AULA 14

IDENTIFICAO BIOQUMICA DE LEVEDURAS

1. OBJETIVOS
1. Reconhecer uma levedura usando caractersticas bioqumicas;
2. Compreender os fundamentos do auxanograma e do zimograma na identificao das
leveduras.

2. TEORIA

As leveduras crescem notavelmente em forma unicelular e se reproduzem por fisso,

brotamento ou a combinao de ambos.
A identificao destes fungos baseada na combinao de critrios morfolgicos e
bioqumicos. A morfologia primeiramente usada para estabelecer o gnero (como
aprendemos na aula passada), ao passo que as assimilaes bioqumicas so usadas para
diferenciar as vrias espcies.
As principais caractersticas e testes de identificao de leveduras so:
1 Caractersticas da cultura: cor da colnia, forma e textura;
2 Estruturas assexuais:
a) Forma e tamanho das clulas;
b) Brotamento uni ou multipolar, ou fisso bipolar;
c) Ausncia ou presena de artrocondio, blastocondio, tubos germinativos,
hifas, pseudohifas ou esporngios.
3 Estruturas sexuais: arranjo, ornamentaes da parede celular, nmero, forma e
tamanho dos ascsporos e basidisporos.
4 Estudos fisiolgicos:
a) Assimilao de carbono e de nitrognio
b) Fermentao de acares
c) Hidrlise da ureia
As provas fisiolgicas mais comuns e mais simples para identificao de Candida
albicans e Candida sp so: tubo germinativo e filamentao em cultivo em lmina, j realizados
na aula passada.
No cultivo em lmina, avalia-se a capacidade de produo de hifas hialinas ramificadas
que podem se fragmentar em esporos, denominados artrocondios. Estas hifas ocorrem nos
gneros Geotrichum e Trichosporon. Caso a levedura forme hifas hialinas ramificadas sem
fragmentao, provavelmente pertence ao gnero Candida e se houver formao de
clamidsporos caractersticos, Candida albicans.
A pesquisa de cpsula, caracterstica marcante do gnero Cryptococcus feita com
uma gota de tinta nanquim e uma alada da cultura. A cpsula, constituda de material
polissacardico, aparece como um halo claro ao redor dos blastocondios de Cryptococcus e
contrastam com o fundo negro da lmina.

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 O esquema abaixo prope um fluxo para identificao das principais leveduras de
interesse mdico. Se as provas no conduzirem identificao presuntiva do gnero, provas
de assimilao de fontes de carbono e nitrognio (auxanograma) e fermentao de
carboidratos (zimograma) devem ser realizadas e interpretadas segundo tabelas existentes na
bibliografia recomendada ao final deste captulo. Um exemplo simplificado a Tabela 1.

Esquema simplificado para identificao de alguns gneros de leveduras

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3. PROCEDIMENTO

3.1 Prova de Assimilao de Fontes de Carbono e Nitrognio (Auxanograma)

A atividade bioqumica dos fungos estudada para a identificao de espcies de

Candida sp, utilizando-se o mtodo de auxanograma, que indica a capacidade de o
microrganismo assimilar carbono e nitrognio.
A assimilao de carboidratos a habilidade que uma levedura tem de crescer
aerobiamente na presena de determinado carboidrato fornecido como nica fonte de
energia. A prova pode ser realizada em meio basal lquido ou slido.
A assimilao em meio slido ou tcnica auxanogrfica emprega meios de gar
destitudo de qualquer fonte de carbono, adicionado da suspenso de levedura e distribudo
em placa. Aps solidificao, so aliquotados os carboidratos sobre o gar. A positividade
avaliada atravs da observao do halo de crescimento da levedura em presena do
carboidrato fornecido.
A assimilao em meio lquido, tcnica que por convenincia vamos utilizar em nossa
aula prtica, emprega um meio de cultura denominado Yeast Nitrogen Base, em que h
disponibilidade da fonte de nitrognio para as leveduras, mas no de carbono. As fontes de
carbono so acrescidas posteriormente, por filtrao, e aps incubao por 24-48 h, a 30oC,
ser avaliada a capacidade das leveduras terem assimilado as diferentes fontes de carbono
fornecidas.

3.1.1 Assimilao de Carbono (meio lquido)

Procedimento:

O meio pronto Yeast Nitrogen Base foi preparado numa concentrao 10X,
suspendendo 6,75 g do meio desidratado em 100 mL de gua destilada e assegurar sua
dissoluo completa. Esterilizar por filtrao e armazenar em geladeira at o momento do uso.
O meio final feito pipetando-se 5 mL do meio 10X concentrado em 45 mL de gua destilada
estril. Distribuir assepticamente 3 mL deste meio em tubos de ensaio estreis.

Aos tubos contendo 3 mL de meio Yeast Nitrogen Base foram adicionados 1 mL de uma
das solues de carboidrato a 6%, sendo cada uma destas solues tambm esterilizadas por
filtrao. Foram utilizadas as seguintes solues de carboidratos: Sacarose, Maltose, Lactose,
Trealose, Rafinose e Xilose.

Em cada tubo da prova de assimilao, adicionar 200 L de suspenso de levedura na

escala 5 de Mac Farland. O resultado positivo da prova de assimilao verificado pela
viragem do indicador azul de bromotimol para amarelo, indicando que o pH do meio ficou
cido.

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 3.1.2 Assimilao de carbono (meio slido)

Procedimento:

1. Toma-se placa de petri esterilizada de 150 x 15 mm e, com o auxlio de uma caneta

para vidro, numera-se a mesma de modo a guiar a posterior distribuio dos
acares.
2. Prepara-se suspenso de levedura jovem (24 a 48 h) em 2 mL de gua destilada
esterilizada, ajustando a turbidez de acordo com o padro de nmero 5 da escala
de Mac Farland.
3. O meio Yeast Nitrogen Base ou meio C previamente preparado de acordo com
as instrues do fabricante e armazenados em erlenmeyers de 100 mL, contendo
40 mL do meio, acondicionados a 4oC.
4. No momento do uso, os erlenmeyers contendo o meio C so fundidos em
banho-maria a 100oC e, a seguir, resfriados at a temperatura de 50 oC em banho-
maria a esta temperatura.
5. Aps a estabilizao da temperatura do meio C, 2 mL da suspenso da levedura
so adicionados aos 40 mL do meio e vertidos em placa de petri esterilizada de 150
x 15 mm. A seguir devem ser feitos suaves movimentos de rotao da placa com a
finalidade de homogeneizar o inculo.
6. Quando o meio encontra-se solidificado, a placa disposta sobre a cartela guia,
onde se encontram escritos os nomes dos acares que sero distribudos, de
acordo com a numerao previamente disposta na placa.
7. Pequenas alquotas dos carboidratos so distribudas equidistantemente sobre o
gar, com o auxlio de esptulas esterilizadas. Deve-se utilizar uma esptula para
cada fonte de carbono, no intudo de evitar contaminao e, consequentemente,
resultados falso-positivos.
8. A procedncia dos acares, sua pureza e condies de armazenamento so
importantes, sendo interessante a revalidao peridica da qualidade dos
carboidratos utilizados.
9. As placas so incubadas a 25 30oC, durante 24 96 h, com a face que contm os
acares voltada para cima.
10. A leitura realizada diariamente, sendo a positividade observada atravs do
surgimento de halo de crescimento na rea correspondente a cada fonte de
carboidrato. O exame da placa contra a luz permite melhor observao dos halos
de crescimento.
11. Uma vez que todas as leveduras assimilam a dextrose, esse carboidrato
considerado controle positivo para avaliar a viabilidade do inculo da levedura.

Os resultados so comparados a tabelas existentes na bibliografia recomendada e um

exemplo simplificado consta na Tabela 1.

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 Tabela 1 - Identificao das principais leveduras de interesse mdico

3.1.3 Assimilao de nitrognio

A assimilao de nitrognio a habilidade que uma levedura tem de crescer

aerobicamente na presena de um composto nitrogenado fornecido como nica fonte de
energia.
Essa prova tambm pode ser realizada em meio basal lquido ou slido, semelhana
da assimilao de carboidratos. A assimilao de fontes nitrogenadas em meio slido ou
tcnica auxonogrfica emprega meio de gar destitudo de qualquer fonte de nitrognio,
adicionado da suspenso da levedura e distribudo em placa. Aps a solidificao so
aliquotados compostos nitrogenados sobre o gar. A positividade avaliada atravs do
crescimento da levedura em presena do composto nitrogenado fornecido. Geralmente
empregam-se a peptona (controle positivo) e o nitrato de potssio como fontes de nitrognio,
mas outros compostos podem ser utilizados.

Procedimento:

1. Numera-se, com caneta de retroprojetor, a superfcie externa da placa de Petri

esterilizada, de 90 x 15 mm, onde ser depositado o meio.
2. Prepara-se a suspenso da levedura jovem (24 a 48 h) em 1 mL de gua destilada
esterilizada, ajustando a turbidez de acordo com o padro n o 5 da escala de Mac
Farland.

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 3. O meio Yeast Carbon Base ou meio N previamente preparado de acordo com
as instrues do fabricante e armazenado em tubos de 20 x 200 mm, contendo 20
mL do meio, acondicionados a 4oC.
4. No momento do uso, os tubos contendo meio N so fundidos em forno micro-
ondas e, a seguir, resfriados at a temperatura de 50 oC em banho Maria.
5. Aps a estabilizao da temperatura do meio N, 1 mL da suspenso de levedura
adicionado a 20 mL do meio, sendo esta mistura vertida em placa de petri
esterilizada, de 90 x 15 mm. A seguir devem ser feitos movimentos suaves de
rotao da placa, com a finalidade de homogeneizao do inculo.
6. Quando o meio se encontrar solidificado, a placa disposta sobre cartela guia,
onde se encontram escritos os nomes as fontes de nitrognio que sero
distribudas de acordo com a numerao previamente disposta na placa.
7. Pequenas alquotas das fontes de nitrognio so distribudas equidistantemente
sobre o gar, com o auxlio de esptulas esterilizadas.
8. O controle de qualidade das fontes de nitrognio deve seguir os mesmos princpios
descritos previamente para as fontes de carbono.
9. As placas so incubadas a 25-30oC, durante 24 96 h, com a face que contm o
meio com as fontes de nitrognio voltada para cima.
10. A leitura segue a mesma metodologia referida para a assimilao do carbono.

3.2 Fermentao de Acares (Zimograma)

A capacidade de uma levedura fermentar determinado carboidrato est diretamente

ligada habilidade desta de possuir sistemas enzimticos eficientes capazes de permitir, em
baixas tenses de oxignio, degradar acares para produo de energia, formando, entre
outros metablitos, etanol e gs carbnico.
Assim, utiliza-se tambm na identificao das leveduras essa caracterstica fenotpica,
onde se investiga a habilidade que uma determinada levedura possui de fermentar um acar,
atravs da demonstrao da produo de CO2.

Material:
Acares:
Glicose, sacarose, maltose, lactose, rafinose, trealose.
Preparar soluo a 6% de cada acar em gua destilada e esterilizar por filtrao.
Acondicionar em frascos estreis, em geladeira.

Meio de cultura:
Azul de bromotimol ...................... 0,03 g
Extrato de levedura ........................ 2,7 g
Peptona ..........................................4,5 g
gua destilada ............................. 600 ml
Etanol a 95% .................................1,8 ml

Dissolver o extrato de levedura e a peptona em gua destilada. Separadamente

dissolver completamente o azul de bromotimol em etanol. Adicionar o azul de bromotimol

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dissolvido mistura inicial e homogeneizar. Distribuir 3 ml do meio em tubos de ensaio com
tampa rosquevel contendo um tubo de Durhan na posio invertida. Autoclavar a 121oC, por
15 minutos. Deixar resfriar. Adicionar a cada tubo, 1,5 ml de uma das solues de acares.
Estocar a 4oC.

Procedimento:

1. Prepara-se suspenso de levedura em 1,2 mL de gua destilada esterilizada,

ajustando a turbidez de acordo com o padro 5 da escala de Mac Farland.
2. O meio de cultura utilizado pode ser adquirido comercialmente ou preparado no
prprio laboratrio. O meio basal aliquotado em 6 pores iguais, sendo cada
uma delas acrescida da soluo do carboidrato a ser utilizado. As solues dos
respectivos carboidratos so distribudas em tubos de ensaio de 125 x 10 mm,
identificados com a inicial do carboidrato em alquotas de 4 mL. Em cada tubo
deve ser colocado, previamente preparao do meio, um tubo de Durham
invertido. O meio de fermentao deve ser armazenado a 4oC.
3. Com o auxlio de uma pipeta Pasteur ou pipetador automtico, inoculam-se 200 L
da suspenso de levedura em tubos de ensaio contendo cada um deles, 4 mL do
meio de fermentao, tubo de Durham e o respectivo carboidrato a ser estudado:
dextrose, maltose, sacarose, galactose, lactose ou trealose.
4. Os tubos so incubados a 25 30oC, durante, no mximo, 28 dias, sendo a leitura
realizada aps 24-48h e, subsequentemente, a cada 5 dias, agitando-se o tubo e
observando-se a produo de gs (formao de bolha no interior do tubo de
Durham).

REFERNCIA
SIDRIM, J.J.C. and MOREIRA, J.L.B. Fundamentos clnicos e laboratoriais da micologia mdica.
Guanabara-Koogan, Rio de Janeiro, 1999.

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AULA 14 ___________________________________________Relatrio de aula prtica
Identificao de leveduras: auxanograma e zimograma
Nome:_____________________________________________ Data: __ / __ /____
Membros do Grupo ( ): __________________________________________________
Objetivos:
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Materiais:
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Procedimento:
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Resultado:

1. Auxanograma

Apresente aqui os resultados obtidos com a amostra de levedura de seu grupo:

1.1 Assimilao de carbono

Acares
Identificao
da Levedura Sacarose D- Maltose Lactose Trealose Xilose Rafinose

1.2 Assimilao de Nitrognio

Fonte de Nitrognio
Identificao da Levedura Orgnica Inorgnica
Peptona Nitrato de Sdio

1.3 Fermentao de carboidratos

Identificao Acares
da Levedura Glicose Sacarose Maltose Lactose Trealose Rafinose

Questes:

1 Qual o objetivo da prova de assimilao de carbono?

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2 Qual a diferena entre as provas de utilizao de carboidratos do auxanograma e do

zimograma?

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Referncias:

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