Universidade de São Paulo – USP

Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto – FFCLRP

Departamento de Química

Bioquímica Industrial Experimental

Prática 11: Eletroforese em Gel de Agarose

Discentes
Ana Lívia Vezzoso N° USP: 10392118
Larissa Beitum N° USP: 10408278
Maisa Mitiko Nº USP: 10293494

Ribeirão Preto
2020
 I. Introdução

A eletroforese em gel é uma técnica utilizada para a separação de

moléculas de proteínas, RNA e DNA de acordo com seu tamanho, onde as
amostras de DNA são carregadas nas cavidades (ou poços) que estão
localizados em uma das extremidades de um gel, nesse caso o de agarose
(utilizado para fragmentos entre 100pb a 12mil pares de bases), e uma corrente
elétrica é aplicada para que ocorra o avanço da mesma pelo gel.

Esses fragmentos de DNA estão carregados negativamente, movendo-se

na direção do eletrodo carregado positivamente. Além disso, esses fragmentos
tem a mesma quantidade de carga por massa, sendo assim, os menores
atravessam o gel mais rapidamente do que os maiores.

A velocidade com que as moléculas migram assim como o poder de

resolução de um gel, depende de alguns parâmetros, como o tamanho e forma
da molécula, voltagem aplicada, concentração do gel e tampão de corrida.

Quando se utiliza um corante para pigmentação do gel, ele se liga ao

DNA, os quais podem ser vistos como bandas, onde cada uma representa um
grupo de fragmentos de DNA de mesmo tamanho.

II. Objetivos

Esse experimento tem por objetivo visualizar o resultado da PCR

realizada no experimento anterior em gel de agarose 1%.
III. Materiais e métodos

❖ Materiais por grupo:

✓ Placa molde
✓ Pipeta automática P1000 (1)
✓ Pipeta automática P200 ou P100 (1)
✓ Pipeta automática P10 (1)
✓ Ponteiras P1000, P200 e P10 autoclavadas
✓ Descarte para ponteiras (1)

❖ Materiais de uso geral:

✓ Cuba e demais acessórios para eletroforese horizontal
✓ Fonte para eletroforese
✓ Transluminador com luz UV

❖ Reagentes:

✓ Tampão TAE 50X

o Triz-Base
o Ácido acético glacial
o Ácido etileno diamino tetracético (EDTA)
✓ Corante para DNA (nesta aula será utilizado o GelRed TM)
✓ Marcador de peso molecular de 1 Kb
✓ Tampão da amostra 6X (loading buffer)
o 60mM EDTA
o 10mM Tris-HCl, pH 7.6
o Azul de bromofenol 0,25% (m/v)
o Xileno cianol 0,25% (m/v)
✓ Glicerol 50% (v/v)
 ❖ Métodos

• Preparo do gel e do equipamento:

➢ Solução tampão:

- Manter pH estável (H+ e OH- podem influenciar na carga líquida da

molécula);

- Maior força iônica (carrega mais corrente que a água);

- Tris-Acetato e EDTA-TAE (melhor resolução para fragmentos maiores).

➢ Gel-Loading Buffer: utilizado para aumentar a densidade e a cor da

amostra.

• Preparo do gel de agarose

➢ Mediu-se previamente o volume para aplicação do gel na placa

molde, preparando uma quantidade suficiente para preenche-la.
➢ Fez-se uma solução 1% de agarose, em tampão TBE 1X em um
erlenmeyer, levando ao forno micro-ondas (potência média), por 1
minuto para derretimento do gel, agitando e repetindo o processo
até dissolução completa do gel.
➢ Após esfriar um pouco, adicionou-se o corante de DNA (nesse
caso, gel Red) despejando na placa molde, evitando a
polimerização no frasco, em seguida adicionando o pente para a
formação das canaletas.
➢ Aguardou-se a polimerização, para retirada do pente e introdução
do gel na cuba. Adicionando tampão TBE 1X na cuba até cobrir
todo o gel.
➢ Programou-se a fonte com a voltagem desejada, entre 1 a 5 V/cm,
utilizando voltagem de 80 V.
➢ Adicionou-se 5 µL do tampão da amostra (loading buffer 6X) na
reação de PCR, o qual é um marcador azul para visualização da
corrida da amostra no gel (o azul de bromofenol migra juntamente
com um fragmento de DNA de aproximadamente com 0,3kb e o
xileno cianol com um fragmento de 4 kb em géis de agarose de 0,5
a 1,4% em TA).
➢ Aplicou-se 15 µL da reação de PCR com o loading buffer em uma
canaleta do gel. Aplicando em seguida 5 µL do marcador de peso
molecular em outra canaleta (1 Kb DNA ladder).
➢ Ligou-se a cuba deixando correr até o primeiro tampão sair do gel,
realizando a eletroforese das amostras durante 45 min a 120V.
➢ Desligou-se a cuba e transferiu-se o gel para um transluminador
com luz UV para visualizar as bandas dos fragmentos de DNA.
 IV. Resultados e Discussões

Os experimentos da segunda parte da disciplina se encerram neste último

estudo sobre o processo de eletroforese em gel de agarose. Considerando a
linha traçada até este momento, tivemos o preparo de uma célula competente
(E. coli), a sua transformação com o plasmídeo contendo o inserto desejado, a
extração e purificação do mesmo, seguindo para o processo de PCR, e por fim,
a última análise através da eletroforese.

O processo em si e seus passos a serem seguidos já foram abordados

nos itens I e III, respectivamente. Portanto nossa discussão se concentrará
apenas na análise de um exemplo disponibilizado, mais uma vez, pela docente
responsável.

Quando pensamos na eletroforese em si sabemos que ela é uma técnica

usada para separar os fragmentos de DNA (ou ainda RNA e proteínas).
Seguindo então a linha traçada nos últimos experimentos, simulamos agora
que após o processo de PCR nosso objetivo é analisar se o resultado é positivo
e conseguimos, portanto, ampliar o gene de interesse.

O gene de interesse da nossa simulação será o fragmento disponibilizado

pela docente.

Figura 1 – Fragmento de interesse para o processo de amplificação por PCR.

 Observando o fragmento de interesse em vermelho, sabemos que o
mesmo apresenta juntamente com os primers reverse e forward um total de
1369 pares de base. Portanto após o processo de eletroforese esperamos que
a revelação do gel nos mostre a presença de fragmentos de DNA nesta faixa,
garantindo assim que a nossa ampliação foi bem sucedida e nas nossas
amostras estão presentes o gene de interesse amplificado.

Figura 2 - Revelação do gel da eletroforese corados com GelRed e brometo de etídeo (Imagem
disponibilizada no encontro on-line)

Conforme podemos observar na figura acima, o resultado obtido pela

eletroforese em gel corado com GelRed (gel da esquerda) apresenta bandas
entre os valores de 1000 e 1500 pares de base, sabendo-se que o nosso gene
de interesse contem 1369 pares de base como já mencionado, podemos
apontar sua presença na amostra, visto que podemos estimar através da
revelação do gel a presença de segmentos com aproximadamente esse
tamanho.
Portanto o resultado deste experimento se mostra satisfatório,
comprovando a presença do nosso gene de interesse através da medida de
tamanho do segmento, o que nos leva a avaliar também o processo de PCR
anterior como bem sucedido, que é o que queríamos comprovar através da
técnica de eletroforese.
 V. Questões

(Questão 1) Escreva a sequência do primer reverse do exemplo fornecido.

R: O fragmento para exemplo fornecido se encontra na figura 1, no item

“IV – Resultados e Discussões”. O fragmento em questão apresenta a
sequência direta do primer forward e do inserto de interesse. Já para a
sequência do primer reverse, é necessário se fazer a relação com a sequência
complementar, assim, temos que a sequência desejada é:

GCCCGGG CAGCTGACGT CTCCGGACGT ACGTT

TTGCA TGCAGGCCTC TGCAGTCGAC GGGCCCG

5’ → 3’

(Questão 2) Por que foi feita a PCR? O que é o produto da PCR?

R: A PCR permite a amplificação de cópias de um segmento de DNA em

várias ordens de grandeza (milhões ou até bilhões). Também, a partir de
uma clonagem de DNA, em que ocorre a tentativa de inserir um gene em um
plasmídeo de DNA circular, a técnica é caracterizada por sua rapidez e
precisão em um tempo muito curto.

O produto de PCR deve então ser analisado por eletroforese em gel de

agarose para verificar se há somente uma banda presente, o que pode
indicar que o produto desejado foi amplificado e que posteriormente será
purificado. Ou então, se há presença de mais bandas, indica que a PCR
não está específica, e as condições da PCR deverão ser modificadas até
que somente o produto desejado seja amplificado.

(Questão 3) Como funciona a eletroforese de DNA em gel de agarose?

R: O uso da eletroforese para a análise de DNA é um dos métodos

fundamentais nos laboratórios de pesquisa. O princípio se baseia no fato da
molécula de DNA possuir carga negativa em seus grupos fosfatos, em valores
de pH neutro ou alcalino e desta forma, quando aplicado ou imerso em uma
matriz de gel submetida a um campo elétrico, migra em direção ao polo
positivo. Nas cubas padrões encontradas em laboratórios, a voltagem varia
entre 50 e 110 V. A velocidade da migração dependerá do tamanho da
molécula. Por isso, em um dado momento da eletroforese, moléculas de
tamanhos distintos se encontram em diferentes pontos da matriz e torna
possível sua separação.

O gel de agarose é preparado a partir da mistura de um tampão e

agarose, não apresentando toxicidade. A polimerização é rápida e o gel, após
seu uso, pode ser reciclado e reutilizado na elaboração de outros géis. Além
disso, a eletroforese em gel de agarose pode ser usada como método analítico
ou preparativo, isto é, quando o fragmento de DNA é recuperado e purificado a
partir do gel.

A agarose é um polissacarídeo que forma uma estrutura de rede e

permite a regulação da velocidade da migração das moléculas durante a
separação. A quantidade adicionada, para a concentração final (% [w/v]),
dependerá dos tamanhos de fragmentos que serão trabalhados na corrida.
Quando ainda morna, é colocado um pente (o mesmo fica a 1 mm acima do
fundo da forma) que servirá como molde para formar os poços no gel para
reservarem as amostras de DNA que serão aplicadas. Ao esfriar e polimerizar,
a agarose se torna turva e com resistência diretamente proporcional à
concentração de agarose utilizada.

Assim, o principal parâmetro para condicionar a migração de DNA numa

mesma eletroforese é o tamanho dos fragmentos. Para isso, é utilizado o
marcador de número de pares de bases (pb), uma mistura de diversos
fragmentos de DNA de tamanhos e concentrações conhecidas, o que permite
uma estimativa visual do tamanho dos fragmentos de DNA de uma dada
amostra.

(Questão 4) Por que foi feita a eletroforese?

R: Respondido no item “IV. Resultados e Discussões”.

(Questão 5) Porque usar um corante no gel? Cite outras opções de
corantes e como estes atuam e suas vantagens e desvantagens.

R: A utilização do corante contribui para visualizar o resultado da corrida

do DNA nos géis de agarose, sob a luz ultravioleta (UV). Anteriormente era
muito empregado o corante brometo de etídeo (EtBr), pois este se intercala
entre as bases dos ácidos nucléicos e, na presença de luz UV (entre 260 e
360nm), fluoresce e apresenta a coloração vermelho alaranjado (590nm), e
assim é possível recortar as bandas de interesse. Este método possibilita a
detecção de uma quantidade igual ou superior a 10 ng de DNA e a intensidade
de fluorescência emitida é proporcional à concentração de DNA presente na
amostra.

Seu uso ocorre por 3 diferentes formas: aplicado diretamente no gel, no

tampão da amostra a ser aplicada, ou quando o gel é submergido em solução
de EtBr após a corrida. Porém, a substância vem sendo substituída por outros
corantes devido a sua toxicidade e, a mesma pode interferir no padrão de
migração das diversas conformações que a molécula de DNA assume. Ainda,
provocam a contaminação da cuba utilizada na corrida, além das vidrarias e
utensílios usados na preparação do gel.

Deste modo, a melhor opção é realizar a substituição por corantes que

sejam atóxicos, caracterizados por serem mais sensíveis e não mutagênicos.
Dentre os produtos disponíveis, estão o Azul de Metileno, que apesar de pouco
sensível, não apresenta potencial mutagênico e não requer luz U.V; também há
o Sybr Safe®, corante fluorescente em DNA no gel de agarose e no gel de
poliacrilamida, que exibe a mesma sensibilidade que o EtBr e é visualizado no
transiluminador de luz azul; por último, o GelRed e o GelGreen podem ser ser
adicionados antes da homogenização do gel e ambos são termoestáveis.

(Questão 6) Analisar o padrão de bandas no gel. Estimar o tamanho das

bandas amplificadas. Como este tamanho se relaciona com o fragmento
mostrado no slide 5. É o tamanho do fragmento de DNA esperado?

R: Respondido no item “IV. Resultados e Discussões”.

 VI. Conclusão

Com a finalização deste último experimento, embora não tenha sido

realizada a prática presencialmente de nenhum deles, foi possível
complementar os conceitos teóricos envolvidos nas técnicas de preparação de
uma célula competente, transformação com um vetor contendo um inserto de
interesse, extração e purificação do mesmo, seguindo para a amplificação em
PCR e por fim a análise em eletroforese de gel, técnicas estas que compõem
um grande segmento da bioquímica industrial.

Nesta prática em si, a proposta de relembrar a teoria envolta de técnica

de eletroforese em gel de agarose, evidencia essa como sendo um método
simples e eficiente, que permite separação, identificação e purificação de
moléculas de DNA.

Além da teoria, esta prática também possibilitou a simulação de um

resultado de eletroforese para um fragmento desejado, o qual apresentou
resultados dentro do esperado pelo grupo, o que mais uma vez nos leva a
avaliar o procedimento de eletroforese como uma técnica válida por ser
relativamente simples, barata e aplicável.

VII. Bibliografia

BORZANI, W.; LIMA, V. A.; AQUARONE, E. Biotecnologia: Engenharia

Bioquímica. São Paulo. Ed. Edgard Blucher. 2001.

Conceitos básicos de técnicas em biologia molecular, por Liziane

Maria de Lima; Campina Grande, 2008

Marques, Marilis do Valle. Biologia Molecular e Genética Bacteriana.

Ribeirão Preto: Sociedade Brasileira de Genética, Editor Cubo. 2012.