Aulas Práticas do Laboratório de Microbiologia

2011

HAMILTON R. F. BAVUTTI MARCOS LUENGO BLANCO MARIA RAQUEL MANHANI

BIOSSEGURANÇA EM LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA
1. O trabalho no laboratório de microbiologia exige, obrigatoriamente, o uso de epi: avental de mangas longas, com elástico nas mangas, fechado; óculos; touca; máscara facial; luvas; sapatos fechados ou pró-pés; 2. Evitar o uso de lentes de contato (preferir óculos) e maquiagem; 3. Não fumar, não comer, não beber; evitar tocar a boca e outras mucosas ou pele; 4. Não deixar cadernos, canetas, livros, bolsas, sacolas, dentre outros na bancada de trabalho – eles devem ser colocados em locais onde não haja risco de contaminação; 5. Cuidado com a chama do bico de Bunsen (figura 1), que deverá estar acesa durante a maior parte do tempo; 6. Desinfetar a bancada no começo e no fim do trabalho com solução de álcool 70% ou outra similar (cuidado! Verifique se o bico de Bunsen não está aceso!!!); 7. Ler atentamente o protocolo da aula prática e não iniciar o trabalho antes de ter certeza sobre o que fazer, a cada passo; 8. Antes de iniciar o trabalho assegure-se de que tem, à mão, todo o material necessário – não pegar mais material que o necessário nem material indevido; 9. Todo o material deve ser devidamente identificado; 10. Utilizar corretamente as técnicas de manuseio de culturas microbianas: 11. Não falar durante o manuseio das culturas, para minimizar o risco de contaminação das mesmas; 12. Relatar imediatamente, ao professor ou técnico, qualquer evento, acidente ou imprevisto; 13. Quando terminar de trabalhar com culturas, retirar as luvas e descartá-las em lixo infectante, lavar as mãos com sabonete antisséptico ou similar; deixar secar ao ar; 14. Guardar todo material usado no local apropriado e deixar as bancadas em ordem ao fim do trabalho; 15. O lixo deverá ser adequadamente acondicionado e todo material contaminado deve ser autoclavado para descontaminação antes de ser descartado ou reutilizado; 16. Retirar todos os EPIs (avental, luvas, óculos de segurança) quando sair do laboratório; 17. Depois de usar o microscópio, desligar a luz e limpar a objetiva com lenço de papel fino embebido em solução apropriada para limpeza das lentes, para retirar o óleo de imersão. Várias precauções devem ser obrigatoriamente tomadas durante os procedimentos no laboratório de Microbiologia para evitar a contaminação das pessoas, do ambiente e das culturas: Qualquer procedimento só deve se iniciar depois que todos os objetos necessários estejam o mais próximo possível do operador e deve ser realizado o mais rapidamente possível; Os frascos que precisam ser abertos devem ser fechados o mais rapidamente possível; o trabalho deve ser feito ao redor do bico de Bunsen e não são admitidas correntes de ar;

Figura 1 – Bico de Bunsen

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Deve-se proceder da seguinte maneira: 1. indicador e médio). superfície da bancada. as superfícies internas estéreis das placas de Petri devem entrar em contato com o ar o menor tempo possível. mantendo-a na mão. Flambagem de alças e agulhas de platina ou de níquel-cromo  alça de níquel-cromo: Segura-se a alça perto de sua parte superior. 3 . panos. o determinações quantitativas. entre o dedo mínimo e a palma da mão durante todo o procedimento Durante as manipulações. Os tampões de algodão ou roscas dos frascos não podem ser largados nem colocados sobre nenhuma superfície. aquecimento rápido pode produzir a liberação de pequenas gotículas e formação de aerossóis. Mover lentamente a alça para dentro da região mais quente da chama. 1. Usar imediatamente. podendo ser usadas em "Flambagem": aquecimento gradual da ponta da alça. sem colocá-la em nenhum local (para que ela não se contamine outra vez). Posicionar a ponta da alça na região azul claro da chama . Os movimentos que devem ser realizados na flambagem de alças e agulhas encontram-se na figura 2. devem permanecer na mão do operador. Re-esterilizar a alça imediatamente após o uso. Quando você flamba o tubo. 3. impedindo a entrada de contaminantes. As partes estéreis de alças ou pipetas que entrarão em contato com as culturas ou com frascos estéreis não podem ser tocadas nem entrar em contato com outras superfícies não estéreis como. acima do cone azul claro. pois depois do uso em culturas. Mover a alça para que toda a extensão seja aquecida adequadamente ("ao rubro"). 6. Esfriar a alça no ar. 5.   alças calibradas: que carregam um volume conhecido do material. 4. etc. que força o ar para fora. paredes externas de placas ou tubos. mantendo-a até que fique completamente vermelha. 2. num ângulo próximo à posição vertical. como se faz com um lápis (dedo polegar. na posição mais horizontal possível e deve ter sua “boca” novamente flambada antes de ser fechado. alternativamente ela pode ser resfriada nas paredes internas de um tubo ou placa de Petri (regiões estéreis).essa é a região "fria" da chama. eles devem ser mantidos abertos ao redor do bico de Bunsen.Todos os frascos abertos devem ter suas “bocas” flambadas imediatamente. o calor cria uma corrente de convexão. Essa posição deixa o dedo mínimo livre para segurar os tampões dos tubos. por exemplo.

Segure a alça como se fosse um lápis. Depois de usar. rodando o tubo e não o tampão. Flambagem de tubos e frascos Afrouxe o tampão do frasco ou tubo. repita a operação acima. Feche o tubo. o tampão fica preso na mão do operador. recolocando o tampão. para que ele saia facilmente. quase na vertical Posicione a ponta na região fria da chama Esfrie no ar. A seqüência de flambagem de tubos e frascos encontra-se na figura 3. mantendo o seguro entre esse dedo e a palma da mão (para retirar o tampão. Segure o tubo com a mão esquerda e retire o tampão com dedo mínimo da mão direita. próximo à chama Aqueça gradualmente toda a extensão "ao rubro" Figura 2 – Seqüência para flambagem de alça e de agulha de inoculação 2. não se esqueça. 4 . antes de fechar. dentro da chama do bico de Bunsen enquanto isso. rode o frasco e não o tampão .o tampão fica fixo). Passe a boca do tubo para frente e para trás.

colocando o aspirador e mantendo o dedo mínimo livre para abrir o frasco que contem o líquido a ser transferido. 5 .Remova o tampão com o dedo mínimo Segure o tampão entre o dedo e a palma da mão Passe a boca do tubo dentro da chama Recoloque o tampão. para ser transportada. girando o tubo Figura 3 – Flambagem de tubos e frascos 3. imediatamente após o uso. com algodão na ponta. como um lápis. A pipeta contaminada deve ser colocada em um frasco com desinfetante. Manuseio de pipetas As pipetas graduadas ou de Pasteur. previamente esterilizadas. Não encostar a ponta da pipeta em regiões não estéreis dos tubos. Segurá-las pela região do bocal. acondicionadas em recipientes especiais ou individualmente embrulhadas devem ser manuseadas na frente do bico de Bunsen.

As técnicas referentes à manipulação de culturas envolvem basicamente: 1.MATERIAL NECESSÁRIO pipetador pipetas de 1 mL e 10 mL embaladas em papel kraft ou similar estante para tubos tubos de ensaio contendo 10 mL de solução de corante (simulando meio de cultura estéril) tubos de ensaio contendo 9 mL de água (simulando diluente estéril) alça de platina ou de níquel-cromo tubos de ensaio vazios Erlenmeyer contendo 200 mL de solução de corante (simulando meio de cultura estéril). Trabalhar em áreas submetidas previamente à limpeza e à desinfecção. soluções e equipamentos ou. venham a contaminar materiais estéreis do laboratório como meios de cultura. ou antes de fechá-los. Flambar ao rubro alça ou agulha antes e após cada inoculação. 2. Deixar esfriar o instrumento antes de obter o inóculo. culturas puras de microrganismos.MANOBRAS ASSÉPTICAS I . 6. Também impedem que os microrganismos com que estamos trabalhando nos contaminem ou ao ambiente. Trabalhar dentro da “zona de segurança” do bico de Bunsen*. Flambar rapidamente a boca dos tubos contendo microrganismos ou meio estéril. placas de Petri. * Operações com microrganismos patogênicos que podem gerar aerossóis. imediatamente após abri-los. como por exemplo. 4. flambá-la rapidamente e mantê-la nesta região durante todo o trabalho. 5. agitação intensa. ou seja. seguidas da abertura do frasco que contém a suspensão microbiana devem ser realizadas em cabine de segurança (capela de fluxo laminar vertical) e alças e agulhas devem ser esterilizadas em forno esterilizador (Figura 5). ainda. com tampão de algodão - 6 . preferencialmente na parte interna do recipiente que contém o meio de cultura. A tampa nunca deve ser colocada sobre a bancada. II . Os procedimentos 2 a 5 estão ilustrados na Figura 4. Estas impedirão que microrganismos presentes no ar ou depositados sobre as diversas superfícies com a poeira. dentro da zona de segurança. para reduzir o número de potenciais microrganismos contaminantes. sem que haja perigo de superaquecimento ou queimaduras.INTRODUÇÃO As manobras assépticas são técnicas que impedem a entrada de microrganismos onde estes não são desejados. os recipientes (tubos de ensaio. etc) com meio de cultura devem ser abertos o mais próximo possível da chama do bico. ou seja. Desembrulhar a pipeta estéril dentro da zona de segurança. centrifugação. garantem a boa assepsia. 3. sendo retirada e mantida segura pelo dedo mínimo da mão que detém a alça ou agulha durante a inoculação.

A tampa nunca deve ser colocada sobre a bancada.PROCEDIMENTOS Parte A. este procedimento deve ser realizado na zona de segurança do bico de Bunsen). 2. transferir 1 mL para outro tubo contendo 9 mL de água. (Atenção! flambar rapidamente a boca dos tubos contendo a solução de corante. com auxílio de pipeta de 1 ou 2 mL. etc). b. contida em um tubo.III . a válvula da tubulação de gás). A partir do tubo contendo solução de corante. 1 mL para tubo contendo 9 mL de água. placas. agulha de inoculação. realizar diluições seriadas. 2. 3. a válvula da tubulação de gás).Realização de diluições seriadas 1. . bico de Bunsen. Treinamento de manobras assépticas . Acender o bico de Bunsen (abrir primeiramente a válvula do bico de Bunsen e a seguir. Acender o bico de Bunsen (abrir primeiramente a válvula do bico de Bunsen e a seguir. Retirar uma pipeta de 1 mL da embalagem e acoplá-la ao pipetador. c. Retirar as placas vazias da embalagem e mantê-las próximas ao bico de Bunsen.Transferência de meio de cultura contido em Erlenmeyer para placas de Petri 1. distribuir meios de cultura estéreis em placas de Petri previamente esterilizadas. IV . Deste último tubo. Desenvolver habilidade de: a.Transferência de caldo estéril para tubos previamente esterilizados 1. . (Atenção! Este procedimento deve ser realizado na zona de segurança do bico de Bunsen). 7 . Mostrar a vidraria principal (pipetas. tubos. 2. Agitar suavemente até que o corante se distribua de maneira uniforme. 3. 3. Realizar a desinfecção da bancada de trabalho. 4. Identificar e manipular corretamente a vidraria principal e outros objetos de uso mais frequente em Microbiologia. A partir deste tubo. agitando suavemente. Descrever as principais técnicas de manobras assépticas. de maneira asséptica (próximo ao bico do Bunsen). etc) e outros objetos de frequente manipulação (alça. transferir. Realizar a desinfecção da bancada de trabalho. sendo retirada e mantida segura pelo dedo mínimo da mão que detém a alça ou agulha durante a inoculação. transferir 1 mL para outro tubo contendo 9 mL de água. Distribuir 1 mL de solução de corante. Repetir quantas vezes julgar necessárias até o domínio da técnica. Parte B.OBJETIVOS bico de Bunsen placas de Petri embaladas em papel Kraft ou similar 1. para outro tubo vazio. manipular tubos contendo meios estéreis. imediatamente após abri-los e antes de fechá-los. usando pipeta estéril de 1 mL.

Qual a diluição final obtida no procedimento de diluição seriada realizado? 8 . (Atenção! flambar rapidamente a boca do Erlenmeyer contendo a solução de corante. imediatamente após abri-lo. ou antes de fechá-lo.Esterilizador de alças e agulhas V – Questões para fixação de conhecimento 1.4. Repetir quantas vezes forem necessárias até se obter domínio da técnica. Quais os principais objetivos das manobras assépticas? 2. Cite três procedimentos adotados em laboratório de microbiologia que minimizam o risco de contaminação ambiental. Figura 4 . do operador e do material em estudo. Transferir aproximadamente 20 mL de solução de corante contida em Erlenmeyer para cada uma das placas. 3.Manobras assépticas. Fonte: VERMELHO (2006) Figura 5 .

Durante o processo de coloração de Gram. pode-se observar: bacilos aos pares (diplobacilos) ou em cadeias (estreptobacilos). o médico dinamarquês Christian Gram descobriu. fosfolipídeos e lipopolissacarídeos. Dependendo do plano e do número de divisões através das quais as bactérias continuam unidas. empiricamente. o mecanismo da coloração de Gram foi intensamente estudado. que bactérias que eles continham não eram descoradas pelo álcool. o tratamento com álcool (ou álcool-acetona) extrai os lipídeos. contudo sem afetar substancialmente a idéia original. o complexo cristal 9 . O mecanismo da coloração de Gram refere-se à composição da parede celular. Assim.Em cadeias: estreptococos Divisão em dois planos: . precisando de um microscópio óptico comum. fucsina básica) e estabeleceu. que podem ser denominados víbrios. sendo que as Gram-positivas possuem várias camadas de peptideoglicano e ácidos teicóicos. em forma de bastonetes. Arranjo: grupamentos bacterianos. não é possível visualizá-las a olho nu.COLORAÇÃO DE GRAM E MORFOLOGIA BACTERIANA I . ao corar cortes histológicos com violeta de genciana. porém. Coloração de Gram Em 1884. a partir daí. uma fina camada de peptideoglicano sobre a qual encontra-se uma camada constituída de lipoproteínas. Espirilos: células espiraladas.Tétrades Divisão em três planos: . Surgiram muitas modificações. Forma: as bactérias podem ser classificadas quanto à forma em três grupos básicos:    Cocos: células esféricas.3 por 0. medindo desde 0.8 m até 10 por 25 m.INTRODUÇÃO As células bacterianas são caracterizadas quanto aos seguintes aspectos: Tamanho: as bactérias são microscópicas. as quais são células flexíveis que se movimentam por rotação e flexão. através do método de Ehrlich (1882). Bacilos: células cilíndricas. daí resultando uma porosidade ou permeabilidade aumentada da parede celular das bactérias Gram-negativas.Aos pares: diplococos . e as Gram-negativas.Bacilos e Espirilos: Apresentam-se. como células isoladas. podem aparecer os seguintes arranjos: . Entre as bactérias espiraladas.De forma não organizada: cocos em cachos (estafilococos) . existem as espiroquetas.Cocos: Divisão em um plano: . em geral. uma nova metodologia de coloração diferencial. Ao longo desses anos. Ele adicionou a este procedimento um contra-corante (safranina. ocasionalmente. Algumas células comportam-se como bacilos curvos.Feixes cúbicos: sarcina . se previamente tratadas com solução de iodo. Sendo assim.

pela perda da capacidade de retenção do corante. possibilitando a extração do complexo CV-I. a permeabilidade é reduzida e o complexo CV-I não pode ser extraído. a porosidade diminui. Outra explicação baseia-se também em diferenças de permeabilidade entre os dois grupos de bactérias. permanecendo violeta tornando-se vermelha. sair da o complexo 3 – Álcool-acetona Desidratação celular. Conseqüentemente. que permanece violeta permanece violeta parede Extração dos lipídeos da da parede celular. A parede celular das bactérias Gram-positivas.violeta-iodo (CV-I) pode ser retirado e as bactérias Gram-negativas são descoradas. classificar as bactérias de acordo com a coloração de Gram. verificar a importância de realizar a coloração de Gram a partir de um material clínico. como por exemplo. uma diminuição do diâmetro dos poros da camada de peptideoglicano da parede celular. As culturas jovens respondem melhor à diferenciação tintorial. em pontos de aderência entre a membrana externa e a membrana celular. devido à pequena espessura da camada basal e às descontinuidades existentes nesta camada. o complexo CV-I é retido na parede após tratamento pelo álcool-acetona. têm o complexo corado extraído pelo álcool. De acordo com Trabulsi (2008). 10 .o complexo CV-I é removido da célula pode que permanece 4 – Fucsina ou safranina A célula não é afetada. Nas bactérias Gram-positivas. na etapa diferencial com álcool-acetona. o que causa. citar as formas das bactérias e descrever seus arranjos. provavelmente. Os poros da parede das bactérias Gram-negativas permanecem suficientemente grandes. as bactérias Gramnegativas. que I no interior da célula. que deixa as células descoradas. podem causar danos à parede celular. relacionar a composição da parede celular das bactérias com os corantes de Gram. em virtude de sua composição diferente. o complexo iodo-cristal violeta poderá ser retirado da célula. excretadas normalmente por culturas envelhecidas. alterando a permeabilidade aos solventes (álcool-acetona). aumento da da porosidade. A reação de Gram é extremamente dependente do estado fisiológico da célula. II . Etapas da coloração de Gram e aspectos das células gram-positivas e gram-negativas Soluções e ordem de aplicação 1 – Cristal violeta 2 – Solução de lugol Reação e aspecto das bactérias Gram-positivas Coradas em violeta Gram-negativas Coradas em violeta Formação do complexo CV. As culturas velhas de Gram-positivas podem se apresentar com Gram variável. A célula adquire o corante.Formação do complexo CVI no interior da célula. torna-se desidratada durante o tratamento com álcool. Enzimas líticas. violeta não da e diminuição permeabilidade. mesmo após tratamento com álcool-acetona.OBJETIVOS Executar a técnica de coloração de Gram. porosidade CV-I célula.

4. aguardar um minuto e desprezar o corante na pia. 2.Culturas de microrganismos (Escherichia coli. Colocar uma pequena gota de solução salina fisiológica na superfície de uma lâmina. Com auxílio de uma alça de platina (ou de níquel-cromo) estéril. 11 . fazendo movimentos circulares de dentro para fora. fazendo uma suspensão homogênea. esfriá-la e coletar o inóculo bacteriano. Espalhar sobre a lâmina. Esperar a lâmina esfriar e realizar a coloração. 5. realizar a fixação. Em seguida. Staphylococcus aureus. Deixar o esfregaço secar à temperatura ambiente. 2.III – MATERIAL .             Cristal violeta para Gram Solução de Lugol Solução de fucsina ou de safranina para Gram Solução de álcool-acetona Solução salina fisiológica Microscópio óptico Bico de Bunsen Alça e agulha de inoculação Pinça Lâminas para microscopia Lenços de papel absorvente Óleo de imersão IV – MÉTODO As etapas da preparação do esfregaço a partir de meios líquido e sólido encontram-se na figura 6. etc) mantidas em meio de cultura líquido ou em meio sólido. Proteus mirabilis. b) Técnica de coloração de Gram 1. Esperar a lâmina esfriar e realizar a coloração. Flambar novamente a alça. 6. Em seguida. Cobrir todo o esfregaço com solução de cristal violeta. com auxílio de uma alça de platina. Flambar a alça. 4. passando duas ou três vezes a lâmina na chama do bico de Bunsen. 3. passando duas ou três vezes a lâmina na chama do bico de Bunsen. 3. A partir de meio sólido: 1. Flambar a alça e deixar o esfregaço secar à temperatura ambiente. a) Preparação de esfregaço de microrganismos A partir de meio líquido: 1. colocar duas alíquotas de cultura bacteriana preparada no meio líquido sobre a superfície de uma lâmina de microscopia. 5. realizar a fixação.

Lavar a lâmina e secá-la ao ar (sem esfregá-la). Cobrir o esfregaço com fucsina (ou safranina) e aguardar 30 segundos. Lavar a lâmina rapidamente em água corrente. Observar ao microscópio. com objetiva de imersão. Fonte: VERMELHO (2006) V – Questões para fixação de conhecimento 1. Cobrir todo o esfregaço com solução de lugol. 4. 5.2. Desenhar as estruturas e arranjos observados. Inclinar a lâmina e gotejar solução álcool-acetona até que não haja desprendimento de corante (cerca de 30 segundos). Figura 6 . 6. aguardar um minuto e 30 segundos e desprezar o corante na pia. 3. Explique como pode ser realizada a fixação do esfregaço.Seqüência de preparação de esfregaço. 12 .

Qual a importância de se realizar a fixação? 3. 4. As células bacterianas gram-negativas submetidas à coloração de Gram. 13 . Descreva a função de cada substância empregada na coloração de Gram.2. na qual o operador deixou de realizar a etapa de lavagem com álcool-acetona terão que aspecto ao microscópio? Explique.

Este fenômeno biológico é entendido como a formação de uma nova célula – o esporo. cromossomo. subterminal ou terminal. É indiscutível que a esporulação é um dos mais importantes eventos da fisiologia celular bacteriana. o ácido dipicolínico encontra-se na forma de sal – dipicolinato de cálcio. Mas esta não é a única propriedade associada ao fenômeno. o qual emprega o verde malaquita e safranina.COLORAÇÃO DE ESPOROS BACTERIANOS – MÉTODOD DE WIRTZ I – INTRODUÇÃO Uma característica importante. no interior de uma célula bacteriana. o qual pode levar horas para se completar. pois estes detalhes não são muito repetidos nas várias espécies. sem uma fonte externa de nutrientes. uma preparação a fresco de bactérias esporuladas pode ser rápida e satisfatoriamente observada através de um microscópio ótico de contraste de fase. Por esta razão. indubitavelmente. Normalmente. substância ausente na estrutura de células vegetativas. dependendo das condições de cultivo. tanto morfológica quanto fisiológica de um grande número de bactérias Gram positivas pertencentes aos gêneros Bacillus e Clostridium é a esporulação. O material genético. tais como cristal violeta. Isto. A desidratação gera uma estrutura muito densa e altamente refrátil (refringente). que lhes permite sobreviver em circunstâncias precárias. o esporo pode permanecer estável por muitos anos. o calor é usado para facilitar a penetração do corante verde-malaquita através da parede do esporo. dificultando (e até mesmo impedindo) a ação de desinfetantes comuns sobre a estrutura queratinóide destas capas. Uma vez formado. devido à grande quantidade de cátions Ca 2+ na célula. A membrana do esporo apresenta em sua composição o ácido dipicolínico. tamanho. azul de metileno. O esporo também é chamado de endósporo e difere química e fisiologicamente da célula que o originou. que vão de valores que permitem a inclusão do esporo no corpo celular até dimensões maiores. é reflexo da característica particular de seu envoltório. localização intracelular) os esporos desempenham importante papel na sistemática bacteriana. As técnicas de coloração usuais são ineficientes e o esporo se mostra impenetrável a corantes comuns. mostrando um aumento de resistência ao calor. Tal fenômeno também se verifica quando uma célula vegetativa. respectivamente. localizados no corpo da célula vegetativa em posição central. Um dos métodos mais empregados para a coloração de esporos é o de WIRTZ (1908). desidratada é aquecida em um meio aquoso. pode até ser ativado e dar origem a uma célula vegetativa capaz de se multiplicar. congelamento. dessecação. causando deformações nas células. como corante e contra-corante. 14 . Algumas células desenvolvem um mecanismo de ordem genética. alterações químicas e radiações. Quando colocado em um meio de cultivo adequado. está protegido por uma dupla camada oriunda da invaginação da própria membrana interna da forma vegetativa. A esporulação é um processo demorado. Neste método. O contra-corante safranina é aplicado com a finalidade de diferenciar as células vegetativas dos esporos. Do ponto de vista morfológico (forma. Elas manifestam grande resistência ao calor. Existem esporos ovais e esféricos. Tais propriedades estão associadas em parte à desidratação progressiva por que passa o citoplasma celular. e com dimensões variadas.

Se a coloração de Wirtz tivesse sido aplicada a um esfregaço proveniente de células de Bacillus subtilis reativadas há 24 horas sob condições ideais de cultivo. IV . preparar um esfregaço fino a partir de cultura de Bacillus subtilis mantida há vários dias em meio sólido (por exemplo: ágar triptona-soja).PROCEDIMENTO 1. Identificar através da coloração. 8. dimensão. forma e localização celular de esporos em bactérias. 2. 9. Deixar secar. Quais gêneros bacterianos são capazes de formar esporos? 3. Deixar esfriar. Lavar em água corrente. Lavar em água corrente. Não deixar a preparação secar. Fixar sobre a chama do bico de Bunsen (3 a 4 vezes). 2. 7. que estruturas seriam observadas na lâmina após a coloração? 15 . Corar rapidamente. 6. com uma solução aquosa de safranina a 1%. a presença. Explique o que ocorre com as células de Bacillus subtilis quando estas são deixadas por vários dias em meio de cultura.  Aspecto do bacilo: normal ou dilatado  Forma do endósporo: oval ou esférico  Localização do endósporo: central. por 30 segundos. Observar ao microscópio ótico com a objetiva de 100 X (imersão). III . Em uma lâmina limpa. 5. em relação à forma. acrescentando mais corante.INTERPRETAÇÃO  Células vegetativas: cor vermelha  Endosporo: cor verde  Bactérias não esporuladas: cor vermelha  Esporos bacterianos livres: cor verde Anotar os resultados. 3. dimensão e localização intracelular do esporo. Deixar esfriar. Por que o esfregaço e a solução de corante verde-malaquita devem ser aquecidos? 4. subterminal ou terminal V – Questões para fixação de conhecimento 1. Deixar secar ao ar naturalmente.II – OJBJETIVOS Executar uma técnica de coloração específica para a visualização de esporos bacterianos. 4. 10. 11. Cobrir o esfregaço com uma solução aquosa de verde malaquita a 5% e aquecer até desprendimento de vapores durante 5 minutos sobre a chama do bico de Bunsen (ou em banho-maria a 100o C por 5 a 10 minutos).

quando Robert Koch e sua equipe introduziram os meios de cultura sólidos. cérebro. ágar sangue.075 a 0. tais como extratos de vegetais (malte.) e de microrganismos (levedura) e artificiais. Básicos são aqueles que permitem o crescimento bacteriano sem satisfazer. Os meios de cultura consistem da associação qualitativa e quantitativa de substâncias que fornecem os nutrientes necessários ao desenvolvimento (cultivo) de microrganismos fora do seu meio natural. dando uma consistência intermediária. sais minerais. peptona de soja. pressão osmótica. tomate. os meios especiais podem ser classificados em: Meios de pré-enriquecimento são aqueles que permitem a recuperção/multiplicação de microrganismos injuriados. fígado. caldo e ágar simples). umidade. tais como pH. ágar chocolate (ágar simples fundido. atmosfera (aeróbia. 16 . utilizados para ativação das culturas. nitrogênio. microaeróbia ou anaeróbia). de ágar. apresentando-se como um caldo. Além dos nutrientes é preciso fornecer condições ambientais favoráveis ao desenvolvimento dos microrganismos. cuja função é solidificar os meios de cultura. água peptonada tamponada. dentre outras. principalmente ágar entre 1 e 2%. extraído de várias espécies de algas. provas bioquímicas. principalmente do gênero Gellidum. dentre outros. caldo lactosado (isolamento de Salmonella sp em alimentos).PREPARAÇÃO DE MEIOS DE CULTURA I .para anaeróbios).5 %. meios Shahidi Ferguson Perfringens (SFP). Triptose Sulfito Ciclosserina (TSC) . Ex. separando-as de espécies contaminantes. como meio de infusão de cérebro e coração. etc. em fontes de carbono. os meios líquidos. Os meios de cultura são classificados quanto ao estado físico em sólidos.) de animais (carne. quando então são conhecidas as necessidades nutricionais específicas. De acordo com a finalidade bacteriológica ou micológica. quando emprega ingredientes com composição química não definida. Os meios de cultura podem ainda ser classificados quanto à procedência dos constituintes em naturais ou complexos. repiques de microrganismos. contudo. Baird-Parker (com gema de ovo) (meios ricos ou meios enriquecidos com as substâncias citadas).INTRODUÇÃO Até cerca de 1880 os microrganismos eram cultivados em meios líquidos. amido de tubérculos. não contêm agentes solidificantes. os quais permitiram o estudo de espécies isoladas (culturas puras). Os meios semi-sólidos contêm de 0. etc. Tendo em vista a ampla diversidade metabólica dos microrganismos. sintéticos ou ainda quimicamente definidos quando a composição química é conhecida (usados para trabalhos de pesquisa) e seus componentes servem para suprir as exigências nutritivas dos microrganismos. meio de carne cozida (com fragmentos de fígado . vitaminas. etc. a maioria das bactérias não metaboliza o ágar. Quanto à composição química podem ser simples (meios básicos) ou complexos. Especiais quando cumprem com as exigências vitais de determinados microrganismos. existem vários tipos de meios de cultura para satisfazerem as variadas exigências nutricionais.sulfato de ácido poligalacturônico. caseína. de modo a permitir o crescimento de microrganismos em tensões variadas de oxigênio ou a verificação da motilidade e também para conservação de culturas. dentre outros. energia. temperatura. ou seja. adicionado de sangue e aquecido a 80°C). nenhuma exigência em especial (Ex. quando contêm agentes solidificantes. Geralmente. O ágar é um polímero . para amostras que sofreram algum tipo de tratamento (térmico ou químico).

quando contêm substâncias que permitem estabelecer diferenças entre microrganismos muito parecidos. Dosagem .empregados para a determinação quantitativa da população microbiana (ágar de Contagem padrão em placas – PCA. indol. Seletivos .PDA. agar Baird-Parker para isolamento e diferenciação de cocos Gram positivos (sólidos). ágar Baird-Parker. meio Escola Paulista de Medicina – EPM.5% de cloreto de sódio. II – OBJETIVOS Familiarizar-se com técnicas de preparação e esterilização de meios de cultura sólidos e líquidos. Exemplo: meios com telurito de potássio (para isolamento de Corynebacterium diphtheriae). ágar triptona de soja. ágar sangue.meios que avaliam determinadas atividades metabólicas permitindo caracterização e identificação perfunctória ou presuntiva de muitos microrganismos (ágar tríplice açúcar e ferro. mas existem alguns que também podem inibir o crescimento de outros. garantem a viabilidade de microrganismos (ágar Sabouraud. Ex. caldo nitrato. tais como meio de Eosina Azul de Metileno – EMB (diferencial para coliformes). etc. permitindo o crescimento de outros. caldo ou ágar uréia. Esses meios têm a propriedade de estimular o crescimento de determinados microrganismos. Meios de triagem . ou seja. etc. ágar citrato. permitindo diferenciar as colônias (sólidos) dos microrganismos. Ágar sangue. ágar triptona de soja – TSA. meio Baird-Parker. meio semi-sólido. ágar simples. ágar Salmonella-Shigella (SS) e ágar MacConkey. meio com leite. lisina – MILi.Meios de Enriquecimento . para isolamento de Staphylococcus aureus. Diferenciais .). antibióticos e aminoácidos. etc. meio de sulfito indol motilidade.) Estocagem ou manutenção .) Identificação – utilizados na realização de provas bioquímicas e verificação de funções fisiológicas de organismos submetidos à identificação (meios Oxidação/Fermentação. A maioria deles é também diferencial.os que contêm substâncias que inibem o desenvolvimento de determinados grupos de microrganismos. meios com antibióticos para isolamento de diversos microrganismos (TSC. Contagem . ágar batata dextrose .utilizados para conservação de microrganismos no laboratório.empregados nas determinações de vitaminas. bem como microrganismos exigentes e fastidiosos. caldo triptofano. meios com sais biliares e verde brilhante para isolamento seletivo de Salmonella. além do preparo de pipetas e placas de Petri para posterior utilização. para fungos. 17 . etc). meios com 7. meio semi-sólido.quando proporcionam nutrientes adequados ao crescimento de microrganismos presentes usualmente em baixos números ou de crescimento lento. Caldo Tetrationato e Selenito-Cistina para cultivo de Salmonella sp (líquidos). Ágar MacConkey para a diferenciação de Enterobactérias. meio motilidade. de diluentes. Caldo Tioglicolato para Clostridium perfringens. SFP. etc.

2. Com auxílio de um bastão de vidro. porém se for necessário utilizar algumas substâncias termolábeis (por exemplo: uréia) ou que reajam com as substâncias dos meios (aminoácidos. Esterilizar o meio de cultura em autoclave a 121o C por 15 minutos. Sartorius). Em um béquer de 150 mL. Esterilizar o meio de cultura em autoclave a 121o C por 15 minutos. 2.III . 4. um béquer de vidro ou lata de alumínio). pesar 0.TSA) e adicionar 100 mL de água destilada. através de membranas (de nitrocelulose ou acetato de celulose) com poros de 0. as mesmas são esterilizadas à parte por filtração. 5 mL de solução para tubos de ensaio com tampa rosqueável (Atenção! Não fechar completamente as tampas dos tubos). 2. Aquecer em banho-maria (ou em chama de bico de Bunsen). protegendo-os com papel manilha ou kraft. Transferir. Acondicionar os tubos em um suporte adequado (por exemplo. Acondicionar os tubos em um suporte adequado (por exemplo. Após a esterilização. Em um Erlenmeyer ou outro recipiente apropriado de 250mL. Com auxílio de um bastão de vidro. assepticamente. Após esterilização.85% de NaCl) estéril 1. Preparação de meio de cultura sólido de uso geral 1. proteger o tampão com papel manilha ou Kraft (ou similar). 3. agitar até completa dissolução do meio e cultura. Adicionar tampão de algodão e gaze. 5. pesar quantidade necessária para o preparo de 100 mL de meio de cultura não seletivo (por exemplo: Ágar Padrão para Contagem – PCA ou Ágar Triptona de Soja . açúcares). 5 mL de caldo para tubos de ensaio com tampa rosqueável (Atenção! Não fechar completamente as tampas dos tubos). Preparação de meio de cultura líquido – caldo triptona e soja 1. 3. com auxílio de pipeta graduada. um béquer de vidro ou lata de alumínio). 18 . armazená-la em geladeira ou em lugar fresco. Preparação de solução fisiológica (0. com auxílio de proveta. C. 5. armazená-la em geladeira ou em lugar fresco.85 g de cloreto de sódio (NaCl) e adicionar 100 mL de água destilada. ao meio previamente esterilizado. Em um béquer de 250 mL. Transferir. até completa dissolução do meio de cultura (o meio torna-se translúcido). agitando freqüentemente com auxílio de bastão de vidro. e depois incorporadas. 4.PROCEDIMENTOS A. Esterilizar o meio de cultura em autoclave à temperatura de 121o C por 15 minutos. pesar quantidade necessária para o preparo 50 mL de caldo triptona e soja – TSB e adicionar 100 mL de água destilada. com auxílio de pipeta graduada. Após esterilização. 5. armazenar o meio de cultura em geladeira (ou em lugar fresco e ao abrigo da luz). 3. 4.22 m de diâmetro (Millipore. Observação: Alguns meios de cultura são preparados da mesma forma. protegendo-os com papel manilha ou kraft. agitar até completa dissolução. B.

De acordo com orientação de seu professor. Cite o nome de um meio de cultura utilizado na manutenção de culturas bacterianas. como os meios de cultura são classificados? 2. Esterilizar este material em estufa a 180o C por 1 hora ou em autoclave a 121o C por 15 minutos (neste caso. De acordo com o estado físico. 3. Preparação de pipetas e placas de Petri para esterilização 1. armazená-lo em lugar seco. 4.D. embrulhar 4 placas de Petri e 5 pipetas graduadas de 2 mL em papel manilha (ou similar). Por que o tempo de esterilização é maior em estufa a 180ºC do que em autoclave a 121ºC? 19 . o material deverá ser seco em estufa antes de ser utilizado). 3. 2. IV – Questões para fixação de conhecimento 1. Cite dois exemplos de meios de cultura que sejam simultaneamente seletivos e diferenciais. Após esterilização.

15 minutos). 13. indicando que o ar quente foi expulso e a câmara está saturada de vapor. Com auxílio de luvas de cano longo retirar da câmara o material esterilizado. Adicionar água limpa e em quantidade suficiente à autoclave. de acordo com as normas de segurança. resistência para aquecimento da água e geração de vapor 20 . levantar a tampa. 12. 4. Fechar a autoclave através de suas presilhas de segurança. Abrir cuidadosamente a tampa da autoclave. através de calor úmido (vapor d’ água). Assim que o vapor começar a sair pela mangueira. desligar o equipamento. exigindo muito cuidado e atenção durante sua operação. Ligar a autoclave. 6. 11. 3. Atenção!!! Não deixar que haja oscilação da pressão e temperatura! Posicionar o contra-peso (situado na tampa da autoclave) para frente para diminuir a pressão ou para trás para aumentar a pressão. 8. cesto. b. Observar o manômetro/termômetro e aguardar até atingir a pressão e a temperatura desejadas (geralmente: 1 atm e 121ºC. Funciona sob altas pressões e temperaturas. Com auxílio de luvas de cano longo.Autoclave vertical. como meios de cultura e instrumentação cirúrgica. a. abrir a válvula (situada na tampa) para que haja saída total do vapor. Figura 8 . A figura II – OBJETIVOS Demonstrar o funcionamento de uma autoclave vertical elétrica e manual. Colocar o cesto contendo o material a ser autoclavado (distribuir adequadamente os recipientes de maneira a permitir que o vapor permeie todos eles). Abrir todas as presilhas de segurança e finalmente. fechar a válvula. Aguardar que a temperatura decaia para 100º C (ou menor). Assim que se atingirem pressão e temperatura desejadas. 9. Após o tempo de esterilização. reduzir a velocidade de aquecimento e marcar o tempo de esterilização (geralmente. Deixar a válvula (situada na tampa da autoclave) aberta até perceber a saída de vapor condensado. a. 14. b.PROCEDIMENTO 1. 2. 5.ESTERILIZAÇÃO DE MATERIAIS EM AUTOCLAVE I – INTRODUÇÃO A autoclave é um equipamento bastante empregado na esterilização de materiais. 10. deixando o botão de controle de velocidade de aquecimento no máximo. 7. III . respectivamente).

gram) das colônias submetidas à coloração. 2 . 4. nariz e. Com as placas restantes. 2. saguão. etc) durante 15 minutos.ESTUDO DA CONTAMINAÇÃO AMBIENTAL E DA MICROBIOTA HUMANA 1 .OBJETIVOS 1. Fazer o mesmo em outro tipo de superfície. 5. elevador. superfície das mãos. região inferior da unha. com diferentes tamanhos. cor. Soprar. Aplicar as técnicas de manobras assépticas. Tocar suavemente a extremidade dos dedos na superfície dos meios de cultura.PROCEDIMENTOS 1. Expor uma placa com o meio de cultura solidificado em um local de sua preferência (laboratório. superfícies e ar. Incubar as placas a 35º C por 48 horas. espalhá-lo na superfície do ágar (cuidado para não romper o ágar!). Observar a presença de diferentes colônias na superfície dos meios de cultura. Aguardar a solidificação dos meios de cultura nas placas. 3. 2. em seguida. IV – Questões para fixação de conhecimento 1. Quais os cuidados que devem ser observados durante a distribuição de meio de cultura estéril nas placas de Petri? 2. Expor as placas abertas ao fluxo de saída de ar de um aparelho de ar-condicionado por alguns segundos. unhas sobre os meios de cultura. aspectos. espalhá-lo na superfície dos meios de cultura. Selecionar algumas colônias para serem submetidas à coloração de Gram. tossir ou espirrar sobre a superfície dos meios. Verificar a presença de microrganismos em partes do corpo humano. Depositar alguns fios de cabelo. arranjo. Observar os diferentes tipos de bactérias e fungos. retirar material de partes do corpo humano: saliva. em seguida. (Atenção! Realizar esta etapa de distribuição dos meios de cultura na “zona de segurança” da chama do bico de Bunsen para evitar contaminação). Descrever as características (morfologia. Com auxílio de um swab. III – INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS 1. rampa. 2. Qual técnica pode ser empregada para se estimar o grau de contaminação microbiana presente em um ambiente? Como esta técnica é denominada? Quais suas vantagens e limitações? 21 . Verter o meio de cultura “ágar de contagem padrão” ou ágar triptona de soja previamente fundido em banho-maria em placas de Petri estéreis. ouvido. língua. 4. realizar algumas das seguintes opções: Friccionar um swab previamente umedecido em solução salina estéril na bancada e. 3.

ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DE ÁGUA ONT I – INTRODUÇÃO Entende-se por água potável a água para consumo humano cujos parâmetros microbiológicos. físicos.PROCEDIMENTOS a) Seleção e preparação dos frascos para coleta das amostras de água Utilizar frascos com tampas à prova de vazamentos. apresentado na Tabela abaixo: Padrão microbiológico de potabilidade da água para consumo humano PARÂMETRO Água para consumo humano (2) (3) VMP (1) Escherichia coli ou coliformes termotolerantes Água na saída do tratamento Coliformes totais Ausência em 100mL Ausência em 100mL Água tratada no sistema de distribuição (reservatórios e rede) Escherichia coli ou coliformes termotolerantes Coliformes totais (3) Ausência em 100mL Sistemas que analisam 40 ou mais amostras por mês: Ausência em 100mL em 95% das amostras examinadas no mês. 22 . dentre outras. de 25 de março de 2004. autoclaváveis ou pré-esterilizados. Sistemas que analisam menos de 40 amostras por mês: Apenas uma amostra poderá apresentar mensalmente resultado positivo em 100mL. de material aprovado para contato com água destinada ao consumo humano e. químicos e radioativos atendam ao padrão de potabilidade e que não ofereça riscos à saúde (BRASIL. minas. III . nascentes. comercialmente disponíveis. 2004). II – OBJETIVOS Avaliar a qualidade microbiológica de amostras de água de abastecimento e de água mineral. incluindo fontes individuais como poços. (2) água para consumo humano em toda e qualquer situação. de preferência. 2004). A água potável deve estar em conformidade com o padrão microbiológico estabelecido pela Portaria nº518. do Ministério da Saúde (BRASIL. Podem-se também empregar recipientes descartáveis (sacos plásticos) previamente esterilizados. NOTAS: (1) Valor Máximo Permitido. (3) a detecção de Escherichia coli deve ser preferencialmente adotada.

desinfetar o bocal com etanol 70% e. é um procedimento que objetiva estimar o número de bactérias heterotróficas na água. Contagem de heterotróficos. Desprezar o volume inicial e coletar a amostra em um frasco estéril.Água de torneira ou tubulações: limpar a área externa da saída com etanol 70%.Água mineral engarrafada: deve ser coletada na embalagem original. etc) devem ser previamente esterilizados em autoclave ou estufa de esterilização ou mergulhados em etanol 70% e flambados no momento do uso. numa superfície plana.plaqueamento em profundidade (“pour plate”) Também conhecida como contagem padrão em placas. com as portas e janelas do laboratório fechadas. 1. deve-se homogeneizar todo o conteúdo. Após a solidificação. preferencialmente. a partir de embalagens de maior capacidade. em movimentos na forma de oito ou em movimentos circulares. 8 a 10 vezes no sentido horário e 8 a 10 vezes no sentido anti-horário. Amostras de água clorada devem ter o cloro totalmente neutralizado imediatamente após a coleta. inverter as placas e incubar a 35o C por 48 horas.assepticamente. no caso de águas tratadas. facas. adicionar 1 mL e 0. chama azulada. Se não houver fluxo laminar. c) Métodos de análise de água I.1 mL de solução de tiossulfato de sódio a 1. 2. pinças. A abertura e a retirada da unidade analítica devem ser feitas. 23 . deixar a água fluir por 2 a 3 minutos. 3. espátulas. Havendo necessidade de coletar volumes menores. flambar. 0. lacrada. Misturar o inóculo com o meio de cultura movimentando suavemente as placas. particularmente como uma ferramenta para acompanhar variações nas condições de processo.8% para cada 100 mL de água que se pretende coletar. Incubação: aguardar a completa solidificação do meio de cultura. deve-se submeter metade à análise. deve-se trabalhar na região próxima à chama do bico de Bunsen de tamanho médio. abrir o lacre com uma faca ou tesoura estéril ou flambada. no interior de câmaras de fluxo laminar. 15 a 20 mL de ágar padrão para contagem (PCA). antes da esterilização. Se a quantidade de amostra encaminhada para análise for menor do que a unidade analítica requerida. Todos os instrumentos e utensílios empregados na abertura das embalagens e retirada das unidades analíticas (tesouras. distribuindo as placas numa superfície plana. se o material for resistente ao calor. para prevenir qualquer contaminação da amostra. Para tal. adicionar ao frasco de coleta. b) Abertura das embalagens e tomada da unidade analítica: antes de abrir as embalagens deve-se desinfetar a área externa com etanol 70%. Inoculação: através de pipeta estéril.1 mL da amostra de água em placas de Petri vazias estéreis. reservando a outra metade como contra-amostra. no caso das águas minerais. Adição do meio de cultura: verter nas placas inoculadas. permitindo ainda verificar as condições higiênicas em diferentes pontos da rede de distribuição. previamente fundido e resfriado a 45o C. para remoção dos contaminantes presentes. invertendo a embalagem várias vezes. para evitar correntes de ar.Procedimento para coleta: . ou a eficiência das diversas etapas de tratamento. .

Atualmente. sua quantificação em água e alimentos é menos representativa. sabe-se. como indicação de contaminação fecal do que a enumeração direta de E. A não ocorrência gás após 48 h. Enterobacter e Klebsiella.5o C. coli. Por este motivo. a presença de coliformes fecais em água e alimentos é menos representativa. reincubar até completar 48 horas e repetir a leitura. transferir uma alçada bem carregada de cultura para tubos de caldo Verde brilhante (VB). II. Esta definição objetivou. não esporogênicos. aeróbias ou anaeróbias facultativas. O grupo inclui cerca de 20 componentes. coli. passar aos itens subseqüentes. 2. Por essa razão. II. Em caso positivo. capazes de fermentar a lactose com produção de gás em 24 a 48 horas a 35o C. Com uma pipeta de 10 mL estéril. Incubar os tubos a 35 oc por 24 a 48 h e observar se há crescimento com produção de gás. em princípio. passando para os itens subseqüentes. Em caso negativo. Escherichia. em um contador de colônias.2. restringindo-se aos membros capazes de fermentar a lactose com produção de gás. como também diversos gêneros e espécies não entéricas. Anotar o número de tubos de VB com gás e determinar o Número Mais Provável (NMP) de coliformes totais/50mL em tabela de NMP apropriada às diluições inoculadas (Tabela 1). do que a quantificação de coliformes fecais ou de E. na apresentação dos resultados. Confirmação de coliformes totais: 1. selecionar apenas os coliformes originários do trato intestinal.1. Usar notação exponencial e apenas uma casa decimal depois da vírgula. Teste presuntivo: 1. dada a alta incidência de E. Grupo dos coliformes termotolerantes: a definição é a mesma dos coliformes totais. Número Mais Provável de Coliformes Totais e Termotolerantes – Técnica dos Tubos Múltiplos Introdução Grupo dos coliformes totais: este grupo inclui as bactérias na forma de bastonetes Gram negativos. A partir de cada tubo positivo no item anterior. como Serratia e Aeromonas. Incubar os tubos a 35o C/24h e observar se há crescimento (turvação) com produção de gás. em 24 horas a 45. 2. porém. dentre os quais encontram-se tanto bactérias do trato intestinal de humanos e de outros animais de sangue quente. dos quais dois (Enterobacter e Klebsiella) incluem cepas de origem não fecal. adicionar 5 porções de 10 mL em 5 tubos contendo 10 mL de caldo lauril sulfato triptose (LST) em concentração dupla com tubo de Durhan. Calcular o UFC por mL da amostra multiplicando o número de colônias pelo inverso da diluição inoculada.Contagem as colônias e cálculo dos resultados: selecionar as placas com 30 a 300 colônias e contar as colônias com o auxílio de uma lupa. UFC/mL = No de colônias/diluição II. 24 . coli no grupo fecal. entretanto que o grupo dos coliformes fecais inclui pelo menos três gêneros. como indicação de contaminação fecal. porém muito mais significativa do que a presença de coliformes totais. em caso de crescimento com produção de gás. indica ausência de coliformes (totais ou fecais) nos 50 mL de amostra. confirmativo de coliformes totais.

5o C por 24 h e observar se há crescimento com produção de gás. Os procedimentos para coleta de amostras de água mineral e de água de torneira ou de tubulações são exatamente os mesmos? Por quê? 3. 4. II. Número de tubos positivos 1 2 3 4 5 Fonte: SILVA et al. A partir de cada tubo positivo de LST (item II.2 IV – Questões para fixação de conhecimento 1. 2. através da técnica de semeadura em profundidade (pour plate) em ágar padrão para contagem (PCA). 5.1mL de água mineral foi inoculada. em duplicata. Expresse o resultado em UFC de heteroróficos por mL de água analisada. 2. Expresse os resultados em NMP de coliformes/100mL de amostra. IVIIV .V NAÇÃO 25 . para diversas combinações de tubos positivos e negativos na inoculação de 5 alíquotas de 10 g ou 10 mL da amostra por tubo. Anotar o número de tubos de EC com gás e determinar o NMP de coliformes fecais/50mL em uma tabela de NMP apropriada às diluições inoculadas (Tabela1). encontraram-se: a) 4 tubos de caldo verde brilhante turvos e com gás b) 3 tubos de tubos de caldo EC turvos e com gás. Uma alíquota de 0.2 2. confirmativo de coliformes termotolerantes. A não ocorrência de gás após 24 h indica ausência de coliformes termotolerantes na amostra.1) transferir uma alçada bem carregada da cultura para tubos de caldo EC.4 7. (2005) NMP/50mL < 2. Número Mais Provável (NMP) . 3. As contagens de UFC em cada uma das placas foram: 68 e 77.3. Incubar os tubos a 45. empregando-se 5 tubos. seguido de incubação a 35-37ºC por 48 horas. A não ocorrência de gás após 48 h de incubação indica ausência de coliformes totais na amostra.3. Explique como os microrganismos coliformes são classificados em nível laboratorial. Confirmação de coliformes termotolerantes: 1.2 10.2 4.nível de 95% de probabilidade. Em uma análise de coliformes em água pela técnica do Número Mais Provável.

coli utiliza ßglucuronidase para metabolizar MUG e criar fluorescência.COLILERT Incolor: frasco com 100 mL de amostra de água. Interpretação dos resultados . Juma vez que a maioria dos não coliformes não conta com estas enzimas.DETECÇÃO DE COLIFORMES EM ÁGUA – MÉTODO CROMOGÊNICO ONT ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DE ÁGUA Essa metodologia emprega substratos cromogênicos e fluorogênicos para detecção simultânea de coliformes totais e de Escherichia coli. eles não podem se reproduzir e interferir. coli. eles utilizam ß-galactosidase para metabolizar o indicador de nutriente ONPG e alterá-lo de incolor para amarelo. AMBIENTAL 26 . abordagem diminui a incidência de falso-positivos e falso-negativos. Basta adicionar o reagente à amostra de água e incubar a 3537ºC por 18 a 48h (até 24h para COLILERT – da IDEXX e até 48 h para COLITEST – LKP Diagnósticos). Os poucos não coliformes que têm estas enzimas são seletivamente suprimidos pela matriz especificamente formulada do Colilert. Amarelo: teste positivo para presença de coliformes totais. Amarelo/Fluorescência azul: teste positivo para presença de E. À medida que os coliformes se reproduzem no Colilert. E.

incubando-o a 37ºC por 18-48h 3) Interpretação dos resultados: 27 .Passos para uso do COLITEST: 1) Coletar a amostra de água até a marca de 100mL 2) Adicionar o meio de cultura COLItest.

. R. 2006. 2005. JUNQUEIRA. A. 3. N. N. 2000. 28 . bacterias e fungos . R. N. 239 p. C. 164 p. A. Práticas de microbiologia. ed. São Paulo: Varela. F. N. JUNQUEIRA.. rev. S.. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan. F. C. 536 p VERMELHO.. M. C. CANTÚSIO NETO.REFERÊNCIAS RIBEIRO. V. M. Microbiologia pratica: roteiro e manual. SILVEIRA. SILVA. 112p. 2007. M. e atual São Paulo. V. da. B. SP: Livraria Varela. da. SP: Atheneu. A. A. Manual de métodos de análise microbiológica da água. SILVA. A. Manual de métodos de análise microbiológica de alimentos. SOARES. SILVEIRA. São Paulo.

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