por exemplo. a permeabilidade é reduzida e o complexo CV-I não pode ser extraído. As culturas velhas de Gram-positivas podem se apresentar com Gram variável. As culturas jovens respondem melhor à diferenciação tintorial.

6. 2. 3. Flambar novamente a alça. passando duas ou três vezes a lâmina na chama do bico de Bunsen. 4. 3.             Cristal violeta para Gram Solução de Lugol Solução de fucsina ou de safranina para Gram Solução de álcool-acetona Solução salina fisiológica Microscópio óptico Bico de Bunsen Alça e agulha de inoculação Pinça Lâminas para microscopia Lenços de papel absorvente Óleo de imersão IV – MÉTODO As etapas da preparação do esfregaço a partir de meios líquido e sólido encontram-se na figura 6. Flambar a alça e deixar o esfregaço secar à temperatura ambiente. 5. realizar a fixação. Staphylococcus aureus. Proteus mirabilis. b) Técnica de coloração de Gram 1. Esperar a lâmina esfriar e realizar a coloração. Flambar a alça. aguardar um minuto e desprezar o corante na pia.III – MATERIAL . 4. etc) mantidas em meio de cultura líquido ou em meio sólido. colocar duas alíquotas de cultura bacteriana preparada no meio líquido sobre a superfície de uma lâmina de microscopia. Em seguida. Esperar a lâmina esfriar e realizar a coloração. 5. 2. 11 . passando duas ou três vezes a lâmina na chama do bico de Bunsen. Espalhar sobre a lâmina. Cobrir todo o esfregaço com solução de cristal violeta. com auxílio de uma alça de platina. Deixar o esfregaço secar à temperatura ambiente. realizar a fixação.Culturas de microrganismos (Escherichia coli. A partir de meio sólido: 1. Com auxílio de uma alça de platina (ou de níquel-cromo) estéril. Em seguida. a) Preparação de esfregaço de microrganismos A partir de meio líquido: 1. fazendo movimentos circulares de dentro para fora. Colocar uma pequena gota de solução salina fisiológica na superfície de uma lâmina. esfriá-la e coletar o inóculo bacteriano. fazendo uma suspensão homogênea.

3.Seqüência de preparação de esfregaço.2. Cobrir todo o esfregaço com solução de lugol. Desenhar as estruturas e arranjos observados. com objetiva de imersão. 6. Inclinar a lâmina e gotejar solução álcool-acetona até que não haja desprendimento de corante (cerca de 30 segundos). Figura 6 . aguardar um minuto e 30 segundos e desprezar o corante na pia. Lavar a lâmina rapidamente em água corrente. Lavar a lâmina e secá-la ao ar (sem esfregá-la). 5. Explique como pode ser realizada a fixação do esfregaço. 4. 12 . Cobrir o esfregaço com fucsina (ou safranina) e aguardar 30 segundos. Fonte: VERMELHO (2006) V – Questões para fixação de conhecimento 1. Observar ao microscópio.

Descreva a função de cada substância empregada na coloração de Gram. As células bacterianas gram-negativas submetidas à coloração de Gram. 4. na qual o operador deixou de realizar a etapa de lavagem com álcool-acetona terão que aspecto ao microscópio? Explique. 13 .2. Qual a importância de se realizar a fixação? 3.

tamanho. no interior de uma célula bacteriana. localizados no corpo da célula vegetativa em posição central. Neste método. que lhes permite sobreviver em circunstâncias precárias. A desidratação gera uma estrutura muito densa e altamente refrátil (refringente). Mas esta não é a única propriedade associada ao fenômeno. uma preparação a fresco de bactérias esporuladas pode ser rápida e satisfatoriamente observada através de um microscópio ótico de contraste de fase. Existem esporos ovais e esféricos. pois estes detalhes não são muito repetidos nas várias espécies. É indiscutível que a esporulação é um dos mais importantes eventos da fisiologia celular bacteriana. é reflexo da característica particular de seu envoltório. Uma vez formado. substância ausente na estrutura de células vegetativas. respectivamente. que vão de valores que permitem a inclusão do esporo no corpo celular até dimensões maiores. Isto. Quando colocado em um meio de cultivo adequado. o ácido dipicolínico encontra-se na forma de sal – dipicolinato de cálcio. O esporo também é chamado de endósporo e difere química e fisiologicamente da célula que o originou. As técnicas de coloração usuais são ineficientes e o esporo se mostra impenetrável a corantes comuns. dificultando (e até mesmo impedindo) a ação de desinfetantes comuns sobre a estrutura queratinóide destas capas. tais como cristal violeta. Normalmente. Do ponto de vista morfológico (forma. subterminal ou terminal. desidratada é aquecida em um meio aquoso. Elas manifestam grande resistência ao calor. 14 . Tal fenômeno também se verifica quando uma célula vegetativa. dessecação. alterações químicas e radiações. indubitavelmente. dependendo das condições de cultivo. Um dos métodos mais empregados para a coloração de esporos é o de WIRTZ (1908). o qual emprega o verde malaquita e safranina. Este fenômeno biológico é entendido como a formação de uma nova célula – o esporo. está protegido por uma dupla camada oriunda da invaginação da própria membrana interna da forma vegetativa. cromossomo. Algumas células desenvolvem um mecanismo de ordem genética. Tais propriedades estão associadas em parte à desidratação progressiva por que passa o citoplasma celular. Por esta razão. A membrana do esporo apresenta em sua composição o ácido dipicolínico. o esporo pode permanecer estável por muitos anos. pode até ser ativado e dar origem a uma célula vegetativa capaz de se multiplicar. sem uma fonte externa de nutrientes. A esporulação é um processo demorado. mostrando um aumento de resistência ao calor. O contra-corante safranina é aplicado com a finalidade de diferenciar as células vegetativas dos esporos. localização intracelular) os esporos desempenham importante papel na sistemática bacteriana. e com dimensões variadas. devido à grande quantidade de cátions Ca 2+ na célula. como corante e contra-corante. causando deformações nas células. azul de metileno. o qual pode levar horas para se completar. o calor é usado para facilitar a penetração do corante verde-malaquita através da parede do esporo.COLORAÇÃO DE ESPOROS BACTERIANOS – MÉTODOD DE WIRTZ I – INTRODUÇÃO Uma característica importante. tanto morfológica quanto fisiológica de um grande número de bactérias Gram positivas pertencentes aos gêneros Bacillus e Clostridium é a esporulação. congelamento. O material genético.

preparar um esfregaço fino a partir de cultura de Bacillus subtilis mantida há vários dias em meio sólido (por exemplo: ágar triptona-soja). com uma solução aquosa de safranina a 1%. Deixar secar. 8. subterminal ou terminal V – Questões para fixação de conhecimento 1.  Aspecto do bacilo: normal ou dilatado  Forma do endósporo: oval ou esférico  Localização do endósporo: central. Deixar secar ao ar naturalmente. Cobrir o esfregaço com uma solução aquosa de verde malaquita a 5% e aquecer até desprendimento de vapores durante 5 minutos sobre a chama do bico de Bunsen (ou em banho-maria a 100o C por 5 a 10 minutos). por 30 segundos. 9. Observar ao microscópio ótico com a objetiva de 100 X (imersão). dimensão.INTERPRETAÇÃO  Células vegetativas: cor vermelha  Endosporo: cor verde  Bactérias não esporuladas: cor vermelha  Esporos bacterianos livres: cor verde Anotar os resultados.II – OJBJETIVOS Executar uma técnica de coloração específica para a visualização de esporos bacterianos. III . acrescentando mais corante. 3. Lavar em água corrente. 11. 7. dimensão e localização intracelular do esporo. Por que o esfregaço e a solução de corante verde-malaquita devem ser aquecidos? 4. Deixar esfriar. Se a coloração de Wirtz tivesse sido aplicada a um esfregaço proveniente de células de Bacillus subtilis reativadas há 24 horas sob condições ideais de cultivo. Deixar esfriar. Lavar em água corrente. 6. 4. que estruturas seriam observadas na lâmina após a coloração? 15 . Identificar através da coloração. forma e localização celular de esporos em bactérias. em relação à forma. Não deixar a preparação secar.PROCEDIMENTO 1. Fixar sobre a chama do bico de Bunsen (3 a 4 vezes). 5. Corar rapidamente. IV . 10. 2. Explique o que ocorre com as células de Bacillus subtilis quando estas são deixadas por vários dias em meio de cultura. 2. Em uma lâmina limpa. a presença. Quais gêneros bacterianos são capazes de formar esporos? 3.

água peptonada tamponada. Além dos nutrientes é preciso fornecer condições ambientais favoráveis ao desenvolvimento dos microrganismos. adicionado de sangue e aquecido a 80°C). Especiais quando cumprem com as exigências vitais de determinados microrganismos. amido de tubérculos. Tendo em vista a ampla diversidade metabólica dos microrganismos. O ágar é um polímero . os quais permitiram o estudo de espécies isoladas (culturas puras). separando-as de espécies contaminantes. os meios líquidos. energia. repiques de microrganismos. atmosfera (aeróbia.) de animais (carne. Triptose Sulfito Ciclosserina (TSC) . a maioria das bactérias não metaboliza o ágar. fígado. cuja função é solidificar os meios de cultura. principalmente ágar entre 1 e 2%. quando emprega ingredientes com composição química não definida. Os meios de cultura são classificados quanto ao estado físico em sólidos. em fontes de carbono. quando Robert Koch e sua equipe introduziram os meios de cultura sólidos. dentre outros. principalmente do gênero Gellidum. contudo. De acordo com a finalidade bacteriológica ou micológica. dando uma consistência intermediária. Baird-Parker (com gema de ovo) (meios ricos ou meios enriquecidos com as substâncias citadas). tomate. caldo lactosado (isolamento de Salmonella sp em alimentos). para amostras que sofreram algum tipo de tratamento (térmico ou químico). extraído de várias espécies de algas.) e de microrganismos (levedura) e artificiais. quando contêm agentes solidificantes. Básicos são aqueles que permitem o crescimento bacteriano sem satisfazer. meios Shahidi Ferguson Perfringens (SFP). etc.para anaeróbios). Ex. etc. temperatura. não contêm agentes solidificantes. etc. ágar sangue. peptona de soja. sintéticos ou ainda quimicamente definidos quando a composição química é conhecida (usados para trabalhos de pesquisa) e seus componentes servem para suprir as exigências nutritivas dos microrganismos. ou seja. caldo e ágar simples). apresentando-se como um caldo.075 a 0. nitrogênio. nenhuma exigência em especial (Ex. Os meios semi-sólidos contêm de 0. Os meios de cultura podem ainda ser classificados quanto à procedência dos constituintes em naturais ou complexos. de modo a permitir o crescimento de microrganismos em tensões variadas de oxigênio ou a verificação da motilidade e também para conservação de culturas. ágar chocolate (ágar simples fundido. quando então são conhecidas as necessidades nutricionais específicas. tais como pH. umidade. dentre outros. utilizados para ativação das culturas.sulfato de ácido poligalacturônico. tais como extratos de vegetais (malte.INTRODUÇÃO Até cerca de 1880 os microrganismos eram cultivados em meios líquidos. Quanto à composição química podem ser simples (meios básicos) ou complexos. de ágar. Os meios de cultura consistem da associação qualitativa e quantitativa de substâncias que fornecem os nutrientes necessários ao desenvolvimento (cultivo) de microrganismos fora do seu meio natural. caseína. vitaminas. meio de carne cozida (com fragmentos de fígado . microaeróbia ou anaeróbia). cérebro. dentre outras. 16 . provas bioquímicas. os meios especiais podem ser classificados em: Meios de pré-enriquecimento são aqueles que permitem a recuperção/multiplicação de microrganismos injuriados. pressão osmótica. existem vários tipos de meios de cultura para satisfazerem as variadas exigências nutricionais.PREPARAÇÃO DE MEIOS DE CULTURA I .5 %. como meio de infusão de cérebro e coração. Geralmente. sais minerais.

além do preparo de pipetas e placas de Petri para posterior utilização. caldo nitrato. caldo ou ágar uréia. tais como meio de Eosina Azul de Metileno – EMB (diferencial para coliformes). para fungos.quando proporcionam nutrientes adequados ao crescimento de microrganismos presentes usualmente em baixos números ou de crescimento lento. meio de sulfito indol motilidade.) Identificação – utilizados na realização de provas bioquímicas e verificação de funções fisiológicas de organismos submetidos à identificação (meios Oxidação/Fermentação. permitindo diferenciar as colônias (sólidos) dos microrganismos. meios com 7. SFP. garantem a viabilidade de microrganismos (ágar Sabouraud.) Estocagem ou manutenção . etc.). ágar simples. ágar Baird-Parker. lisina – MILi. ou seja. etc). agar Baird-Parker para isolamento e diferenciação de cocos Gram positivos (sólidos). Meios de triagem . Caldo Tioglicolato para Clostridium perfringens. Esses meios têm a propriedade de estimular o crescimento de determinados microrganismos. indol.utilizados para conservação de microrganismos no laboratório. ágar batata dextrose . antibióticos e aminoácidos. ágar Salmonella-Shigella (SS) e ágar MacConkey. Dosagem .Meios de Enriquecimento . ágar triptona de soja. meio Baird-Parker. meio semi-sólido. 17 . Seletivos .PDA. Ágar MacConkey para a diferenciação de Enterobactérias.empregados nas determinações de vitaminas. caldo triptofano. Caldo Tetrationato e Selenito-Cistina para cultivo de Salmonella sp (líquidos). mas existem alguns que também podem inibir o crescimento de outros. meios com sais biliares e verde brilhante para isolamento seletivo de Salmonella. etc.5% de cloreto de sódio. A maioria deles é também diferencial. permitindo o crescimento de outros. II – OBJETIVOS Familiarizar-se com técnicas de preparação e esterilização de meios de cultura sólidos e líquidos. etc. meio com leite.meios que avaliam determinadas atividades metabólicas permitindo caracterização e identificação perfunctória ou presuntiva de muitos microrganismos (ágar tríplice açúcar e ferro. Contagem . meios com antibióticos para isolamento de diversos microrganismos (TSC. Exemplo: meios com telurito de potássio (para isolamento de Corynebacterium diphtheriae). Ágar sangue.empregados para a determinação quantitativa da população microbiana (ágar de Contagem padrão em placas – PCA. etc. de diluentes.os que contêm substâncias que inibem o desenvolvimento de determinados grupos de microrganismos. Diferenciais . bem como microrganismos exigentes e fastidiosos. Ex. ágar triptona de soja – TSA. meio motilidade.quando contêm substâncias que permitem estabelecer diferenças entre microrganismos muito parecidos. ágar citrato. ágar sangue. meio semi-sólido. meio Escola Paulista de Medicina – EPM. para isolamento de Staphylococcus aureus.

5. protegendo-os com papel manilha ou kraft. Após esterilização. 5. armazená-la em geladeira ou em lugar fresco. ao meio previamente esterilizado. Preparação de meio de cultura líquido – caldo triptona e soja 1. C. armazená-la em geladeira ou em lugar fresco. agitar até completa dissolução. através de membranas (de nitrocelulose ou acetato de celulose) com poros de 0. um béquer de vidro ou lata de alumínio). Preparação de solução fisiológica (0. Após esterilização.TSA) e adicionar 100 mL de água destilada. um béquer de vidro ou lata de alumínio). 5 mL de caldo para tubos de ensaio com tampa rosqueável (Atenção! Não fechar completamente as tampas dos tubos). Transferir. 2. Em um Erlenmeyer ou outro recipiente apropriado de 250mL. 18 . Em um béquer de 250 mL. 2. Acondicionar os tubos em um suporte adequado (por exemplo. Com auxílio de um bastão de vidro. Com auxílio de um bastão de vidro. as mesmas são esterilizadas à parte por filtração. Adicionar tampão de algodão e gaze. agitar até completa dissolução do meio e cultura.85% de NaCl) estéril 1.PROCEDIMENTOS A. Transferir.85 g de cloreto de sódio (NaCl) e adicionar 100 mL de água destilada. 3. assepticamente. até completa dissolução do meio de cultura (o meio torna-se translúcido). 5 mL de solução para tubos de ensaio com tampa rosqueável (Atenção! Não fechar completamente as tampas dos tubos). com auxílio de proveta. Acondicionar os tubos em um suporte adequado (por exemplo. B. 4. 2. Esterilizar o meio de cultura em autoclave a 121o C por 15 minutos. armazenar o meio de cultura em geladeira (ou em lugar fresco e ao abrigo da luz).III . Aquecer em banho-maria (ou em chama de bico de Bunsen). pesar quantidade necessária para o preparo 50 mL de caldo triptona e soja – TSB e adicionar 100 mL de água destilada. pesar quantidade necessária para o preparo de 100 mL de meio de cultura não seletivo (por exemplo: Ágar Padrão para Contagem – PCA ou Ágar Triptona de Soja . e depois incorporadas. com auxílio de pipeta graduada. 3. com auxílio de pipeta graduada. protegendo-os com papel manilha ou kraft. porém se for necessário utilizar algumas substâncias termolábeis (por exemplo: uréia) ou que reajam com as substâncias dos meios (aminoácidos. pesar 0. Esterilizar o meio de cultura em autoclave a 121o C por 15 minutos. 3. agitando freqüentemente com auxílio de bastão de vidro.22 m de diâmetro (Millipore. proteger o tampão com papel manilha ou Kraft (ou similar). açúcares). Sartorius). Esterilizar o meio de cultura em autoclave à temperatura de 121o C por 15 minutos. Observação: Alguns meios de cultura são preparados da mesma forma. Em um béquer de 150 mL. 4. 5. Preparação de meio de cultura sólido de uso geral 1. 4. Após a esterilização.

Cite o nome de um meio de cultura utilizado na manutenção de culturas bacterianas. Preparação de pipetas e placas de Petri para esterilização 1. embrulhar 4 placas de Petri e 5 pipetas graduadas de 2 mL em papel manilha (ou similar). 3. o material deverá ser seco em estufa antes de ser utilizado).D. Cite dois exemplos de meios de cultura que sejam simultaneamente seletivos e diferenciais. 4. como os meios de cultura são classificados? 2. 3. Esterilizar este material em estufa a 180o C por 1 hora ou em autoclave a 121o C por 15 minutos (neste caso. 2. De acordo com orientação de seu professor. De acordo com o estado físico. Após esterilização. armazená-lo em lugar seco. Por que o tempo de esterilização é maior em estufa a 180ºC do que em autoclave a 121ºC? 19 . IV – Questões para fixação de conhecimento 1.

A figura II – OBJETIVOS Demonstrar o funcionamento de uma autoclave vertical elétrica e manual. Funciona sob altas pressões e temperaturas. cesto. III . a. Adicionar água limpa e em quantidade suficiente à autoclave. 2. b.Autoclave vertical. Colocar o cesto contendo o material a ser autoclavado (distribuir adequadamente os recipientes de maneira a permitir que o vapor permeie todos eles). Abrir cuidadosamente a tampa da autoclave. resistência para aquecimento da água e geração de vapor 20 .ESTERILIZAÇÃO DE MATERIAIS EM AUTOCLAVE I – INTRODUÇÃO A autoclave é um equipamento bastante empregado na esterilização de materiais. 5. fechar a válvula. 10. Ligar a autoclave. Figura 8 . como meios de cultura e instrumentação cirúrgica. 11. levantar a tampa. 7. Deixar a válvula (situada na tampa da autoclave) aberta até perceber a saída de vapor condensado. Com auxílio de luvas de cano longo retirar da câmara o material esterilizado. 3. Fechar a autoclave através de suas presilhas de segurança. Após o tempo de esterilização. através de calor úmido (vapor d’ água). Atenção!!! Não deixar que haja oscilação da pressão e temperatura! Posicionar o contra-peso (situado na tampa da autoclave) para frente para diminuir a pressão ou para trás para aumentar a pressão. reduzir a velocidade de aquecimento e marcar o tempo de esterilização (geralmente. respectivamente). abrir a válvula (situada na tampa) para que haja saída total do vapor. 14. 8. Assim que se atingirem pressão e temperatura desejadas. 13. a. b. desligar o equipamento. 12. 15 minutos). deixando o botão de controle de velocidade de aquecimento no máximo. de acordo com as normas de segurança. 4. Observar o manômetro/termômetro e aguardar até atingir a pressão e a temperatura desejadas (geralmente: 1 atm e 121ºC. Abrir todas as presilhas de segurança e finalmente. Aguardar que a temperatura decaia para 100º C (ou menor). Com auxílio de luvas de cano longo. indicando que o ar quente foi expulso e a câmara está saturada de vapor. 6. exigindo muito cuidado e atenção durante sua operação. 9. Assim que o vapor começar a sair pela mangueira.PROCEDIMENTO 1.

espalhá-lo na superfície dos meios de cultura. nariz e. Selecionar algumas colônias para serem submetidas à coloração de Gram. língua. superfícies e ar. Aguardar a solidificação dos meios de cultura nas placas. Verter o meio de cultura “ágar de contagem padrão” ou ágar triptona de soja previamente fundido em banho-maria em placas de Petri estéreis. Com auxílio de um swab. espalhá-lo na superfície do ágar (cuidado para não romper o ágar!). tossir ou espirrar sobre a superfície dos meios. aspectos. 4. Descrever as características (morfologia. Observar a presença de diferentes colônias na superfície dos meios de cultura. elevador. Depositar alguns fios de cabelo.PROCEDIMENTOS 1. 2. 2 . 2. Aplicar as técnicas de manobras assépticas. arranjo. 2. saguão. cor. superfície das mãos. 3. realizar algumas das seguintes opções: Friccionar um swab previamente umedecido em solução salina estéril na bancada e. retirar material de partes do corpo humano: saliva. região inferior da unha. unhas sobre os meios de cultura. Quais os cuidados que devem ser observados durante a distribuição de meio de cultura estéril nas placas de Petri? 2. IV – Questões para fixação de conhecimento 1. rampa. Expor uma placa com o meio de cultura solidificado em um local de sua preferência (laboratório. gram) das colônias submetidas à coloração. Expor as placas abertas ao fluxo de saída de ar de um aparelho de ar-condicionado por alguns segundos. III – INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS 1. em seguida. Qual técnica pode ser empregada para se estimar o grau de contaminação microbiana presente em um ambiente? Como esta técnica é denominada? Quais suas vantagens e limitações? 21 . Incubar as placas a 35º C por 48 horas. em seguida. etc) durante 15 minutos. 4.ESTUDO DA CONTAMINAÇÃO AMBIENTAL E DA MICROBIOTA HUMANA 1 . (Atenção! Realizar esta etapa de distribuição dos meios de cultura na “zona de segurança” da chama do bico de Bunsen para evitar contaminação). Tocar suavemente a extremidade dos dedos na superfície dos meios de cultura. 5. com diferentes tamanhos.OBJETIVOS 1. ouvido. Com as placas restantes. Verificar a presença de microrganismos em partes do corpo humano. Fazer o mesmo em outro tipo de superfície. Soprar. Observar os diferentes tipos de bactérias e fungos. 3.

de material aprovado para contato com água destinada ao consumo humano e. NOTAS: (1) Valor Máximo Permitido. III .ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DE ÁGUA ONT I – INTRODUÇÃO Entende-se por água potável a água para consumo humano cujos parâmetros microbiológicos. químicos e radioativos atendam ao padrão de potabilidade e que não ofereça riscos à saúde (BRASIL. do Ministério da Saúde (BRASIL. autoclaváveis ou pré-esterilizados. II – OBJETIVOS Avaliar a qualidade microbiológica de amostras de água de abastecimento e de água mineral.PROCEDIMENTOS a) Seleção e preparação dos frascos para coleta das amostras de água Utilizar frascos com tampas à prova de vazamentos. Podem-se também empregar recipientes descartáveis (sacos plásticos) previamente esterilizados. comercialmente disponíveis. de 25 de março de 2004. (2) água para consumo humano em toda e qualquer situação. minas. 2004). 22 . apresentado na Tabela abaixo: Padrão microbiológico de potabilidade da água para consumo humano PARÂMETRO Água para consumo humano (2) (3) VMP (1) Escherichia coli ou coliformes termotolerantes Água na saída do tratamento Coliformes totais Ausência em 100mL Ausência em 100mL Água tratada no sistema de distribuição (reservatórios e rede) Escherichia coli ou coliformes termotolerantes Coliformes totais (3) Ausência em 100mL Sistemas que analisam 40 ou mais amostras por mês: Ausência em 100mL em 95% das amostras examinadas no mês. A água potável deve estar em conformidade com o padrão microbiológico estabelecido pela Portaria nº518. dentre outras. (3) a detecção de Escherichia coli deve ser preferencialmente adotada. físicos. de preferência. incluindo fontes individuais como poços. nascentes. 2004). Sistemas que analisam menos de 40 amostras por mês: Apenas uma amostra poderá apresentar mensalmente resultado positivo em 100mL.

Inoculação: através de pipeta estéril. Incubação: aguardar a completa solidificação do meio de cultura. chama azulada. inverter as placas e incubar a 35o C por 48 horas. 8 a 10 vezes no sentido horário e 8 a 10 vezes no sentido anti-horário. a partir de embalagens de maior capacidade. é um procedimento que objetiva estimar o número de bactérias heterotróficas na água. pinças.plaqueamento em profundidade (“pour plate”) Também conhecida como contagem padrão em placas. Amostras de água clorada devem ter o cloro totalmente neutralizado imediatamente após a coleta. Todos os instrumentos e utensílios empregados na abertura das embalagens e retirada das unidades analíticas (tesouras. Se a quantidade de amostra encaminhada para análise for menor do que a unidade analítica requerida. deve-se submeter metade à análise. no caso das águas minerais. permitindo ainda verificar as condições higiênicas em diferentes pontos da rede de distribuição. antes da esterilização. Misturar o inóculo com o meio de cultura movimentando suavemente as placas. 2. previamente fundido e resfriado a 45o C. 15 a 20 mL de ágar padrão para contagem (PCA). no caso de águas tratadas. para prevenir qualquer contaminação da amostra. flambar. Se não houver fluxo laminar. deve-se trabalhar na região próxima à chama do bico de Bunsen de tamanho médio.Água de torneira ou tubulações: limpar a área externa da saída com etanol 70%.1 mL de solução de tiossulfato de sódio a 1. abrir o lacre com uma faca ou tesoura estéril ou flambada. com as portas e janelas do laboratório fechadas. 0. Desprezar o volume inicial e coletar a amostra em um frasco estéril. Havendo necessidade de coletar volumes menores. ou a eficiência das diversas etapas de tratamento. etc) devem ser previamente esterilizados em autoclave ou estufa de esterilização ou mergulhados em etanol 70% e flambados no momento do uso. adicionar 1 mL e 0. adicionar ao frasco de coleta. Adição do meio de cultura: verter nas placas inoculadas. 1.Procedimento para coleta: . c) Métodos de análise de água I. Para tal. se o material for resistente ao calor. .1 mL da amostra de água em placas de Petri vazias estéreis. 23 . deve-se homogeneizar todo o conteúdo. Após a solidificação. para evitar correntes de ar. preferencialmente.Água mineral engarrafada: deve ser coletada na embalagem original. reservando a outra metade como contra-amostra.assepticamente. em movimentos na forma de oito ou em movimentos circulares. invertendo a embalagem várias vezes. particularmente como uma ferramenta para acompanhar variações nas condições de processo. lacrada. no interior de câmaras de fluxo laminar. 3. distribuindo as placas numa superfície plana. espátulas. deixar a água fluir por 2 a 3 minutos. facas. A abertura e a retirada da unidade analítica devem ser feitas. numa superfície plana.8% para cada 100 mL de água que se pretende coletar. b) Abertura das embalagens e tomada da unidade analítica: antes de abrir as embalagens deve-se desinfetar a área externa com etanol 70%. desinfetar o bocal com etanol 70% e. para remoção dos contaminantes presentes. Contagem de heterotróficos.

do que a quantificação de coliformes fecais ou de E. Confirmação de coliformes totais: 1. Em caso negativo. passar aos itens subseqüentes. Calcular o UFC por mL da amostra multiplicando o número de colônias pelo inverso da diluição inoculada. em caso de crescimento com produção de gás. dentre os quais encontram-se tanto bactérias do trato intestinal de humanos e de outros animais de sangue quente. porém muito mais significativa do que a presença de coliformes totais. entretanto que o grupo dos coliformes fecais inclui pelo menos três gêneros. Usar notação exponencial e apenas uma casa decimal depois da vírgula. porém.5o C. coli no grupo fecal. Esta definição objetivou. II. Atualmente. Por este motivo. sua quantificação em água e alimentos é menos representativa. O grupo inclui cerca de 20 componentes. como indicação de contaminação fecal do que a enumeração direta de E. sabe-se. em princípio. transferir uma alçada bem carregada de cultura para tubos de caldo Verde brilhante (VB). II. Teste presuntivo: 1. não esporogênicos. capazes de fermentar a lactose com produção de gás em 24 a 48 horas a 35o C. como indicação de contaminação fecal. restringindo-se aos membros capazes de fermentar a lactose com produção de gás. Escherichia. Número Mais Provável de Coliformes Totais e Termotolerantes – Técnica dos Tubos Múltiplos Introdução Grupo dos coliformes totais: este grupo inclui as bactérias na forma de bastonetes Gram negativos.2. aeróbias ou anaeróbias facultativas. Grupo dos coliformes termotolerantes: a definição é a mesma dos coliformes totais. A não ocorrência gás após 48 h. coli. indica ausência de coliformes (totais ou fecais) nos 50 mL de amostra. como também diversos gêneros e espécies não entéricas. Enterobacter e Klebsiella. 24 .Contagem as colônias e cálculo dos resultados: selecionar as placas com 30 a 300 colônias e contar as colônias com o auxílio de uma lupa. na apresentação dos resultados. dada a alta incidência de E. como Serratia e Aeromonas. selecionar apenas os coliformes originários do trato intestinal. A partir de cada tubo positivo no item anterior. dos quais dois (Enterobacter e Klebsiella) incluem cepas de origem não fecal. passando para os itens subseqüentes. adicionar 5 porções de 10 mL em 5 tubos contendo 10 mL de caldo lauril sulfato triptose (LST) em concentração dupla com tubo de Durhan. 2. Anotar o número de tubos de VB com gás e determinar o Número Mais Provável (NMP) de coliformes totais/50mL em tabela de NMP apropriada às diluições inoculadas (Tabela 1). reincubar até completar 48 horas e repetir a leitura. confirmativo de coliformes totais. em um contador de colônias. em 24 horas a 45. coli. 2. Incubar os tubos a 35o C/24h e observar se há crescimento (turvação) com produção de gás. Em caso positivo. Por essa razão. Incubar os tubos a 35 oc por 24 a 48 h e observar se há crescimento com produção de gás. a presença de coliformes fecais em água e alimentos é menos representativa. UFC/mL = No de colônias/diluição II. Com uma pipeta de 10 mL estéril.1.

Explique como os microrganismos coliformes são classificados em nível laboratorial. II. Anotar o número de tubos de EC com gás e determinar o NMP de coliformes fecais/50mL em uma tabela de NMP apropriada às diluições inoculadas (Tabela1). Expresse os resultados em NMP de coliformes/100mL de amostra. empregando-se 5 tubos. Em uma análise de coliformes em água pela técnica do Número Mais Provável. seguido de incubação a 35-37ºC por 48 horas.1) transferir uma alçada bem carregada da cultura para tubos de caldo EC. Expresse o resultado em UFC de heteroróficos por mL de água analisada. Confirmação de coliformes termotolerantes: 1.3.nível de 95% de probabilidade.2 2. 2. através da técnica de semeadura em profundidade (pour plate) em ágar padrão para contagem (PCA). encontraram-se: a) 4 tubos de caldo verde brilhante turvos e com gás b) 3 tubos de tubos de caldo EC turvos e com gás.V NAÇÃO 25 . Os procedimentos para coleta de amostras de água mineral e de água de torneira ou de tubulações são exatamente os mesmos? Por quê? 3. 4. Uma alíquota de 0. 2.1mL de água mineral foi inoculada.5o C por 24 h e observar se há crescimento com produção de gás. confirmativo de coliformes termotolerantes. Número de tubos positivos 1 2 3 4 5 Fonte: SILVA et al. Número Mais Provável (NMP) .3. A partir de cada tubo positivo de LST (item II. IVIIV . em duplicata.2 IV – Questões para fixação de conhecimento 1.2 4.4 7. para diversas combinações de tubos positivos e negativos na inoculação de 5 alíquotas de 10 g ou 10 mL da amostra por tubo. A não ocorrência de gás após 24 h indica ausência de coliformes termotolerantes na amostra. 3. A não ocorrência de gás após 48 h de incubação indica ausência de coliformes totais na amostra. As contagens de UFC em cada uma das placas foram: 68 e 77. Incubar os tubos a 45.2 10. 5. (2005) NMP/50mL < 2.

coli utiliza ßglucuronidase para metabolizar MUG e criar fluorescência. Amarelo/Fluorescência azul: teste positivo para presença de E. À medida que os coliformes se reproduzem no Colilert. Interpretação dos resultados . coli. Juma vez que a maioria dos não coliformes não conta com estas enzimas. eles utilizam ß-galactosidase para metabolizar o indicador de nutriente ONPG e alterá-lo de incolor para amarelo. Amarelo: teste positivo para presença de coliformes totais. E. Basta adicionar o reagente à amostra de água e incubar a 3537ºC por 18 a 48h (até 24h para COLILERT – da IDEXX e até 48 h para COLITEST – LKP Diagnósticos). Os poucos não coliformes que têm estas enzimas são seletivamente suprimidos pela matriz especificamente formulada do Colilert. eles não podem se reproduzir e interferir. abordagem diminui a incidência de falso-positivos e falso-negativos.DETECÇÃO DE COLIFORMES EM ÁGUA – MÉTODO CROMOGÊNICO ONT ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DE ÁGUA Essa metodologia emprega substratos cromogênicos e fluorogênicos para detecção simultânea de coliformes totais e de Escherichia coli.COLILERT Incolor: frasco com 100 mL de amostra de água. AMBIENTAL 26 .

incubando-o a 37ºC por 18-48h 3) Interpretação dos resultados: 27 .Passos para uso do COLITEST: 1) Coletar a amostra de água até a marca de 100mL 2) Adicionar o meio de cultura COLItest.

A. SILVEIRA. SP: Atheneu. Práticas de microbiologia. N. M. JUNQUEIRA. C. SILVA. N. Manual de métodos de análise microbiológica de alimentos. 2007. R. SP: Livraria Varela. São Paulo. Microbiologia pratica: roteiro e manual. C. A. CANTÚSIO NETO. V. N. 2006. 2005. V. N. rev. A. Manual de métodos de análise microbiológica da água. 112p. São Paulo: Varela. B. C. bacterias e fungos . 2000. SOARES. 28 . 239 p. 164 p. F. 536 p VERMELHO. SILVA. 3.. ed. e atual São Paulo. M. da. A. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan. M. A. R..REFERÊNCIAS RIBEIRO.. SILVEIRA.. da. F. JUNQUEIRA. S.

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