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Laboratório de
Microbiologia
2011
HAMILTON R. F. BAVUTTI
MARCOS LUENGO BLANCO
MARIA RAQUEL MANHANI
BIOSSEGURANÇA EM LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA
Qualquer procedimento só deve se iniciar depois que todos os objetos necessários estejam o
mais próximo possível do operador e deve ser realizado o mais rapidamente possível;
Os frascos que precisam ser abertos devem ser fechados o mais rapidamente possível; o
trabalho deve ser feito ao redor do bico de Bunsen e não são admitidas correntes de ar;
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Todos os frascos abertos devem ter suas “bocas” flambadas imediatamente; eles devem ser
mantidos abertos ao redor do bico de Bunsen, na posição mais horizontal possível e deve ter sua
“boca” novamente flambada antes de ser fechado. Quando você flamba o tubo, o calor cria uma
corrente de convexão, que força o ar para fora, impedindo a entrada de contaminantes;
Os tampões de algodão ou roscas dos frascos não podem ser largados nem colocados sobre
nenhuma superfície; devem permanecer na mão do operador, entre o dedo mínimo e a palma da
mão durante todo o procedimento
Durante as manipulações, as superfícies internas estéreis das placas de Petri devem entrar em
contato com o ar o menor tempo possível;
As partes estéreis de alças ou pipetas que entrarão em contato com as culturas ou com frascos
estéreis não podem ser tocadas nem entrar em contato com outras superfícies não estéreis
como, por exemplo, panos, superfície da bancada, paredes externas de placas ou tubos, etc.
alça de níquel-cromo: Segura-se a alça perto de sua parte superior, como se faz com um lápis
(dedo polegar, indicador e médio), num ângulo próximo à posição vertical. Essa posição deixa o dedo
mínimo livre para segurar os tampões dos tubos.
alças calibradas: que carregam um volume conhecido do material, podendo ser usadas em
determinações quantitativas.
"Flambagem": aquecimento gradual da ponta da alça, pois depois do uso em culturas, o
aquecimento rápido pode produzir a liberação de pequenas gotículas e formação de aerossóis. Deve-se
proceder da seguinte maneira:
1. Posicionar a ponta da alça na região azul claro da chama - essa é a região "fria" da chama;
2. Mover lentamente a alça para dentro da região mais quente da chama, acima do cone azul claro,
mantendo-a até que fique completamente vermelha;
3. Mover a alça para que toda a extensão seja aquecida adequadamente ("ao rubro");
4. Esfriar a alça no ar, mantendo-a na mão, sem colocá-la em nenhum local (para que ela não se
contamine outra vez); alternativamente ela pode ser resfriada nas paredes internas de um tubo
ou placa de Petri (regiões estéreis);
5. Usar imediatamente;
6. Re-esterilizar a alça imediatamente após o uso.
Os movimentos que devem ser realizados na flambagem de alças e agulhas encontram-se na figura 2.
3
Segure a alça como se
fosse um lápis, quase na
vertical
Posicione a ponta na
região fria da chama
4
Remova o tampão com
o dedo mínimo
Recoloque o tampão,
girando o tubo
3. Manuseio de pipetas
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MANOBRAS ASSÉPTICAS
I - INTRODUÇÃO
As manobras assépticas são técnicas que impedem a entrada de microrganismos onde estes não são
desejados, ou seja, garantem a boa assepsia. Estas impedirão que microrganismos presentes no ar
ou depositados sobre as diversas superfícies com a poeira, venham a contaminar materiais estéreis
do laboratório como meios de cultura, soluções e equipamentos ou, ainda, culturas puras de
microrganismos. Também impedem que os microrganismos com que estamos trabalhando nos
contaminem ou ao ambiente.
* Operações com microrganismos patogênicos que podem gerar aerossóis, como por exemplo,
agitação intensa, centrifugação, seguidas da abertura do frasco que contém a suspensão microbiana
devem ser realizadas em cabine de segurança (capela de fluxo laminar vertical) e alças e agulhas
devem ser esterilizadas em forno esterilizador (Figura 5).
II - MATERIAL NECESSÁRIO
- pipetador
- pipetas de 1 mL e 10 mL embaladas em papel kraft ou similar
- estante para tubos
- tubos de ensaio contendo 10 mL de solução de corante (simulando meio de cultura
estéril)
- tubos de ensaio contendo 9 mL de água (simulando diluente estéril)
- alça de platina ou de níquel-cromo
- tubos de ensaio vazios
- Erlenmeyer contendo 200 mL de solução de corante (simulando meio de cultura
estéril), com tampão de algodão
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- bico de Bunsen
- placas de Petri embaladas em papel Kraft ou similar
III - OBJETIVOS
1. Identificar e manipular corretamente a vidraria principal e outros objetos de uso mais
frequente em Microbiologia.
3. Desenvolver habilidade de: a. manipular tubos contendo meios estéreis, b. realizar diluições
seriadas, c. distribuir meios de cultura estéreis em placas de Petri previamente esterilizadas.
IV - PROCEDIMENTOS
Parte A. Mostrar a vidraria principal (pipetas, placas, tubos, etc) e outros objetos de frequente
manipulação (alça, agulha de inoculação, bico de Bunsen, etc).
4. Distribuir 1 mL de solução de corante, contida em um tubo, para outro tubo vazio, usando
pipeta estéril de 1 mL. (Atenção! flambar rapidamente a boca dos tubos contendo a solução de
corante, imediatamente após abri-los e antes de fechá-los. A tampa nunca deve ser colocada sobre
a bancada, sendo retirada e mantida segura pelo dedo mínimo da mão que detém a alça ou agulha
durante a inoculação; este procedimento deve ser realizado na zona de segurança do bico de
Bunsen). Repetir quantas vezes julgar necessárias até o domínio da técnica.
1. A partir do tubo contendo solução de corante, transferir, com auxílio de pipeta de 1 ou 2 mL,
de maneira asséptica (próximo ao bico do Bunsen), 1 mL para tubo contendo 9 mL de água. Agitar
suavemente até que o corante se distribua de maneira uniforme. A partir deste tubo, transferir 1 mL
para outro tubo contendo 9 mL de água, agitando suavemente. Deste último tubo, transferir 1 mL para
outro tubo contendo 9 mL de água.
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4. Transferir aproximadamente 20 mL de solução de corante contida em Erlenmeyer para cada
uma das placas. (Atenção! flambar rapidamente a boca do Erlenmeyer contendo a solução de
corante, imediatamente após abri-lo, ou antes de fechá-lo. Repetir quantas vezes forem necessárias
até se obter domínio da técnica.
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COLORAÇÃO DE GRAM E MORFOLOGIA BACTERIANA
I - INTRODUÇÃO
As células bacterianas são caracterizadas quanto aos seguintes aspectos:
Tamanho: as bactérias são microscópicas, medindo desde 0,3 por 0,8 m até 10 por 25 m. Sendo
assim, não é possível visualizá-las a olho nu, precisando de um microscópio óptico comum.
Forma: as bactérias podem ser classificadas quanto à forma em três grupos básicos:
Cocos: células esféricas;
Bacilos: células cilíndricas, em forma de bastonetes;
Espirilos: células espiraladas. Algumas células comportam-se como bacilos curvos, que podem
ser denominados víbrios. Entre as bactérias espiraladas, existem as espiroquetas, as quais são
células flexíveis que se movimentam por rotação e flexão.
Arranjo: grupamentos bacterianos. Dependendo do plano e do número de divisões através das quais as
bactérias continuam unidas, podem aparecer os seguintes arranjos:
- Cocos:
Divisão em um plano:
- Aos pares: diplococos
- Em cadeias: estreptococos
- Bacilos e Espirilos:
Apresentam-se, em geral, como células isoladas, porém, ocasionalmente, pode-se observar: bacilos aos
pares (diplobacilos) ou em cadeias (estreptobacilos).
Coloração de Gram
Em 1884, o médico dinamarquês Christian Gram descobriu, empiricamente, ao corar cortes
histológicos com violeta de genciana, através do método de Ehrlich (1882), que bactérias que eles
continham não eram descoradas pelo álcool, se previamente tratadas com solução de iodo. Ele
adicionou a este procedimento um contra-corante (safranina, fucsina básica) e estabeleceu, a partir daí,
uma nova metodologia de coloração diferencial.
Ao longo desses anos, o mecanismo da coloração de Gram foi intensamente estudado. Surgiram
muitas modificações, contudo sem afetar substancialmente a idéia original.
O mecanismo da coloração de Gram refere-se à composição da parede celular, sendo que as
Gram-positivas possuem várias camadas de peptideoglicano e ácidos teicóicos, e as Gram-negativas,
uma fina camada de peptideoglicano sobre a qual encontra-se uma camada constituída de
lipoproteínas, fosfolipídeos e lipopolissacarídeos. Durante o processo de coloração de Gram, o
tratamento com álcool (ou álcool-acetona) extrai os lipídeos, daí resultando uma porosidade ou
permeabilidade aumentada da parede celular das bactérias Gram-negativas. Assim, o complexo cristal
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violeta-iodo (CV-I) pode ser retirado e as bactérias Gram-negativas são descoradas. A parede celular
das bactérias Gram-positivas, em virtude de sua composição diferente, torna-se desidratada durante o
tratamento com álcool, a porosidade diminui, a permeabilidade é reduzida e o complexo CV-I não pode
ser extraído.
Outra explicação baseia-se também em diferenças de permeabilidade entre os dois grupos de
bactérias. Nas bactérias Gram-positivas, o complexo CV-I é retido na parede após tratamento pelo
álcool-acetona, o que causa, provavelmente, uma diminuição do diâmetro dos poros da camada de
peptideoglicano da parede celular. Os poros da parede das bactérias Gram-negativas permanecem
suficientemente grandes, mesmo após tratamento com álcool-acetona, possibilitando a extração do
complexo CV-I.
De acordo com Trabulsi (2008), na etapa diferencial com álcool-acetona, as bactérias Gram-
negativas, devido à pequena espessura da camada basal e às descontinuidades existentes nesta
camada, em pontos de aderência entre a membrana externa e a membrana celular, têm o complexo
corado extraído pelo álcool, que deixa as células descoradas.
A reação de Gram é extremamente dependente do estado fisiológico da célula. As culturas jovens
respondem melhor à diferenciação tintorial. As culturas velhas de Gram-positivas podem se apresentar
com Gram variável, pela perda da capacidade de retenção do corante. Enzimas líticas, excretadas
normalmente por culturas envelhecidas, podem causar danos à parede celular, como por exemplo,
alterando a permeabilidade aos solventes (álcool-acetona). Conseqüentemente, o complexo iodo-cristal
violeta poderá ser retirado da célula.
II - OBJETIVOS
Executar a técnica de coloração de Gram, relacionar a composição da parede celular das
bactérias com os corantes de Gram, classificar as bactérias de acordo com a coloração de Gram, verificar
a importância de realizar a coloração de Gram a partir de um material clínico, citar as formas das
bactérias e descrever seus arranjos.
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III – MATERIAL
- Culturas de microrganismos (Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Proteus mirabilis, etc) mantidas
em meio de cultura líquido ou em meio sólido.
Cristal violeta para Gram
Solução de Lugol
Solução de fucsina ou de safranina para Gram
Solução de álcool-acetona
Solução salina fisiológica
Microscópio óptico
Bico de Bunsen
Alça e agulha de inoculação
Pinça
Lâminas para microscopia
Lenços de papel absorvente
Óleo de imersão
IV – MÉTODO
As etapas da preparação do esfregaço a partir de meios líquido e sólido encontram-se na figura 6.
4. Em seguida, realizar a fixação, passando duas ou três vezes a lâmina na chama do bico de Bunsen;
1. Colocar uma pequena gota de solução salina fisiológica na superfície de uma lâmina, com auxílio de
uma alça de platina;
2. Flambar a alça, esfriá-la e coletar o inóculo bacteriano, fazendo uma suspensão homogênea;
5. Em seguida, realizar a fixação, passando duas ou três vezes a lâmina na chama do bico de Bunsen;
1. Cobrir todo o esfregaço com solução de cristal violeta, aguardar um minuto e desprezar o corante na
pia;
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2. Cobrir todo o esfregaço com solução de lugol, aguardar um minuto e 30 segundos e desprezar o
corante na pia;
3. Inclinar a lâmina e gotejar solução álcool-acetona até que não haja desprendimento de corante (cerca
de 30 segundos). Lavar a lâmina rapidamente em água corrente;
4. Cobrir o esfregaço com fucsina (ou safranina) e aguardar 30 segundos. Lavar a lâmina e secá-la ao ar
(sem esfregá-la).
5. Observar ao microscópio, com objetiva de imersão.
6. Desenhar as estruturas e arranjos observados.
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2. Qual a importância de se realizar a fixação?
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COLORAÇÃO DE ESPOROS BACTERIANOS – MÉTODOD DE WIRTZ
I – INTRODUÇÃO
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II – OJBJETIVOS
III - PROCEDIMENTO
1. Em uma lâmina limpa, preparar um esfregaço fino a partir de cultura de Bacillus subtilis mantida
há vários dias em meio sólido (por exemplo: ágar triptona-soja).
2. Deixar secar ao ar naturalmente;
3. Fixar sobre a chama do bico de Bunsen (3 a 4 vezes);
4. Deixar esfriar;
5. Cobrir o esfregaço com uma solução aquosa de verde malaquita a 5% e aquecer até
desprendimento de vapores durante 5 minutos sobre a chama do bico de Bunsen (ou em banho-maria a
100o C por 5 a 10 minutos). Não deixar a preparação secar, acrescentando mais corante;
6. Deixar esfriar;
7. Lavar em água corrente;
8. Corar rapidamente, por 30 segundos, com uma solução aquosa de safranina a 1%;
9. Lavar em água corrente;
10. Deixar secar;
11. Observar ao microscópio ótico com a objetiva de 100 X (imersão).
IV - INTERPRETAÇÃO
Células vegetativas: cor vermelha
Endosporo: cor verde
Bactérias não esporuladas: cor vermelha
Esporos bacterianos livres: cor verde
1. Explique o que ocorre com as células de Bacillus subtilis quando estas são deixadas por vários
dias em meio de cultura.
2. Quais gêneros bacterianos são capazes de formar esporos?
3. Por que o esfregaço e a solução de corante verde-malaquita devem ser aquecidos?
4. Se a coloração de Wirtz tivesse sido aplicada a um esfregaço proveniente de células de Bacillus
subtilis reativadas há 24 horas sob condições ideais de cultivo, que estruturas seriam observadas
na lâmina após a coloração?
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PREPARAÇÃO DE MEIOS DE CULTURA
I - INTRODUÇÃO
Até cerca de 1880 os microrganismos eram cultivados em meios líquidos, quando Robert Koch e
sua equipe introduziram os meios de cultura sólidos, os quais permitiram o estudo de espécies isoladas
(culturas puras), separando-as de espécies contaminantes.
Os meios de cultura consistem da associação qualitativa e quantitativa de substâncias que
fornecem os nutrientes necessários ao desenvolvimento (cultivo) de microrganismos fora do seu meio
natural. Tendo em vista a ampla diversidade metabólica dos microrganismos, existem vários tipos de
meios de cultura para satisfazerem as variadas exigências nutricionais. Além dos nutrientes é preciso
fornecer condições ambientais favoráveis ao desenvolvimento dos microrganismos, tais como pH,
pressão osmótica, umidade, temperatura, atmosfera (aeróbia, microaeróbia ou anaeróbia), dentre
outras.
Os meios de cultura são classificados quanto ao estado físico em sólidos, quando contêm
agentes solidificantes, principalmente ágar entre 1 e 2%. O ágar é um polímero - sulfato de ácido
poligalacturônico, extraído de várias espécies de algas, principalmente do gênero Gellidum, cuja função
é solidificar os meios de cultura. Geralmente, a maioria das bactérias não metaboliza o ágar. Os meios
semi-sólidos contêm de 0,075 a 0,5 %, de ágar, dando uma consistência intermediária, de modo a
permitir o crescimento de microrganismos em tensões variadas de oxigênio ou a verificação da
motilidade e também para conservação de culturas; os meios líquidos, não contêm agentes
solidificantes, apresentando-se como um caldo, utilizados para ativação das culturas, repiques de
microrganismos, provas bioquímicas, dentre outros.
Os meios de cultura podem ainda ser classificados quanto à procedência dos constituintes em
naturais ou complexos, quando emprega ingredientes com composição química não definida, tais como
extratos de vegetais (malte, tomate, amido de tubérculos, peptona de soja, etc.) de animais (carne,
cérebro, fígado, caseína, etc.) e de microrganismos (levedura) e artificiais, sintéticos ou ainda
quimicamente definidos quando a composição química é conhecida (usados para trabalhos de pesquisa)
e seus componentes servem para suprir as exigências nutritivas dos microrganismos, em fontes de
carbono, nitrogênio, vitaminas, energia, sais minerais, dentre outros, quando então são conhecidas as
necessidades nutricionais específicas. Quanto à composição química podem ser simples (meios básicos)
ou complexos.
Básicos são aqueles que permitem o crescimento bacteriano sem satisfazer, contudo, nenhuma
exigência em especial (Ex. caldo e ágar simples).
Especiais quando cumprem com as exigências vitais de determinados microrganismos, como meio de
infusão de cérebro e coração, ágar sangue, ágar chocolate (ágar simples fundido, adicionado de sangue
e aquecido a 80°C), meio de carne cozida (com fragmentos de fígado - para anaeróbios), meios Shahidi
Ferguson Perfringens (SFP), Triptose Sulfito Ciclosserina (TSC) , Baird-Parker (com gema de ovo) (meios
ricos ou meios enriquecidos com as substâncias citadas), etc.
Diferenciais - quando contêm substâncias que permitem estabelecer diferenças entre microrganismos
muito parecidos, tais como meio de Eosina Azul de Metileno – EMB (diferencial para coliformes), Ágar
MacConkey para a diferenciação de Enterobactérias, Ágar sangue, agar Baird-Parker para isolamento e
diferenciação de cocos Gram positivos (sólidos).
Meios de triagem - meios que avaliam determinadas atividades metabólicas permitindo caracterização e
identificação perfunctória ou presuntiva de muitos microrganismos (ágar tríplice açúcar e ferro, meio
Escola Paulista de Medicina – EPM, meio motilidade, indol, lisina – MILi, caldo ou ágar uréia, etc.)
II – OBJETIVOS
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III - PROCEDIMENTOS
2. Aquecer em banho-maria (ou em chama de bico de Bunsen), agitando freqüentemente com auxílio de
bastão de vidro, até completa dissolução do meio de cultura (o meio torna-se translúcido);
3. Adicionar tampão de algodão e gaze, proteger o tampão com papel manilha ou Kraft (ou similar);
5. Após a esterilização, armazenar o meio de cultura em geladeira (ou em lugar fresco e ao abrigo da
luz).
1. Em um béquer de 150 mL, pesar quantidade necessária para o preparo 50 mL de caldo triptona e soja
– TSB e adicionar 100 mL de água destilada. Com auxílio de um bastão de vidro, agitar até completa
dissolução do meio e cultura;
2. Transferir, com auxílio de pipeta graduada, 5 mL de caldo para tubos de ensaio com tampa
rosqueável (Atenção! Não fechar completamente as tampas dos tubos);
Observação: Alguns meios de cultura são preparados da mesma forma, porém se for necessário utilizar
algumas substâncias termolábeis (por exemplo: uréia) ou que reajam com as substâncias dos meios
(aminoácidos, açúcares), as mesmas são esterilizadas à parte por filtração, através de membranas (de
nitrocelulose ou acetato de celulose) com poros de 0,22 m de diâmetro (Millipore, Sartorius), e depois
incorporadas, assepticamente, ao meio previamente esterilizado.
1. Em um béquer de 250 mL, pesar 0,85 g de cloreto de sódio (NaCl) e adicionar 100 mL de água
destilada. Com auxílio de um bastão de vidro, agitar até completa dissolução;
2. Transferir, com auxílio de pipeta graduada, 5 mL de solução para tubos de ensaio com tampa
rosqueável (Atenção! Não fechar completamente as tampas dos tubos);
1. De acordo com orientação de seu professor, embrulhar 4 placas de Petri e 5 pipetas graduadas de 2
mL em papel manilha (ou similar);
2. Esterilizar este material em estufa a 180o C por 1 hora ou em autoclave a 121o C por 15 minutos
(neste caso, o material deverá ser seco em estufa antes de ser utilizado);
2. Cite dois exemplos de meios de cultura que sejam simultaneamente seletivos e diferenciais.
4. Por que o tempo de esterilização é maior em estufa a 180ºC do que em autoclave a 121ºC?
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ESTERILIZAÇÃO DE MATERIAIS EM AUTOCLAVE
I – INTRODUÇÃO
II – OBJETIVOS
Demonstrar o funcionamento de uma autoclave vertical elétrica e manual, de acordo com as
normas de segurança.
III - PROCEDIMENTO
1. Abrir cuidadosamente a tampa da autoclave.
2. Adicionar água limpa e em quantidade suficiente à autoclave.
3. Colocar o cesto contendo o material a ser autoclavado (distribuir adequadamente os recipientes
de maneira a permitir que o vapor permeie todos eles).
4. Fechar a autoclave através de suas presilhas de segurança.
5. Ligar a autoclave, deixando o botão de controle de velocidade de aquecimento no máximo.
6. Deixar a válvula (situada na tampa da autoclave) aberta até perceber a saída de vapor
condensado.
7. Assim que o vapor começar a sair pela mangueira, indicando que o ar quente foi expulso e a
câmara está saturada de vapor, fechar a válvula.
8. Observar o manômetro/termômetro e aguardar até atingir a pressão e a temperatura desejadas
(geralmente: 1 atm e 121ºC, respectivamente).
9. Assim que se atingirem pressão e temperatura desejadas, reduzir a velocidade de aquecimento e
marcar o tempo de esterilização (geralmente, 15 minutos). Atenção!!! Não deixar que haja
oscilação da pressão e temperatura! Posicionar o contra-peso (situado na tampa da autoclave)
para frente para diminuir a pressão ou para trás para aumentar a pressão.
10. Após o tempo de esterilização, desligar o equipamento.
11. Aguardar que a temperatura decaia para 100º C (ou menor).
12. Com auxílio de luvas de cano longo, abrir a válvula (situada na tampa) para que haja saída total
do vapor.
13. Abrir todas as presilhas de segurança e finalmente, levantar a tampa.
14. Com auxílio de luvas de cano longo retirar da câmara o material esterilizado.
b.
a.
Figura 8 - Autoclave vertical. a. cesto; b. resistência para aquecimento da água e geração de vapor 20
ESTUDO DA CONTAMINAÇÃO AMBIENTAL E DA MICROBIOTA HUMANA
1 - OBJETIVOS
1. Aplicar as técnicas de manobras assépticas.
2. Verificar a presença de microrganismos em partes do corpo humano, superfícies e ar.
2 - PROCEDIMENTOS
1. Verter o meio de cultura “ágar de contagem padrão” ou ágar triptona de soja previamente fundido em
banho-maria em placas de Petri estéreis. (Atenção! Realizar esta etapa de distribuição dos meios de
cultura na “zona de segurança” da chama do bico de Bunsen para evitar contaminação);
3. Expor uma placa com o meio de cultura solidificado em um local de sua preferência (laboratório,
elevador, rampa, saguão, etc) durante 15 minutos;
Com auxílio de um swab, retirar material de partes do corpo humano: saliva, língua, ouvido,
superfície das mãos, região inferior da unha, nariz e, em seguida, espalhá-lo na superfície dos
meios de cultura;
1. Observar a presença de diferentes colônias na superfície dos meios de cultura, com diferentes
tamanhos, aspectos, cor.
1. Quais os cuidados que devem ser observados durante a distribuição de meio de cultura estéril
nas placas de Petri?
2. Qual técnica pode ser empregada para se estimar o grau de contaminação microbiana presente
em um ambiente? Como esta técnica é denominada? Quais suas vantagens e limitações?
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ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DE ÁGUA
ONT
I – INTRODUÇÃO
Entende-se por água potável a água para consumo humano cujos parâmetros microbiológicos,
físicos, químicos e radioativos atendam ao padrão de potabilidade e que não ofereça riscos à saúde
(BRASIL, 2004).
A água potável deve estar em conformidade com o padrão microbiológico estabelecido pela
Portaria nº518, de 25 de março de 2004, do Ministério da Saúde (BRASIL, 2004), apresentado na Tabela
abaixo:
(2)
Água para consumo humano
NOTAS:
(1) Valor Máximo Permitido.
(2) água para consumo humano em toda e qualquer situação, incluindo fontes individuais como poços,
minas, nascentes, dentre outras.
II – OBJETIVOS
Avaliar a qualidade microbiológica de amostras de água de abastecimento e de água mineral.
III - PROCEDIMENTOS
Utilizar frascos com tampas à prova de vazamentos, de material aprovado para contato com água
destinada ao consumo humano e, de preferência, autoclaváveis ou pré-esterilizados. Podem-se também
empregar recipientes descartáveis (sacos plásticos) previamente esterilizados, comercialmente
disponíveis.
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Procedimento para coleta:
- Água mineral engarrafada: deve ser coletada na embalagem original, lacrada. Havendo necessidade de
coletar volumes menores, a partir de embalagens de maior capacidade, deve-se homogeneizar todo o
conteúdo, invertendo a embalagem várias vezes, desinfetar o bocal com etanol 70% e,assepticamente,
abrir o lacre com uma faca ou tesoura estéril ou flambada. Desprezar o volume inicial e coletar a
amostra em um frasco estéril.
- Água de torneira ou tubulações: limpar a área externa da saída com etanol 70%, flambar, se o material
for resistente ao calor, deixar a água fluir por 2 a 3 minutos. Amostras de água clorada devem ter o
cloro totalmente neutralizado imediatamente após a coleta. Para tal, adicionar ao frasco de coleta, antes
da esterilização, 0,1 mL de solução de tiossulfato de sódio a 1,8% para cada 100 mL de água que se
pretende coletar.
b) Abertura das embalagens e tomada da unidade analítica: antes de abrir as embalagens deve-se
desinfetar a área externa com etanol 70%, para remoção dos contaminantes presentes. A abertura e a
retirada da unidade analítica devem ser feitas, preferencialmente, no interior de câmaras de fluxo
laminar, para prevenir qualquer contaminação da amostra. Se não houver fluxo laminar, deve-se
trabalhar na região próxima à chama do bico de Bunsen de tamanho médio, chama azulada, com as
portas e janelas do laboratório fechadas, para evitar correntes de ar.
Todos os instrumentos e utensílios empregados na abertura das embalagens e retirada das
unidades analíticas (tesouras, pinças, facas, espátulas, etc) devem ser previamente esterilizados em
autoclave ou estufa de esterilização ou mergulhados em etanol 70% e flambados no momento do uso.
Se a quantidade de amostra encaminhada para análise for menor do que a unidade analítica requerida,
deve-se submeter metade à análise, reservando a outra metade como contra-amostra.
Também conhecida como contagem padrão em placas, é um procedimento que objetiva estimar
o número de bactérias heterotróficas na água, particularmente como uma ferramenta para acompanhar
variações nas condições de processo, no caso das águas minerais, ou a eficiência das diversas etapas de
tratamento, no caso de águas tratadas, permitindo ainda verificar as condições higiênicas em diferentes
pontos da rede de distribuição.
1. Inoculação: através de pipeta estéril, adicionar 1 mL e 0,1 mL da amostra de água em placas de Petri
vazias estéreis.
2. Adição do meio de cultura: verter nas placas inoculadas, 15 a 20 mL de ágar padrão para contagem
(PCA), previamente fundido e resfriado a 45o C. Misturar o inóculo com o meio de cultura
movimentando suavemente as placas, numa superfície plana, em movimentos na forma de oito ou em
movimentos circulares, 8 a 10 vezes no sentido horário e 8 a 10 vezes no sentido anti-horário.
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Contagem as colônias e cálculo dos resultados: selecionar as placas com 30 a 300 colônias e contar as
colônias com o auxílio de uma lupa, em um contador de colônias. Calcular o UFC por mL da amostra
multiplicando o número de colônias pelo inverso da diluição inoculada. Usar notação exponencial e
apenas uma casa decimal depois da vírgula, na apresentação dos resultados.
UFC/mL = No de colônias/diluição
II. Número Mais Provável de Coliformes Totais e Termotolerantes – Técnica dos Tubos Múltiplos
Introdução
Grupo dos coliformes totais: este grupo inclui as bactérias na forma de bastonetes Gram
negativos, não esporogênicos, aeróbias ou anaeróbias facultativas, capazes de fermentar a lactose com
produção de gás em 24 a 48 horas a 35o C. O grupo inclui cerca de 20 componentes, dentre os quais
encontram-se tanto bactérias do trato intestinal de humanos e de outros animais de sangue quente,
como também diversos gêneros e espécies não entéricas, como Serratia e Aeromonas. Por essa razão,
sua quantificação em água e alimentos é menos representativa, como indicação de contaminação fecal,
do que a quantificação de coliformes fecais ou de E. coli.
Grupo dos coliformes termotolerantes: a definição é a mesma dos coliformes totais, porém,
restringindo-se aos membros capazes de fermentar a lactose com produção de gás, em 24 horas a
45,5o C. Esta definição objetivou, em princípio, selecionar apenas os coliformes originários do trato
intestinal. Atualmente, sabe-se, entretanto que o grupo dos coliformes fecais inclui pelo menos três
gêneros, Escherichia, Enterobacter e Klebsiella, dos quais dois (Enterobacter e Klebsiella) incluem cepas
de origem não fecal. Por este motivo, a presença de coliformes fecais em água e alimentos é menos
representativa, como indicação de contaminação fecal do que a enumeração direta de E. coli, porém
muito mais significativa do que a presença de coliformes totais, dada a alta incidência de E. coli no
grupo fecal.
1. A partir de cada tubo positivo no item anterior, transferir uma alçada bem carregada de cultura
para tubos de caldo Verde brilhante (VB). Incubar os tubos a 35 oc por 24 a 48 h e observar se há
crescimento com produção de gás, confirmativo de coliformes totais.
2. Anotar o número de tubos de VB com gás e determinar o Número Mais Provável (NMP) de
coliformes totais/50mL em tabela de NMP apropriada às diluições inoculadas (Tabela 1).
24
3. A não ocorrência de gás após 48 h de incubação indica ausência de coliformes totais na amostra.
1. A partir de cada tubo positivo de LST (item II.1) transferir uma alçada bem carregada da cultura
para tubos de caldo EC.
Número Mais Provável (NMP) - nível de 95% de probabilidade, para diversas combinações de tubos
positivos e negativos na inoculação de 5 alíquotas de 10 g ou 10 mL da amostra por tubo.
1 < 2,2
2 2,2
3 4,4
4 7,2
5 10,2
Fonte: SILVA et al. (2005)
5.
IVIIV - V -
NAÇÃO
25
DETECÇÃO DE COLIFORMES EM ÁGUA – MÉTODO CROMOGÊNICO
ONT ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DE ÁGUA
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Passos para uso do COLITEST:
1) Coletar a amostra de água até a marca de 100mL 2) Adicionar o meio de cultura COLItest,
incubando-o a 37ºC por 18-48h
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REFERÊNCIAS
RIBEIRO, M. C.; SOARES, M. M. S. R. Microbiologia pratica: roteiro e manual, bacterias e fungos . São
Paulo, SP: Atheneu, 2000. 112p.
SILVA, N. da; CANTÚSIO NETO, R.; JUNQUEIRA, V. C. A.; SILVEIRA, N. F. A. Manual de métodos de análise
microbiológica da água. São Paulo: Varela, 2005. 164 p.
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