DISCIPLINA DE BROMATOLOGIA

CURSOS: CIÊNCIA E TECNOLOGIA DE ALIMENTOS e NUTRIÇÃO

Prof. Dr. Tiago André Kaminski

MATERIAL AUXILIAR PARA AULAS PRÁTICAS

Última atalização: maio de 2017

SUMÁRIO

PRÉ-SECAGEM .............................................................................................................. 5

DETERMINAÇÃO DA UMIDADE ............................................................................... 6

DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DE ÁGUA ......................................................... 10

DETERMINAÇÃO DE AÇÚCARES REDUTORES PELO MÉTODO DE LANE &

EYNON ............................................................................................................................ 12

DETERMINAÇÃO DE AMIDO ..................................................................................... 15

DETERMINAÇÃO DA FIBRA BRUTA ........................................................................ 17

DETERMINAÇÃO DE FIBRA PELO MÉTODO ENZIMÁTICO ................................ 20

DETERMINAÇÃO DA FRAÇÃO EXTRATO ETÉREO PELO MÉTODO DE

SOXHLET ........................................................................................................................ 24

DETERMINAÇÃO DE LIPÍDIOS PELO MÉTODO DE BLIGH & DYER ................. 26

DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNA BRUTA PELO MÉTODO DE KJELDAHL ........ 28

DETERMINAÇÃO DE ÁCIDO ASCÓRBICO EM SUCOS PELO MÉTODO

INTERLAB X-1 ............................................................................................................... 32

DETERMINAÇÃO DA FRAÇÃO CINZAS ................................................................... 34

TABELA DE COMPOSIÇÃO CENTESIMAL............................................................... 36

 INTRODUÇÃO

Os procedimentos apresentados são metodologias físico-químicas extensamente utilizadas

na análise de alimentos.
Estes procedimentos são baseados nas recomendações do Instituto Adolfo Lutz (2008) e
Association of Official Analytical Chemists (2000), exceto quando citada outra fonte.
Na maioria das aulas práticas, as metodologias serão adaptadas ao tempo de aula e às
condições do laboratório. Mais considerações sobre os procedimentos adotados e recomendações
oficiais serão feitas no decorrer das aulas práticas.

ANÁLISE DE ALIMENTOS

A análise de alimentos é realizada com finalidade de:

 Controle de qualidade de rotina

Principalmente nas indústrias de alimentos, durante o recebimento de matérias-primas,
monitoramento do armazenamento, produção e avaliação do produto final.

 Fiscalização
Realizada por órgãos de controle e pesquisa para verificar o cumprimento da legislação em
relação aos alimentos comercializados através de métodos analíticos, exatos e precisos e,
obviamente, oficiais.

 Pesquisa
Realizada no intuito de desenvolver ou adaptar métodos analíticos exatos, precisos,
sensíveis, rápidos, eficientes, simples e de baixo custo na determinação dos componentes
dos alimentos.
Também é pré-requisito para confirmação da qualidade e viabilidade dos alimentos
avaliados e/ou desenvolvidos.

 Rotulagem nutricional
Exigida pela legislação (RESOLUÇÃO RDC n°360, de 23 de dezembro de 2003).

AMOSTRAGEM E PREPARO DA AMOSTRA PARA ANÁLISE

 Amostra
É uma porção limitada de material, selecionada de maneira que seja representativa das
características essenciais do todo.
A validade dos resultados de uma análise depende da representatividade da amostra.
A amostra ideal é idêntica em todas as suas propriedades ao todo do qual foi tomada.

 Amostragem
Processo que consiste numa série sucessiva de etapas visando a representatividade da
amostra. Compreende três etapas principais:

1- Coleta da amostra bruta (amostragem grosseira)

A amostra bruta deve ser uma réplica, em ponto reduzido do todo, tanto na distribuição

2
como na composição.
Amostras diferem quanto às propriedades físicas, o que implica em diferentes modos de
coleta.

2 - Redução da amostra bruta (nova amostragem)

A amostra bruta é frequentemente grande demais para o trabalho de análise laboratorial,
devendo ser reduzida. Esta redução varia com o tipo de produto a ser analisado.

3 - Preparo da amostra para análise

A possibilidade de contaminações e mudanças no comportamento da amostra durante o
preparo para análise deve ser considerada.
O tipo de preparo depende das características da amostra e do método analítico envolvido.
Para extração de um componente da amostra, muitas vezes é necessária uma preparação
prévia para alcançar uma extração eficiente do componente em estudo.

A maioria dos alimentos apresenta normas e recomendações de amostragem descritas em

legislações específicas. Na pesquisa científica, a amostragem tem sua representatividade garantida,
além da homogeneização, pelo número de tratamentos e repetições.

 Preservação da amostra
O ideal seria analisar as amostras em estado fresco e o mais rapidamente possível. Como
isto nem sempre isso é possível, a amostra deve ser preservada para fins de repetição das análises
quando os resultados não forem conclusivos ou quando contestados.
As maneiras mais relevantes de preservar a amostras são:
 Inativação enzimática (preservação do estado original dos componentes)
 Diminuição das alterações lipídicas (principalmente oxidação)
 Controle da oxidação dos componentes
 Controle do ataque microbiológico
 Manutenção da umidade (a amostra não deve perder nem ganhar umidade)

 Armazenamento da amostra

Acondicionamento - Deve prevenir qualquer tipo de alteração nas amostras, considerando:

- Estado físico do produto
- Tipo de análise a ser realizada
- Características individuais da amostra

Lacragem – Serve para evitar qualquer alteração no conteúdo da embalagem. Amostras oficiais e
legais devem ser lacradas de tal maneira que não possam ser abertas sem quebrar/romper lacres.

Rotulagem - As amostras devem ser embaladas e identificadas com rótulos contendo todas as
informações necessárias para sua identificação, de modo a não serem confundidas.

COMPOSIÇÃO CENTESIMAL

A composição centesimal de um alimento representa a proporção em que as “substâncias”

que o compõem aparecem em 100 g do alimento. Os grupos homogêneos de substâncias
constituintes dos alimentos são:

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- UMIDADE ou compostos voláteis a 105°C
- CINZAS ou resíduo mineral fixo
- LIPÍDIOS ou extrato etéreo
- PROTEÍNAS
- FIBRA (bruta ou alimentar)
- CARBOIDRATOS (extrativos não nitrogenados, quando calculados por diferença)

AMOSTRA INTEGRAL (AI)

Pré-secagem

MASSA PARCIALMENTE SECA (MPS)

Umidade (105°C) Mufla (550°C) Kjeldhal (N total)

MASSA SECA (MS) CINZAS PROTEÍNAS

Soxhlet

MASSA SECA DESENGORDURADA (MSD)

Carboidratos (extrativos não nitrogenados)
Fibra bruta ou alimentar* são obtidos pelo cálculo de 100 menos
todos os demais parâmetros avaliados
FIBRA

* Técnica de fibra alimentar requer uma determinação de cinzas e proteínas residuais

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 PRÉ-SECAGEM

A pré-secagem é importante em alimentos com alto teor de umidade (acima de 14%) para
manter os constituintes da amostra em condições relativamente estáveis durante um maior período
de tempo.
Em alimentos com alto teor de umidade são favorecidas as reações de hidrólise, ação
enzimática e desenvolvimento de microrganismos. Além destes inconvenientes, a elevada umidade
é, muitas vezes, indesejável nas amostras de análise.

MATERIAIS

- Balança semi analítica (2 casas decimais)

- Estufa ventilada a 60°C
- Material para trituração grosseira das amostras
- Pratos de alumínio
- Moinho, liquidificador ou processador de alimentos
- Colher ou espátula
- Saco de polietileno e/ou pote plástico

PROCEDIMENTO

- Verificar se o material está limpo, seco e desprovido de partes não comestíveis

- No caso de produtos de grande tamanho, cortar em pedaços de modo a aumentar a superfície de
contato com o ar
- Pesar o prato de alumínio vazio
- Pesar entre 75 e 100 g da amostra integral (AI) no prato de alumínio
- Levar à estufa e manter secagem durante 24 a 72 horas (o tempo depende da amostra, sendo que o
término da pré-secagem é determinado quando o material apresenta aspecto “seco”)
- Retirar o prato com a massa parcialmente seca (MPS) da estufa
- Deixar resfriar por aproximadamente 1 hora a temperatura ambiente
- Pesar o prato com a MPS
- Moer finamente o material e armazená-lo para análises posteriores
- Calcular o percentual de MPS contido na AI

EXEMPLO DE CÁLCULO

Prato + AI 157,5 g
Prato 7,5 g
AI 150 g

Prato + MPS 17,5 g

Peso do prato 7,5 g
MPS 10 g

Em 150 g de AI → 10 g MPS
Em 100 g de AI → X X = 6,67 g% de MPS na AI

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 DETERMINAÇÃO DA UMIDADE

A determinação da umidade é uma das medidas mais importantes na análise de alimentos.

Considerada como ponto de partida na análise de alimentos, é utilizada fundamentalmente na:
- Determinação da Massa Seca (MS) - comparação do valor nutritivo de dois ou mais alimentos
deve considerar o teor de água
- Determinação da composição centesimal e estimativa do valor de carboidratos no cálculo por
diferença
- Avaliação do estágio de maturação de grãos
- Valorização de alguns produtos
- Avaliação das condições de armazenamento

Os métodos para determinação de umidade são classificados em:

1 – Métodos por secagem
2 – Métodos por destilação
3 – Métodos químicos
4 – Métodos físicos
5 – Equipamentos especiais para determinação da umidade

1 – MÉTODOS POR SECAGEM

1.1 Secagem em estufas

Baseia-se na remoção de água por aquecimento. Consiste em pesar uma quantidade definida
de amostra numa cápsula previamente seca e tarada. A cápsula é colocada na estufa na temperatura
indicada até evaporação completa da água, isto é, até o peso ficar constante. O conjunto “cápsula +
amostra” é pesado após resfriamento em dessecador. O peso da água evaporada vai ser igual a
diferença entre o peso da amostra úmida e o peso da amostra seca. A “massa seca” ou “sólidos
totais” são calculados pela diferença entre o peso total da amostra e o peso da amostra seca.
Na aula prática, nos deteremos apenas ao método gravimétrico a 105 °C, por ser simples e
mais utilizado na análise de alimentos. Mesmo considerado um método simples, há dificuldade na
exatidão e precisão dos resultados, devido:
- Separação incompleta da água do produto
- Decomposição do produto, com liberação de água além da “água livre”
- Evaporação de substâncias voláteis do alimento, computadas no valor da umidade

Tipos de estufas:
- Simples
- Simples com ventilador
- A vácuo (utilizada para amostras que se decompõem nas temperaturas das estufas simples)

Tipos de cápsulas: Podem ser de porcelana, alumínio ou vidro. Ainda podem ser com ou sem
tampa; esta é recomendada nos métodos oficiais, mas deve ficar aberta durante secagem na estufa e
fechada durante resfriamento e pesagem. Cápsulas mais largas e menos profundas têm evaporação
mais eficiente.

Amostras:
- Devem estar reduzidas a partículas de pequeno tamanho para facilitar evaporação da água

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- Aplicação limitada às amostras no estado amorfo e líquido
- Amostras líquidas devem ser previamente evaporadas em banho-maria até consistência pastosa,
apenas então colocadas na estufa
- Amostras açucaradas podem formar uma crosta dura superficial, impedindo a evaporação de água;
nestes casos, recomenda-se a adição de areia, aresto ou pedra pome em pó, misturada com a
amostra para aumentar a superfície de evaporação

Condições de secagem:
- A temperatura deve estar um pouco acima de 100 °C para evaporação da água em estufa simples
- No vácuo, a temperatura pode ser de 70 °C, preservando a amostra e impedindo a formação de
crostas

1.2 Secagem por radiação infravermelho

Utiliza uma lâmpada de radiação infravermelho, diminuindo o tempo de secagem em até 1/3
do total. No entanto, os equipamentos disponíveis apresentam a limitação de secagem de apenas
uma amostra por vez. É comum em balanças para determinação de umidade.

1.3 Secagem em forno micro-ondas

É um método rápido e simples, mas ainda não é um método padrão.

Consiste na perda de umidade por mudança de polaridade no campo elétrico, gerado por
micro-ondas, fazendo com que haja atrito intermolecular e oscilação no próprio eixo das moléculas.
A desidratação ocorre pela geração de calor dentro e através da amostra.

2 – MÉTODOS POR DESTILAÇÃO

Indicados para amostras com baixa quantidade de umidade e alto teor de compostos voláteis
insolúveis em água, como óleos voláteis de ervas e condimentos.
A amostra é colocada em um balão de destilação, ligado a um condensador, com solvente de
densidade inferior (xileno, tolueno, ...) ou ponto de ebulição inferior a água. A mistura é aquecida e
os solventes condensados são coletados em tubos coletores graduados.

3 – MÉTODOS QUÍMICOS

3.1 Reação de Karl Fischer

O reagente de Karl Fischer é constituído de uma mistura de iodo, dióxido de enxofre e

piridina em metanol, numa única solução ou em duas soluções separadas: Uma contendo iodo em
metanol e outra contendo dióxido de enxofre e piridina em metanol. As soluções separadas são mais
estáveis e reconstituem o reagente pela simples mistura.
Pode determinar pequenas quantidades de água, embora o método não seja universalmente
aplicável. As limitações de dosagens diretas podem ser contornadas através de tratamentos
preliminares adequados às amostras. O ponto final é verificado eletrometricamente.

4 – MÉTODOS FÍSICOS

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4.1 Índice de refração

Serve para determinar a umidade do mel, melado e outros doces. Universalmente é utilizada a
refratometria a 20 °C com leitura na escala interpretada através da tabela de Chatway. O aparelho
mais indicado é o refratômetro de ABBE, com circulação de água a 20 °C.

4.2 Densidade

Muito utilizado para determinação de umidade no leite, através do método de Ackermann.

Este método utiliza um disco de alumínio, que consta de dois discos sobrepostos. Um disco tem
graduações correspondentes à densidade e outro tem duas graduações, correspondentes ao
percentual de gordura e matéria seca.
Desta forma, com o resultado da densidade em lactodensimetro e da gordura em butirômetro,
pode ser estimado o valor do extrato seco no leite.

5 – EQUIPAMENTOS ESPECIAIS PARA DETERMINAÇÃO DE UMIDADE

Envolvem diversos princípios, mas tem substituído a execução de metodologias por fornecer
resultados rápidos e confiáveis, se os equipamentos estiverem devidamente calibrados e forem bem
manuseados.
São muito importantes em determinações a campo e na liberação de matérias-primas.

MATERIAIS

- Estufa regulada a 105 °C

- Cápsula ou cadinho de porcelana
- Dessecador com sílica
- Tenaz
- Balança analítica (4 casas decimais)
- Espátula

PROCEDIMENTO

- Dessecar a cápsula em estufa a 105 °C por, no mínimo, 3 horas

- Resfriar a cápsula até temperatura ambiente em dessecador com sílica

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- Pesar a cápsula em balança analítica (transportar com pinça ou tenaz, evitando o contato com a
mão para não passar umidade e gordura à cápsula)
- Pesar de 2 a 5 g de amostra na cápsula (com exatidão de 0,00xx) e levar a estufa a 105°C por 16
horas (overnight) - “Técnicas oficiais recomendam pesar as amostras mais de uma vez, até o peso se
manter constante entre duas pesagens consecutivas”
- Retirar a cápsula com a MS da estufa
- Resfriar a cápsula até temperatura ambiente em dessecador com sílica
- Pesar cápsula com MS (pesagem a quente não fornece um resultado exato), tomar nota do valor e
calcular o percentual de umidade

EXEMPLO DE CÁLCULO

No caso de uma amostra que passou pela pré-secagem:

Cadinho + MPS = 22,00 g Cadinho + MS = 21,7 g

Peso do cadinho = 20,00 g Peso do cadinho = 20,00 g
MPS = 2,00 g MS = 1,70 g

Em 2,00 g de MPS → 1,70 g de MS

Em 100 g de MPS → X X = 85,00 g% de MS na MPS

Em 100 g de MPS → 85,00 g de MS

Em 6,67 g de MPS* → Y Y = 5,67 g% de MS na AI
* Dado obtido na prática de pré-secagem!!!

Umidade = 100 - MS
Umidade = 100 – 5,67 Umidade = 94,33%

Amostra integral submetida diretamente à secagem:

Em 2,00 g de AI → 1,50 g de MS
Em 100 g de AI → X X = 75,00 g% de MS na AI

Umidade = 100 - MS
Umidade = 100 – 75,00 Umidade = 25,00%

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 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DE ÁGUA

A água contida nos alimentos encontra-se sob duas formas: livre e ligada.
A água livre é a forma predominante no alimento, está fracamente ou não está ligada às
estruturas moleculares do alimento é relativamente fácil de ser determinada pela maioria dos
métodos. Funciona como solvente, permitindo o desenvolvimento de microrganismos e reações
químicas, mas pode ser eliminada com facilidade.
A água ligada, também chamada de combinada, está fortemente ligada ao substrato, porém
representa um teor muito pequeno em relação ao total de água do alimento. Não pode ser utilizada
como solvente, não permite o desenvolvimento de microrganismos e retarda reações químicas, além
de ser de difícil remoção do alimento.
Neste contexto, a atividade de água representa o teor de água livre (disponível) nos alimentos,
ou seja, a intensidade das forças que unem a água com outros componentes não aquosos do
alimento.
A atividade de água estabelece uma estreita relação entre o teor de água livre de um alimento
e sua conservação.

A determinação de atividade de água pode ser realizada por diferentes métodos nos alimentos:

- Em câmaras com sensor de umidade relativa (UR), ou seja, com uma atividade de água constante,
controlada e conhecida, que estabelece uma relação de umidade relativa do equilíbrio entre o
alimento e o solvente puro.

- Acondicionamento do alimento em recipientes com soluções salinas saturadas, de atividade de

água conhecida (LiCl = 0,11; MgCl2 = 0,33; K2CO3 = 0,43; Mg(NO3)2 = 0,53; NaCl = 0,75; K2SO4
= 0,97; K2Cr2O7 =0,98). Em soluções de menor atividade de água, o alimento perde peso e vice-
versa.

- Em analisadores de feixe infravermelho focado em um pequeno espelho que determina a

temperatura do ponto de orvalho da amostra, traduzida em atividade de água.

Ponto de orvalho: É a temperatura em que uma determinada parcela de ar úmido deve ser
arrefecida, a pressão atmosférica constante, para que o vapor de água seja condensado. É uma
medida primária da pressão de vapor utilizada há décadas.
O ponto de orvalho está associado com a umidade relativa:
- Alta umidade relativa indica que o ponto de orvalho é próximo da temperatura do ar.

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- Umidade relativa de 100% indica que o ponto de orvalho é igual à temperatura do ar (ar saturado
de vapor de água).
- Nunca o ponto de orvalho vai ser superior à temperatura do ar.
- Se a umidade relativa permanecer constante e a temperatura aumentar, aumenta a capacidade do ar
conter vapor de água.
- Se a umidade relativa permanecer constante e a temperatura diminuir, reduz a capacidade do ar
conter vapor de água, que condensa (fenômenos de geada, nevoeiro, chuva ou neve).
Aumento da pressão, em temperatura constante do ar, provoca aumento no ponto de orvalho
(fica mais próximo da temperatura do ar, aproximando a possibilidade de condensação).

Na aula prática será utilizado o AquaLab, que é um psicrômetro que utiliza a técnica do
ponto de orvalho em espelho resfriado para medida de atividade de água e apresenta as seguintes
características:
- faixa de leitura entre 0,03 e 1,00
- exatidão de ±0,003
- facilidade e rapidez de leitura (cerca de 5 minutos)
- reprodutibilidade (diferentes usuários, diferentes locais e mesmos resultados)

A atividade de água é medida quando ocorre o equilíbrio entre a água da amostra com o
vapor de água no espaço vazio da câmara de amostra. Mede-se então a pressão de vapor no espaço
vazio. A grande vantagem na determinação da pressão de vapor da água no ar, por ponto de
orvalho, é que o ar pode ser resfriado sem alterar o conteúdo de água até a sua saturação. A
temperatura de formação do ponto de orvalho é a temperatura na qual o ar alcança a saturação. No
AquaLab isso é determinado pela medida da temperatura em um espelho resfriado quando começa a
condensação. A atividade de água da amostra é a razão entre a saturação da pressão de vapor na
temperatura da amostra pela pressão de vapor de saturação na temperatura do ponto de orvalho.

MATERIAIS

- material para trituração da amostra (gral e pistilo, liquidificador, processador de alimentos,

moinho, peneiras, faca, tábua de corte, ...)
- amostra finamente dividida (quando sólida)
- analisador de atividade de água AquaLab
- cápsula de amostra que acompanha o equipamento
- espátula

PROCEDIMENTO

- Verificar se amostra está bem moída e/ou homogênea

- Adicionar cerca de 7,5 mL de amostra (sólida, líquida, ...) em cápsula própria do analisador
Aqualab (se a amostra não for analisada imediatamente, deixar a cápsula com a amostra tampada
até o momento da análise)
- Colocar a cápsula no analisador AquaLab
- Fechar a tampa da câmara e aguardar o equilíbrio de vapor
- O término da análise é indicado por sinais sonoros
- Tomar nota da atividade de água e da temperatura indicadas no display do analisador

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DETERMINAÇÃO DE AÇÚCARES REDUTORES PELO MÉTODO DE LANE & EYNON

A determinação dos carboidratos dos alimentos é realizada, quando não estimada através do
cálculo de diferença na composição centesimal, por métodos titulométricos que envolvem uma
reação de óxido redução.
Os carboidratos quantificados através do método de Lane & Eynon são redutores, enquanto
que os não redutores devem ser transformados em formas redutoras para que possam ser
determinados.
A técnica consta de três etapas:
1ª Etapa – Determinação do título do licor de Fehling
2ª Etapa – Preparação de uma solução da amostra
3ª Etapa – Titulação com a solução da amostra

MATERIAIS

- Balança analítica
- Banho-maria a 60°C
- Chapa de aquecimento
- Buretas graduadas de 25 ou 50 mL
- Pipetas de 2 e 10 mL
- Proveta de 50 mL
- Béqueres de 50 mL
- Erlenmeyers de 200 ou 250 mL
- Cápsula de porcelana
- Bastão de vidro
- Balões volumétricos de 250 e 1000 mL
- Funil pequeno e papel filtro
- Pérolas de vidro
- Papel indicador de pH
- Picetas

REAGENTES

- Água destilada
- Ácido clorídrico
- Solução de ferrocianeto de potássio a 15%
- Solução de acetato de zinco a 30%
- Licor de Fehling: Solução de Fehling A (Dissolver 69,28 g de sulfato de cobre (CuSO4) em balão
volumétrico de 1000 mL e completar o volume com água destilada) e Fehling B (Dissolver 346 g
de tartarato duplo de sódio e potássio (KNa(C4H4O6)) e 100 g de hidróxido de sódio em balão
volumétrico de 1000 mL, completar o volume com água destilada e filtrar em papel filtro ao passar
para o recipiente de armazenamento)
- Solução de azul de metileno a 1%
- Solução de glicose 1% ou solução de açúcar invertido 1% (Pesar 9,5 g de sacarose, transferir para
um balão volumétrico de 1000 mL, diluir com água destilada até cerca de 100 mL e adicionar 5 mL
de ácido clorídrico; manter a solução acidificada por 7 dias de 12 a 15ºC ou 3 dias de 20 a 25ºC,
completar o volume com água destilada. A solução ácida de açúcar invertido permanece estável por

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vários meses. Antes de usar, pipetar 50 mL da solução ácida para um balão volumétrico de 250 mL,
neutralizar com solução de hidróxido de sódio 1N – 40 g de NaOH diluídos em 1 L de água
destilada – e completar o volume com água, obtendo uma solução com concentração final de 0,2%)

PROCEDIMENTO

1ª Etapa
- Em uma bureta, adicionar a solução de glicose ou de açúcar invertido
- Em enlenmeyer de 200 mL, adicionar 10 mL da solução de Fehling A, 10 mL da solução de
Fehling B, 40 mL de água destilada e pérolas de vidro
- Colocar o enlenmeyer com a mistura em chapa de aquecimento
- Após início da ebulição, adicionar 5 gotas do azul de metileno e iniciar titulação com a solução de
glicose ou açúcar invertido
- Titular sob aquecimento até o desaparecimento da cor azul e formação de um precipitado
vermelho tijolo
- Calcular o título do licor de Fehling

2ª Etapa
- Homogeneizar 5 g em uma cápsula de porcelana com 50 mL de água destilada quente (se
necessário, levar ao banho-maria a 60°C para facilitar a dissolução da amostra)
- Transferir a amostra homogeneizada para um balão volumétrico de 250 mL
- Adicionar 2 mL da solução de ferrocianeto de potássio a 15% e 2 mL da solução de acetato de
zinco a 30%
- Completar o volume com água destilada
- Filtrar através de funil com papel filtro, coletando o filtrado em um enlenmeyer
- Colocar o filtrado em uma bureta para titulação

3ª Etapa
- Em outro enlenmeyer, adicionar 10 mL da solução de Fehling A, 10 mL da solução de Fehling B,
40 mL de água destilada e pérolas de vidro
- Colocar o enlenmeyer com a mistura na chapa de aquecimento
- Após ebulição, adicionar 5 gotas do azul de metileno e iniciar titulação com a solução filtrada da
amostra
- Titular sob aquecimento até o desaparecimento da cor azul e formação de um precipitado
vermelho tijolo
- Calcular o valor de açúcares redutores da amostra

Observação: O ponto final da titulação é quando desaparece a cor roxa e o azul de metileno é
descorado, aparecendo um precipitado vermelho tijolo no fundo do enlenmeyer. Se a solução ficar
em repouso, a cor roxa retorna, pois o composto reduzido é rapidamente oxidado pelo oxigênio
atmosférico, retornando a coloração roxa e azul.

EXEMPLO DE CÁLCULO

O título do licor de Fehling é obtido pela padronização das soluções de Fehling com uma
solução de açúcar redutor de concentração conhecida. Assim, o resultado é geralmente expresso em
açúcares redutores ou em glicose.

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 Por exemplo, se o gasto médio na titulação com a solução de concentração conhecida de
açúcares redutores (solução de glicose 1%) for 7 mL:

100 mL de solução ---------- 1 g de glicose

7 mL ---------- X

X = 0,07 g de glicose são necessários para reduzir o licor de Fehling

Se o gasto médio na titulação com a solução da amostra for de 10 mL:

10 mL da solução de amostra ---------- 0,07 g de açúcares redutores

250 mL ---------- Y

Y = 1,75 g de açúcares redutores em 5 g de amostra que foram diluídos em balão volumétrico de

250 mL

5 g ---------- 1,75 g
100 g ---------- Z

Z = 35 g% de açúcares redutores na amostra

Este raciocínio pode ser resumido na seguinte fórmula:

% de açúcares redutores = 250 x 100 x T

VxP

Onde:
250 = volume do balão volumétrico
100 = porcentual na amostra
T = título do licor de Fehling
V = volume gasto da solução de amostra filtrada
P = peso de amostra homogeneizada

PRINCÍPIO DA TÉCNICA

Os açúcares redutores promovem a redução de soluções alcalinas do sulfato de cobre

(CuSO4) em presença de tartarato de sódio e potássio. O resultado desta reação de redução é a
formação de óxido cuproso (Cu 2O), que aparece como um precipitado de coloração vermelho tijolo.
O Cu2O é bastante instável e oxida pelo O2 atmosférico, retomando a coloração roxa azulada na
mistura.

O ferrocianeto de potássio e o acetato de zinco são utilizados para desnaturar e remover

proteínas, deixando apenas os açúcares redutores após a filtragem da amostra.

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 DETERMINAÇÃO DE AMIDO

O amido constitui a mais importante reserva de nutrientes de todas as plantas superiores,

ocorrendo principalmente em sementes, tubérculos e raízes. Desta forma, é um componente em
grande quantidade nos alimentos e fonte mais expressiva de carboidratos da alimentação humana.
O amido é um homopolissacarídio neutro formado por duas frações: amilose e amilopectina.
A primeira é formada por unidades de glicose ligadas por ligações α-1,4 e a segunda por unidades
de glicose unidas em α-1,4 com cadeias ligadas em α-1,6.

Este método tem aplicação na determinação de amido em produtos com grande quantidade
deste polissacarídio, como cereais e derivados, sendo que estes devem ser pobres em gordura ou
previamente desengordurados.
A técnica tem 2 etapas:
1ª Etapa: Hidrólise energética do amido em meio altamente ácido.
2ª Etapa: A glicose (açúcar redutor) formada após hidrólise é quantificada pelo método de Lane &
Eynon.

MATERIAIS

- Balança analítica
- Autoclave
- Frasco shot de 500 mL para autoclavagem
- Chapa de aquecimento
- Papel indicador de pH
- Buretas graduadas de 25 mL
- Pipetas de 2 e 10 mL
- Proveta de 50 mL
- Béqueres de 50 mL
- Erlenmeyers de 250 mL
- Gral e pistilo de porcelana
- Cápsula de porcelana
- Balões volumétricos de 500 e 1000 mL
- Funil pequeno e papel filtro
- Pérolas de vidro
- Picetas

REAGENTES

- Farinha
- Água destilada
- Ácido clorídrico
- Solução de hidróxido de sódio a 40%
- Solução de ferrocianeto de potássio a 15%
- Solução de acetato de zinco a 30%
- Licor de Fehling com título conhecido (Solução de Fehling A e Fehling B)
- Solução de azul de metileno a 1%

15
PROCEDIMENTO

1ª Etapa
- Pesar 5 g de amostra de farinha de trigo
- Transferir a amostra para o frasco shot junto com 200 mL de água destilada
- Adicionar 10 mL de ácido clorídrico concentrado
- Autoclavar a 120°C e 1 atm por 20 minutos
- Após autoclavagem, aguardar o resfriamento da amostra hidrolisada e neutralizar com a solução
de hidróxido de sódio 40%, controlando pH através do uso de papel indicador
- Transferir para balão volumétrico de 500 mL
- Adicionar 10 mL da solução de ferrocianeto de potássio 15% e 10 mL da solução de sulfato de
zinco 30%
- Completar o volume com água destilada e homogeneizar
- Aguardar sedimentação e filtrar a solução em enlenmeyer

2ª Etapa
- Em outro enlenmeyer, adicionar 10 mL da solução de Fehling A, 10 mL da solução de Fehling B,
40 mL de água destilada e pérolas de vidro
- Colocar o enlenmeyer com a mistura na chapa de aquecimento
- Após ebulição, adicionar 5 gotas do azul de metileno e iniciar titulação com o filtrado
- Titular sob aquecimento até o desaparecimento da cor azul e formação de um precipitado
vermelho tijolo
- Calcular o valor de açúcares redutores e transformar para o valor de amido

EXEMPLO DE CÁLCULO

Nesta técnica se utilizam as mesmas soluções de Fehling da determinação dos açúcares

redutores (título do licor de Fehling = 0,07).

Se o gasto da titulação com o hidrolisado de amido foi de 5 mL:

0,07 g ---------- 5 mL
X ---------- 1 mL

X = 0,007941 g de açúcares redutores / mL de sol.

1 mL ----------- 0,007941 g
500 mL ----------- Y

Y = 3,97 g de açúcares redutores (glicose)/5 g de farinha

Ocorre que o peso da glicose livre é maior do que o peso de cada unidade de glicose do
amido, em uma proporção de 1:0,9 (1 g de glicose = 0,9 g de amido), assim:

3,97 x 0,9 = 3,57353 g de amido / 5 g de farinha de trigo

(3,57353/5) x 100 = 71,47% de amido na farinha de trigo

16
 DETERMINAÇÃO DA FIBRA BRUTA

Nutricionalmente, o termo fibra é restrito ao material filamentoso dos alimentos. O termo

“fibra dietética” ou “fibra alimentar” foram introduzidos para assinalar todas as estruturas celulares
das paredes vegetais que não são digeridas pelos sucos digestivos humanos.
A alteração de termos também foi acompanhada de mudanças nos métodos de análise de
fibras, com o aperfeiçoamento das técnicas, em especial do método enzimático.
O método de determinação da fibra bruta baseia-se na determinação do resíduo orgânico
insolúvel da amostra, após uma digestão ácida e outra alcalina sob condições especiais.
Foi o primeiro método utilizado para determinar este constituinte nos alimentos e
extensamente utilizado até a década de 70, quando novos métodos foram desenvolvidos.
O termo fibra dietética associa a totalidade dos componentes não digestivos das paredes
celulares, incluindo celulose, hemicelulose, lignina, amido resistente, pectina, gomas e mucilagens,
divididos quanto a solubilidade ou não em água, que determina seu papel fisiológico.
Sabe-se que o resíduo da digestão no ser humano é muito maior do que o determinado pelo
método da fibra bruta, portanto este método subestima a porção de fibra do alimento. Apenas cerca
de 20% da hemicelulose, 10 a 40% da lignina e 50 a 90% da celulose são determinadas no método
de fibra bruta.

MATERIAIS

- Balança analítica
- Espátula
- Erlenmeyer de 500 mL
- Chapa de aquecimento
- Funil e papéis filtro
- Timer
- Estufa a 105°C
- Dessecador com sílica
- Papel indicador de pH

REAGENTES

- Água destilada
- Solução de ácido sulfúrico 1,25% ou 0,255N (Diluir 7 mL de ácido sulfúrico concentrado em
balão volumétrico de 1000 mL com cerca de 500 mL de água destilada; completar o volume e
padronizar com solução de hidróxido de sódio 0,2N)
- Solução de hidróxido de sódio 1,25% ou 0,313N (Pesar 12,5 g de hidróxido de sódio em becker,
solubilizar com água destilada e transferir para um balão volumétrico de 1000 mL; completar o
volume e padronizar com solução de ácido sulfúrico 0,2N)
- Solução antiespumante (álcool n-amílico ou mistura de 1 g de silicone, 50 mL de éter etílico e 50
mL de éter de petróleo)
- Etanol p.a.
- Acetona p.a.
- Éter etílico p.a.
- Éter de petróleo p.a.

17
PROCEDIMENTO

- Previamente à análise, deixar um papel filtro em estufa a 105°C por, no mínimo, 3 horas
- Resfriar em dessecador e pesar
- Pesar 3 g de amostra seca e desengordurada (4 lavagens com 20 mL de éter etílico, se o teor de
gordura for maior que 5%)
- Transferir a amostra para um erlenmeyer de 500 mL
- Adicionar 200 mL da solução de ácido sulfúrico 1,25% e 5 gotas da solução antiespumante
- Colocar na chapa de aquecimento e, após início da ebulição, manter digestão por 30 minutos
- Filtrar através de um papel filtro (não necessariamente o previamente pesado)
- Lavar o resíduo do papel filtro com água destilada quente
- Retornar o resíduo para recipiente de digestão
- Adicionar 200 mL da solução de hidróxido de sódio 1,25% e 5 gotas da solução antiespumante
- Colocar na chapa de aquecimento e, após início da ebulição, manter digestão por mais 30 minutos
- Filtrar através do papel filtro previamente pesado
- Lavar o resíduo com água destilada quente até o filtrado ser neutralizado, verificando o pH através
de papel indicador
- Lavar o resíduo com 20 mL de etanol, 20 mL de acetona e 20 mL de éter de petróleo
- Colocar o papel filtro com o resíduo na estufa a 105°C por 3 horas
- Retirar o papel filtro da estufa
- Resfriar em dessecador e pesar
- Calcular o teor de fibra bruta

EXEMPLO DE CÁLCULO

FIBRA BRUTA (%) = (R – P) . 100

A

Onde:
R = peso do papel filtro + resíduo
P = peso do papel filtro
A = peso da amostra

18
MODELO ESQUEMÁTICO DA DETERMINAÇÃO DE FIBRA BRUTA

AMOSTRA SECA DESENGORDURADA

DIGESTÃO ÁCIDA (H2SO4 1,25%)

DIGESTÃO BÁSICA (NaOH 1,25%)

LAVAGEM DO RESÍDUO

SECAGEM DO RESÍDUO (105 °C/3 hrs)

PESAGEM E CÁLCULO

19
 DETERMINAÇÃO DE FIBRA PELO MÉTODO ENZIMÁTICO

A fibra determinada em laboratório vai ser próxima daquela que resulta da digestão no
organismo humano se os processos de digestão forem semelhantes. A dificuldade está na
reprodução do processo de digestão humano, que é bastante complexo, envolve muitas enzimas e
varia conforme o grau de trituração, mastigação, mistura de alimentos, ....
Este método é resultado dos esforços de pesquisadores que procuram criar metodologias que
aproximem mais o resíduo de fibra determinada com resultante da digestão humana.
O método utilizado é baseado no método da AOAC 991-43 (fibra alimentar total, solúvel e
insolúvel em alimentos) e no método da AACC 32-07 (determinação de fibra alimentar solúvel,
insolúvel e total), e, resumidamente, a amostra é sujeita à digestão enzimática e o resíduo
quantificado por método gravimétrico.
O Ministério da Saúde, em portaria de 2001, através da ANVISA, define fibras alimentares
como “qualquer material comestível de origem vegetal que não seja hidrolisado pelas enzimas
endógenas do trato digestivo humano, determinado segundo os métodos publicados pela AOAC em
sua edição mais atual”.

Nesta metodologia é possível quantificar os teores de fibra alimentar solúvel e insolúvel,

observando a seguinte relação:

FAT = FAI + FAS

Onde:
FAT = Fibra alimentar total
FAI = Fibra alimentar insolúvel
FAS = Fibra alimentar solúvel

Compreendem a fração insolúvel a celulose, hemicelulose, ligninas e amido resistente;

enquanto que na fração solúvel encontram-se algumas hemiceluloses, pectinas, gomas e
mucilagens.

MATERIAIS

- Balança analítica
- Béqueres de 20 e 500 mL
- Pipetas de 10 mL
- Micropipetadores e ponteiras para 100 µL e 300 µL
- Proveta de 50 mL
- Bastão de vidro
- Cadinhos de vidro sinterizado com porosidade de 40 a 60 µ
- Picetas
- Banho-maria com agitação a 100 °C
- Banho-maria com agitação a 60 °C
- pHmetro
- Timer
- Bandejas (para transporte dos béqueres)
- Sistema de vácuo (para filtragem)
- Estufa a 105 °C

20
- Dessecador com sílica
- Sistema para digestão e destilação (determinação do nitrogênio total por Kjeldhal)
- Mufla a 550 °C

REAGENTES

- Lã de vidro média
- Água destilada
- Tampão fosfato 0,08M pH 6 (Dissolver 1,4 g de fosfato de sódio dibásico anidro (Na2HPO4) ou
1,753 g de dihidratado e 9,68 g de fosfato de sódio monobásico monohidratado (NaH2PO4.H2O) ou
10,94 g de dihidratado com cerca de 700 mL de água destilada em balão volumétrico de 1000 mL.
Completar o volume e verificar o pH)
- Enzimas amilase, protease e amiloglicosidase
- Solução de hidróxido de sódio 0,275N (Diluir 11 g de NaOH em 1 L de água destilada)
- Solução de ácido clorídrico 1N (Diluir 85 mL de ácido clorídrico concentrado em 1 L de água
destilada)
-Solução de ácido clorídrico 0,325N (Diluir 325 mL da solução de HCl 1N em 1 L de água
destilada)
- Etanol 95%.
- Etanol 78%
- Acetona PA
- Reagentes para determinação do nitrogênio total (ácido sulfúrico, mistura catalítica, solução de
hidróxido de sódio 40%, solução de ácido bórico 4%, solução de indicadores vermelho de metila e
verde de bromocresol, solução de indicador fenolftaleína e solução de ácido sulfúrico 0,05N)

PROCEDIMENTO

- Pesar 1 g de amostra em cada béquer de 500 mL (conduzir 4 béqueres para cada amostra, que se
tiver teor de extrato etéreo igual ou superior a 10% deve ser previamente desengordurada)
- Adicionar 50 mL de tampão fosfato e homogeneizar, se necessário, com auxílio de um bastão de
vidro
- Adicionar 100 L de -amilase
- Incubar e agitar por 30 minutos em banho-maria a 100 °C
- Retirar o béquer, resfriar e corrigir o pH para 7,5 com a solução de NaOH 0,275N
- Adicionar 100 L de protease
- Incubar e agitar por 30 minutos em banho-maria a 60 °C
- Retirar o béquer, resfriar e corrigir o pH para 4,5 com a solução de HCl 0,325N
- Adicionar 300 L de amiloglicosidase
- Incubar e agitar por 30 minutos em banho-maria a 60 °C
- Em dois béqueres, adicionar 280 mL de etanol 95% previamente aquecido a 60 °C e deixar em
repouso por 1 hora para precipitação da fibra solúvel
- Nos outros dois béqueres proceder a filtragem

- Filtrar em cadinho de vidro sinterizado forrado com lã de vidro e previamente pesado:

- Resíduo da fibra total – Após precipitação da fibra solúvel, filtrar a mistura remanescente
lavando o béquer com etanol 78%, 40 mL de etanol 95% e 20 mL de acetona
- Resíduo da fibra insolúvel – Filtrar a mistura remanescente lavando o béquer com água
destilada, 40 mL de etanol 95% e 20 mL de acetona

21
- Levar os cadinhos com resíduo para estufa a 105 °C
- Após 16 horas, retirar os cadinhos da estufa, resfriar em dessecador e pesar
- Da duplicata de cada uma das frações de fibra determinadas (insolúvel e total), incinerar um dos
cadinhos em mufla a 550 ºC por 5 horas e transferir a lã de vidro com o resíduo do outro cadinho
para um tubo de digestão proteica
- Calcular os teores de fibra alimentar, corrigindo com os valores de cinzas e proteína

EXEMPLO DE CÁLCULO

FIBRA ALIMENTAR (%) = {[(R1 + R2) / 2] – P - C} / [(M1 + M2) / 2] . 100

Onde:
R1 e R2 são os pesos dos resíduos
P é o teor de proteína no resíduo
C é o teor de cinzas no resíduo
M1 e M2 são os pesos das amostras

Tabela de dados para determinação de fibra alimentar de uma amostra hipotética

Peso da amostra (g) Resíduo (g) Cinzas (g) Proteína (g)
1,0023 0,572 - 0,06
1,0071 0,6046 0,0156 -

FA = (0,5883 – 0,06 – 0,0156) . 100

1,0047

FA = 51,03 g% de FA

22
MODELO ESQUEMÁTICO DA DETERMINAÇÃO DE FIBRA ALIMENTAR

AMOSTRA

Tampão fosfato pH 6

INCUBAÇÃO COM α-AMILASE A 100 °C

Correção pH 7,5 com NaOH 0,275N

INCUBAÇÃO COM PROTEASE A 60 °C

Correção pH 4,5 com HCl 0,325N

INCUBAÇÃO COM AMILOGLICOSIDASE A 60 °C

Etanol 95%

PRECIPITAÇÃO DA FIBRA SOLÚVEL

Após 1 hora

FILTRAGEM FILTRAGEM
Etanol 78% Água destilada
Etanol 95% Etanol 95%
Acetona Acetona

RESÍDUO RESÍDUO

Cinzas Cinzas
Proteína bruta Proteína bruta

FIBRA ALIMENTAR TOTAL FIBRA ALIMENTAR INSOLÚVEL

23
 DETERMINAÇÃO DA FRAÇÃO EXTRATO ETÉREO PELO MÉTODO DE SOXHLET

Os lipídios constituem um grupo diverso de substâncias formadas por longas cadeias

hidrocarbonadas. Essas cadeias conferem um caráter apolar que, por sua vez, determina a
insolubilidade em solventes polares e solubilidade em solventes apolares para estes compostos.
Na solubilidade em solventes apolares é que se baseiam os métodos de determinação dos
lipídios nos alimentos. Os solventes apolares também podem extrair substâncias diferentes dos
lipídios, pelas quais têm afinidade, por isso, a fração extraída do alimento é considerada como
“extrato etéreo” ou “gordura bruta”.
A extração dos lipídios pode ser feita com solventes a frio ou a quente. Nesta aula prática,
será utilizado o aparelho extrator Soxhlet, a partir da extração com solvente apolar a frio.
Soxhlet é um aparelho de laboratório inventado em 1879 por Franz Von Soxhlet. Ele foi
originalmente desenvolvido para a extração de lipídios em materiais sólidos. O princípio do método
é o refluxo de solvente em um processo intermitente.
Os solventes mais utilizados são o éter etílico e o éter de petróleo, que após ebulição e
condensação, entram em contato com a amostra e transferem os lipídios desta para o balão quando
atingem a altura do sifão.
A principal vantagem é que a amostra não fica em contato com o solvente quente. Porém há
desvantagens, como o gasto excessivo de solvente e o tempo de análise (4 a 20 horas).

Figura 1. Modelo do método de Soxhlet

MATERIAIS

- Balança analítica
- Aparelho extrator de Soxhlet

24
- Cartucho poroso (de papel filtro)
- Proveta de 200 mL
- Pinça
- Estufa a 105°C
- Dessecador com sílica
- Capela

REAGENTES

- Amostra (finamente dividida e seca, para aumentar a superfície de contato e facilitar a penetração
do solvente)
- Solvente extrator (éter etílico ou éter de petróleo)

PROCEDIMENTO

- Previamente à análise, deixar o balão do extrator em estufa a 105 °C por, no mínimo, 3 horas
- Resfriar em dessecador e pesar
- Pesar aproximadamente 2 g de amostra seca no cartucho
- Fechar o cartucho e levá-lo ao aparelho extrator
- Colocar 200 mL do solvente, acoplar o condensador e regular aquecimento em temperatura de 40
a 50 °C (gotejamento ideal do solvente é de 2 gotas/segundo)
- Manter extração por 6 horas (depende da amostra, podendo variar de 4 a 20 horas)
- Terminada a extração, retirar a amostra e recuperar o solvente (sempre antes de atingir o sifão,
despejar o éter em frasco do solvente)
- Deixar o balão em capela por aproximadamente 1 hora para evaporação do excesso de solvente
- Levar o balão para estufa a 105 °C por 3 horas
- Resfriar em dessecador e pesar
- Calcular o valor de extrato etéreo na amostra

EXEMPLO DE CÁLCULO

Peso do balão = 100 g

Peso da amostra (MS) = 2 g
Peso do balão + EE = 100,3 g
Extrato etéreo: 100,3 – 100 = 0,3 g

2 g de amostra → 0,3 g de extrato etéreo

100 g → X X = 15% de extrato etéreo na amostra seca*
* Transformar valor para a amostra integral!

25
 DETERMINAÇÃO DE LIPÍDIOS PELO MÉTODO DE BLIGH & DYER

O Método de Bligh & Dyer é um método muito utilizado de extração de lipídios.

É caracterizado por ser feito a frio, utilizando-se uma mistura de clorofórmio, metanol e
água. Inicialmente, amostra, metanol e clorofórmio formam apenas uma fase; posteriormente, mais
clorofórmio e água são adicionados, estabelecendo duas fases.
Os lipídios ficam na fase do clorofórmio, que pode ser separada e removida por evaporação.
As vantagens em relação ao método de Soxhlet são:
- Método rápido
- Possibilidade de analisar diversas amostras concomitantemente
- Todo processo ocorre a frio
- Menor quantidade de solvente
- Amostra não precisa ser seca

MATERIAIS

- Balança analítica
- Tubos falcon de 15 e 50 mL
- Suporte para tubos falcon
- Pipetas de 5, 10 e 20 mL
- Pipetador
- Funil e papel filtro
- Béqueres de 25 mL
- Espátula
- Agitador de tubos
- Centrífuga
- Estufa a 105 °C
- Dessecador com sílica
- Capela

REAGENTES

- Amostra
- Clorofórmio p.a.
- Metanol p.a.
- Água destilada
- Sulfato de sódio anidro
- Solução de sulfato de sódio 1,5%

PROCEDIMENTO

- Deixar o béquer em estufa a 105 ºC por, no mínimo, 3 horas

- Resfriar em dessecador e pesar
- Pesar aproximadamente 2 g da amostra moída no tubo falcon com capacidade para 50 mL
- Adicionar 8 mL de clorofórmio, 16 mL de metanol e 6,4 mL de água destilada
- Tampar os tubos e colocá-los em agitador por 30 minutos

26
- Adicionar 8 mL de clorofórmio e 8 mL de solução de sulfato de sódio 1,5%
- Tampar novamente os tubos e agitá-los por mais 2 minutos
- Deixar separar as camadas de forma natural ou centrifugar a 1500 rpm por 2 minutos
- Pipetar de 10 a 12 mL da camada inferior (clorofórmio) para um tubo falcon de 15 mL
- Adicionar aproximadamente 1 g de sulfato de sódio anidro, tampar e agitar manualmente
- Filtrar para outro tubo falcon de 15 mL, através de funil pequeno e papel filtro
- Pipetar 5 mL do filtrado para o béquer previamente pesado
- Colocar o béquer em estufa a 105 °C até evaporação do solvente
- Resfriar em dessecador e pesar
- Calcular o teor de lipídios na amostra

EXEMPLO DE CÁLCULO

Peso da amostra = 2 g
Peso do béquer = 30 g
Peso do béquer + resíduo = 30,07 g

Resíduo (lipídios): 30,07 – 30 = 0,07 g

0,07 g de lipídios ---------- 5 mL do filtrado (clorofórmio)

X ---------- 16 mL X = 0,224 g

0,224 g de lipídios ---------- 2 g de amostra

Y ---------- 100 g Y = 11,2% de lipídios

Fonte: BLIGH, E.C. & DYER, W.J., 1959. A rapid method of total lipid. Extraction and
purification. Can. J. Biochem. Physiol., 37: 911-917.

27
 DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNA BRUTA PELO MÉTODO DE KJELDAHL

As proteínas, polímeros de aminoácidos de alto peso molecular, são compostos, no mínimo,

quaternários porque contém, além do carbono, hidrogênio e oxigênio, também o nitrogênio. A
grande maioria das proteínas também contém enxofre e algumas podem conter elementos como o
fósforo, ferro, entre outros.
O método de Kjeldahl baseia-se na determinação do nitrogênio presente na amostra e é
recomendado em diversos protocolos da AOAC. O método de Kjeldahl recebe o nome do seu
desenvolvedor, o químico dinamarquês Johan Gustav Kjeldahl. Pode ser micro ou macro Kjeldahl,
dependendo da quantidade de amostra e, consequentemente, reagentes utilizados.
É muito utilizado para determinação do conteúdo proteico dos alimentos, devido à facilidade
de execução, uso de equipamentos simples e baixo custo nas análises.
Três fases compreendem o método de Kjeldhal:

1ª fase - Mineralização ou digestão

Pela digestão com ácido sulfúrico concentrado, ocorre a oxidação da matéria orgânica e
redução do nitrogênio da amostra a amônia, que é “prendida” na forma de sulfato de amônio. A
reação é demonstrada do seguinte modo:

- C - NH2 (matéria orgânica/proteína) + H2SO4 → (NH4)2SO4 + CO2↑ + SO2↑ + H20

Para aumentar a rapidez e a eficiência do processo, adiciona-se:

- Sais (como o sulfato de potássio ou de sódio) para aumentar a temperatura da digestão.
- Catalizadores (como cobre, mercúrio e/ou selênio) para facilitar a oxidação da matéria orgânica.

2ª fase – Destilação

Previamente à destilação, é estabelecido um meio alcalino pela adição de hidróxido de

sódio, onde o sulfato de amônio forma hidróxido de amônio, através da seguinte reação:

(NH4)2SO4 + 2NaOH → 2NH4OH + Na 2SO4

28
 O hidróxido de amônio é bastante instável e por ação do calor forma amônia e água:

2NH4OH → 2NH 3 + 2H2O

A amônia, por sua vez, é um composto volátil e facilmente destilado por arraste de vapor.
O condensado é recolhido em um frasco coletor contendo a solução de ácido bórico e
mistura de indicadores (verde de bromocresol e vermelho de metila). A amônia reage com o ácido
bórico formando o borato de amônio:

3NH3 + H3BO3 → (NH4)3BO3

3ª fase – Titulação

Quantifica-se a quantidade de borato de amônio (proporcional à quantidade de nitrogênio)

pela reação com ácido clorídrico, formando cloreto de amônio e ácido bórico:

(NH4)3BO3 + 3HCl → 3NH4Cl + H3BO3

O indicador misto de verde de bromocresol e vermelho de metila possibilita a fácil

observação da mudança de cor na titulação. O borato de amônio confere coloração verde à solução
(pH alcalino), mas quando é convertido em ácido bórico e o ácido clorídrico fica em excesso, a
solução reassume a coloração rósea (pH ácido = ponto final).
29
MATERIAIS

- Balança analítica
- Espátula
- Bloco digestor
- Tubo de micro Kjeldahl
- Sistema destilador de nitrogênio
- Piceta
- Erlenmeyer de 125 mL
- Bureta de 50 mL
- Béquer de 50 mL
- Pipetas graduadas de 2 e 20 mL

REAGENTES

- Mistura catalítica (100 g de sulfato de sódio, 10 g de sulfato de cobre e 1 g de selênio)

- Ácido sulfúrico concentrado
- Água destilada
- Solução dos indicadores verde de bromocresol/vermelho de metila (Dissolver 0,099 g de verde de
bromocresol e 0,066 g de vermelho de metila em 100 mL de etanol p.a.)
- Solução indicadora de ácido bórico (Dissolver 40 g de ácido bórico em 700 mL de água destilada
quente, transferir para um balão volumétrico de 2 litros, adicionar 300 mL de etanol p.a. e 40 mL da
solução dos indicadores verde de bromocresol/vermelho de metila, completar o volume com água
destilada)
- Solução de hidróxido de sódio 40% (Dissolver 400 g de hidróxido de sódio em 1000 mL de água
destilada)
- Solução de ácido clorídrico 0,1 N (Transferir 8,5 mL de de ácido clorídrico concentrado para um
balão volumétrico de 1000 mL contendo 500 mL de água destilada, após resfriar, completar o
volume e padronizar a solução)

PROCEDIMENTO

- Pesar 0,2 g de amostra e transferir para o tubo de digestão

- Adicionar uma dose da mistura catalítica (cerca de 1 g) e 2 mL de ácido sulfúrico concentrado no
tubo de digestão
- Levar o tubo ao bloco digestor e proceder digestão a 375 ºC, aumentando a temperatura
gradualmente até que o líquido apresente tonalidade verde azulada e fique límpido
- Desligar o bloco, retirar os tubos, aguardar o resfriamento e diluir até 20 mL com água destilada
- Adicionar 20 mL da solução indicadora de ácido bórico em enlenmeyer de 125 mL e acoplá-lo na
porção coletora final do destilador
- Inserir o tubo no destilador (na entrada de vapor) e adicionar 10 mL de hidróxido de sódio 40%
- Ligar o aquecimento e proceder destilação até que toda amônia seja recolhida (até o volume do
erlenmeyer atingir 75 mL)
- Titular o destilado com solução de ácido clorídrico 0,1 N até o desaparecimento da cor verde e
surgimento de coloração violeta ou rósea

30
- Tomar nota do gasto, calcular o teor de N e transformar para proteína através do fator de correção
para a amostra

EXEMPLO DE CÁLCULO

0,1 N de HCl - 0,1 N (NH4)3BO3 - 0,1 N de nitrogênio

1 N de Nitrogênio - 14 g - 1000 mL
0,1 N - X - 1000 mL X = 1,4 g de nitrogênio/1000 mL

1,4 g de N - 1000 mL
Y - 1 mL Y = 0,0014 g de nitrogênio/mL

0,0014 g de N - 1 mL
Z - 12 mL (gasto na titulação) Z = 0,0168 g de N

0,0168 g N - 0,2 g de amostra

W - 100 g de amostra W = 8,4 g de N

As proteínas apresentam diferentes proporções de nitrogênio na estrutura e para cada fonte

proteica é estabelecido um fator de correção:

Fonte proteica Fator de correção % de proteína (para o exemplo)

Vegetais 5,75 48,30%
Carnes, soja e milho 6,25 52,50%
Lácteos 6,38 53,59%
Fonte: Resolução RDC n° 360, 23 de dezembro de 2003.

31
DETERMINAÇÃO DE ÁCIDO ASCÓRBICO EM SUCOS PELO MÉTODO INTERLAB X-1

Este método é aplicável para avaliação de ácido ascórbico reduzido, mas não é aplicável em
sucos de frutas muito coloridos ou em presença de Fe ferroso, Sn estanhoso, Cu cuproso, SO2,
sulfito e tiossulfato, nos quais os valores são superestimados.
O princípio da técnica é a redução do indicador-corante 2,6 diclorofenol indofenol sódico.
No ponto final de uma titulação, o excesso do indicador-corante não reduzido confere uma
coloração rosa pink em meio ácido, que é o meio utilizado na titulação para evitar a autoxidação do
ácido ascórbico.

MATERIAIS

- Balança analítica
- Espátula
- Balões volumétrico de 50, 100, 200 mL
- Funil e papel filtro
- Erlenmeyers de 250 mL
- Proveta de 50 mL
- Bureta de 25 ou 50 mL
- Pipetas graduadas de 2, 5, 10 e 20 mL
- Faca
- Espremedor de frutas
- Funil com algodão ou gaze
- Béquer de 200 mL
- Béqueres de 50 mL

REAGENTES

- Suco de fruta
- Água destilada
- Solução padrão de 2,6 diclorofenol indofenol (Pesar 50 mg de 2,6 diclorofenol indofenol e
dissolver com 50 mL de água destilada em balão volumétrico de 200 mL; agitar até a completa
dissolução e completar o volume do balão; filtrar, se necessário, e guardar a solução em frasco
âmbar sob refrigeração)
- Solução de ácido oxálico 1% (Pesar 10 g de ácido oxálico p.a., transferir para balão volumétrico
de 1000 mL, diluir e completar o volume com água destilada)
- Solução de ácido ascórbico 0,1% (Pesar 50 mg de ácido ascórbico, transferir para balão
volumétrico de 50 mL, diluir e completar o volume com a solução de ácido oxálico 1%)

PROCEDIMENTO

Padronização da solução de 2,6 diclorofenol indofenol

- Transferir 2 mL da solução de ácido ascórbico 0,1% para erlenmeyer de 250 mL contendo 50 mL
da solução de ácido oxálico 1%
- Titular com a solução de 2,6 diclorofenol indofenol em bureta até aparecimento de coloração rósea
persistente por mais de 5 segundos

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- Cada titulação deve consumir cerca de 15 mL da solução de 2,6 diclorofenol indofenol e coincidir
em 0,1 mL
- Simultaneamente, titular um branco com água destilada no lugar da solução de ácido ascórbico e
diminuir do gasto na titulação da solução de ácido ascórbico 0,1%

Preparo da amostra
- Cortar frutas ao meio
- Espremer as frutas em espremedor
- Filtrar o suco através de algodão ou gaze para um béquer

Determinação do ácido ascórbico no suco

- Pipetar 5 mL de suco filtrado para erlenmeyer de 250 mL contendo 50 mL da solução de ácido
oxálico 1%
- Titular com a solução de 2,6 diclorofenol indofenol até coloração rósea persistente por 15
segundos
- Anotar o gasto da solução de 2,6 diclorofenol indofenol e calcular o teor de ácido ascórbico da
amostra

EXEMPLO DE CÁLCULO

Gasto médio da titulação do padrão com solução de 2,6 diclorofenol indofenol = 15,1 mL
Gasto médio da titulação do branco com solução de 2,6 diclorofenol indofenol = 0,1 mL
Gasto médio da titulação da amostra de suco com solução de 2,6 diclorofenol indofenol = 22,1 mL

Solução padrão 500 mL – 0,125 g

15 mL – X X = 0,00375 g de 2,6 diclorofenol indofenol

Amostra 500 mL – 0,125 g

22 mL – Y Y = 0,0055 g de 2,6 diclorofenol indofenol

0,00375 g – 0,002 g (solução ácido ascórbico 0,1%)

0,0055 g – Z Z = 0,002933 g

0,002933 g – 5 mL de suco
W – 100 mL W = 0,059 g% de ácido ascórbico/100 mL suco

Fonte: Portaria n° 76, de 27 de novembro de 1986, do Ministério da Agricultura e Reforma Agrária

– Secretaria Nacional de Defesa Agropecuária. Diário Oficial da União, 3 de dezembro de 1986,
Seção I, página 18168.

33
 DETERMINAÇÃO DA FRAÇÃO CINZAS

Considera-se “cinza total” ou “resíduo mineral fixo”, o resultado da incineração do produto

em mufla na temperatura entre 500 e 600ºC, até oxidação total da matéria orgânica.
É um método importante na determinação da composição centesimal, como um passo na
determinação de minerais isolados, no controle de qualidade e caracterização de alguns produtos.
Os constituintes quantificados na fração cinzas são elementos minerais essenciais (macro e
micronutrientes), além de minerais sem função conhecida no organismo.
A Legislação estabelece limites, normalmente máximos, para o teor de cinzas da maioria dos
alimentos, como por exemplo:
 Farinha de trigo (máximo de 2% para integral, 0,65% para especial e entre 0,65-1,35% para
comum)
 Produtos de soja (máximo de 6,5% para farinha desengordurada, 6,5% para proteína texturizada
5% para proteína concentrada)
 Ovos (máximo de 1,1% para ovo líquido e 4% para desidratado).
Representam dificuldades e desvantagens comuns na obtenção da fração cinzas:
- Materiais ricos em fósforo tendem a formar uma massa vítrea que envolve o carvão.
- Produtos ricos em lipídios tendem a formar espumas, que podem projetar materiais para fora do
cadinho com perda de amostra.
- Materiais de elevada umidade tendem a projetar material para fora do cadinho durante
aquecimento.
- Tendência à hidratação e facilidade de perdas das cinzas durante retirada da mufla e pesagem.
- Superestimação do conteúdo mineral, pois elementos residuais ficam na forma de óxidos, fosfatos,
nitratos, sulfatos, cloretos, ...

MATERIAIS

- Balança analítica
- Espátula
- Estufa a 105°C
- Cadinho de porcelana
- Dessecador com sílica
- Tenaz
- Mufla

PROCEDIMENTO

- Previamente, deixar cadinho em estufa a 105°C por 16 horas

- Resfriar em dessecador e pesar
- Pesar aproximadamente 2 g de amostra no cadinho
- Levar o cadinho com a amostra para mufla
- Ligar a mufla e regular aquecimento na temperatura de 550°C
- Manter incineração por 5 horas
- Desligar a mufla e aguardar redução da temperatura
- Retirar cadinho da mufla quando temperatura for menor que 150°C
- Resfriar em dessecador e pesar
- Calcular o teor de cinzas na amostra

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Observações:
- Em alguns casos, é recomendável uma incineração prévia da amostra em bico de bunsen ou bloco
digestor, até obtenção de um bloco de carvão no cadinho.
- Normalmente, a determinação de cinzas é realizada na sequência da determinação de umidade,
com o mesmo cadinho e resíduo de matéria seca.

EXEMPLO DE CÁLCULO

Peso do cadinho = 40 g
Peso amostra = 2 g
Cadinho + cinzas = 40,1 g
Cinzas = 0,1 g

2 g de amostra → 0,1 g de cinzas

100 g de amostra → X X = 5 g% de cinzas na amostra

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 TABELA DE COMPOSIÇÃO CENTESIMAL

Cada grupo deve preencher o Quadro abaixo e entregar juntamente com a 2ª parte dos
relatórios de aula prática.

Composição centesimal de _____________________ (nome do alimento)

Componente Unidade Quantidade

Umidade
Lipídios
Proteínas %
Fibra alimentar (na amostra integral)

Cinzas
Carboidratos*
Valor calórico Kcal
* Por diferença: carboidratos = [100 – (umidade + lipídios + proteínas + fibra alimentar + cinzas)]

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