Processos fermentativos

industriais 1

Cultura Starter

➢ Fase lag: a taxa de crescimento é nula, não há aumento da

população. Determinações de massa, geralmente demonstram que há
crescimento; isso é um reflexo de aumento no tamanho das células.
Essa fase é observada quando o microrganismo precisa se adaptar a
um meio de cultura diferente, ou quando as células sofrem algum
trauma físico ou químico. As células podem encontrar-se
desprovidas de coenzimas essenciais e outros constituintes
necessários para absorção dos nutrientes do meio. Antes de
iniciarem a multiplicação, as células passam por uma fase de
renovação, aumentando de tamanho em consequência da síntese de
material novo. Geralmente ela ocorre quando o meio de cultura atual
for mais pobre em nutrientes do que o original. Se o meio for o
mesmo ou mais rico, ela pode não ocorrer ou ser menos duradoura.
➢ Fase log (exponencial): a velocidade específica de crescimento é
constante e máxima (µmáx). Também possui o tempo de geração,
que é o intervalo de tempo necessário para dobrar o valor da
concentração celular. As células estão adaptadas, absorvendo os
nutrientes, sintetizando seus constituintes, crescendo e se
duplicando. É a fase mais importante do crescimento microbiano,
pois é possível estudar a influência de vários fatores analisando as
modificações da fisiologia e cinética.
➢ Fase estacionária: a concentração celular atinge seu máximo
(Xmáx), onde há balanço entre a velocidade de crescimento e a de
morte. Ocorre devido ao acúmulo de metabólitos tóxicos,
 esgotamento de nutrientes ou de oxigênio. São sintetizados vários
metabólitos secundários, que incluem antibióticos e enzimas.
➢ Fase de declínio: há taxa de crescimento negativa, ocorre lise
celular, autólise ou rompimento dos m.o.

➢ Peso seco (biomassa): determina a concentração celular do cultivo.

É retirada uma amostragem, faz a separação das células do meio,
lavagem para eliminar os interferentes do meio e depois a secagem
até massa constante, que seria retirar de tempos em tempos a
biomassa da estufa e pesar, até se obter a mesma massa em
sucessivas pesagens. A desvantagem desta técnica é o longo tempo
que ela demanda.
➢ Turbidimetria: determina a turbidez da amostra; é um método
menos preciso e sensível, porém é rápido, fácil e não destrói a
amostra. Pode-se utilizar o espectrofotômetro ou o turbidímetro. O
meio de cultivo é usado como branco para evitar interferentes.
Correlaciona-se a absorbância ou transmitância obtida com a
biomassa seca, por meio de uma curva-padrão previamente feita.
➢ Contagem total de células: contagem direta no microscópio, é uma
técnica rápida. São usadas câmaras especiais para amostras líquidas
(câmara de Neubauer). Algumas desvantagens são a não distinção
de células vivas e mortas, e possíveis contagens errôneas por conta
de pequenas dimensões ou de agregados celulares. Para distinção de
células vivas e mortas pode-se usar corantes.
➢ Contagem de células viáveis: as células viáveis têm poder de
formar colônias em meio sólido ou de tornar turvo o meio líquido. É
o método mais usado para contagem de leveduras e bactérias, no qual
são feitas diluições da suspensão, semeando-se alíquotas no meio
sólido. Conta-se as colônias e, com base na diluição feita, calcula-se
o número de células vivas presentes na suspensão original. Algumas
desvantagens são as possíveis colônias não visíveis a olho nu e o
tempo de resultado. Método comum, com alta sensibilidade, tem
resultados expressos em UFC/mL, é sensível para contagem de
culturas com baixa densidade celular.
Grande parte desses m.o.s vem do meio ambiente e é feito um
isolamento, retirando uma amostra e fazendo diversas incubações,
separando colônias, até que se possa selecionar e cultivar o m.o. de
interesse. Deve-se fazer testes específicos que indiquem qual m.o.
possui as características desejáveis para determinada atividade
(screening). Pode ser feito melhoramento de cepas por mutação.
Técnicas de engenharia metabólica, biologia sintética, engenharia
genética propõem melhorias de linhagens microbianas ou construção de
novos m.o.s voltados a aplicações específicas, a fim de se maximizar o
rendimento do processo, melhorar características do produto.

Existem coleções de culturas, centros especializados na manutenção de

recursos biológicos, que são capazes de fornecer material biológico
certificado para uso industrial, pesquisa e educação. Existem diversos
métodos de preservação de linhagens, como transferência ou subcultura
periódica, manutenção de culturas em óleo mineral, congelamento,
liofilização.
➢ Transferência ou subcultura periódica: ocorre em tubos de ensaio
com ágar inclinado ou placas com meio sólido (viabilidade:
semanas). O tempo de transferência depende da resistência do m.o.
Conserva-se sob refrigeração e para aumentar o tempo de vida pode-
se colocar uma camada de óleo. Algumas desvantagens são a
modificação das características originais e o elevado grau de
trabalho e espaço.
➢ Congelamento ou ultracongelamento: a redução da temperatura
diminui a velocidade das reações químicas, diminuindo a atividade
metabólica das células. O freezer (-15 a -20 °C) deve ser evitado pois
há modificação das culturas. Pode-se usar nitrogênio líquido (-196
°C), vapor de N líquido (-140 °C), ultrafreezer (-70 a -80 °C); além
de se poder usar crioprotetores para evitar danos. A preservação é de
mais de 30 anos, mas necessita de grande fornecimento de energia
elétrica ou de N líquido, o que pode ser custoso.
➢ Liofilização: a água é removida por evaporação a partir de uma
amostra congelada de células, obtendo-se amostras secas; esse
método permite a manutenção das células por longos períodos. Uma
desvantagem é a necessidade de liofilizadores.

Essa cultura é um preparado (fermento, inóculo) com grande número

de m.o.s, que são adicionados para elaboração de produtos fermentados.
Esses m.o.s são selecionados e possuem características bioquímicas
desejadas, além de serem produzidos sob condições controladas e
padronizadas (pH, temperatura, tempo). Essa cultura incorpora um
número significativo de m.o.s para que estes possam crescer, se
multiplicar e produzir as alterações desejáveis; supera o
desenvolvimento de agentes contaminantes, competindo pelo substrato
e produzindo substâncias inibidoras; ajusta escala de produção,
permitindo produção programada de produtos, causa uniformidade no
produto final; pode induzir mudança de textura, tempo de conservação,
aroma, incremento nutricional; produz compostos desejáveis, como
álcool, enzimas. Exemplo de cultura starter: leveduras de fermentação
alcoólica. Possuem crescimento rápido e eficiência fermentativa, alto
rendimento em álcool e boa tolerância a este, tolerância à pressão
osmótica do meio e a temperaturas mais altas, baixo pH na fermentação
(menor perigo de contaminação), estabilidade genética.
Algumas características desejáveis de microrganismos para aplicação
industrial é ter capacidade de gerar o produto-alvo de modo eficiente,
possuis estabilidade genética, ter possibilidade de melhoramento
genético, ter certificado GRAS quando necessário, não ter condições de
processo muito complexas, de preferência produzir compostos
extracelulares.
Para a produção do inóculo precisa-se fazer repiques constantes, e no
ponto médio da fase exponencial de crescimento refrigerar para manter
o maior número de células viáveis; cuidar das condições de estocagem;
usar sempre a mesma porcentagem de inóculo. Deve-se constantemente
avaliar a presença de contaminantes, por um exame microscópico e por
detecção de substâncias que não são produzidas pelos starters.