Electroforese em Gel

de Poliacrilamida
 Electroforese
 Técnica de separação que se baseia na migração de proteínas
carregadas num campo eléctrico quando administrada uma
diferença de potencial.
 Electroforese em Gel
 Técnica de separação de moléculas que envolve a migração
de partículas num determinado gel durante a aplicação de uma
diferença de potencial.
 Gel de Poliacrilamida
 Poliacrilamida é uma mistura de 2 polímeros, que origina
uma estrutura em “rede”:

• Acrilamida

• Bisacrilamida

 É um gel que facilita a migração de proteínas na

electroforese

 Separa as proteínas segundo a sua massa molecular

 Modificações nas concentrações dos 2 polímeros originam
diferenças na separação das proteínas

• Gel de 15% de acrilamida usa-se para separar proteínas

com massa molecular baixa

• Gel até 7,5% de acrilamida usa-se para separar

proteínas com massa molecular elevada
 SDS – PAGE
Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel Electrophoresis

Electroforese em gel que recorre ao detergente dodecil

sulfato de sódio.
 SDS
 É usado em produtos domésticos como pastas de dentes,
shampôs, aspirinas, etc.

 Molécula carregada negativamente que supera a carga da

proteína e faz com que ela migre em direcção ao eléctrodo
positivo, quando uma voltagem é aplicada no campo eléctrico.

 Depois da electroforese, as proteínas são visualizadas

adicionando um corante como o Azul de Coomassie, que se
liga às proteínas mas não ao gel.
 Azul de Coomassie
 Corante de cor azul que facilita a visualização e
identificação das proteínas;

 Corante ácido, grupo cromóforo carregado negativamente;

 Tem uma estrutura apolar e liga-se a proteínas não

específicas.
 Western Blot
• Método utilizado para assegurar que temos a proteína
pretendida, com a ajuda de um anticorpo específico.
 Método de execução
1. Preparação do tecido

2. Electroforese em gel

3. Transferência

4. Bloqueio

5. Detecção

6. Análise
 1. Preparação do tecido
• Homogeneização das amostras:

 Sonicação;
 Força mecânica.

• As amostras são fervidas numa solução

tampão que tem um corante (DSS).
 2. Electroforese em gel
• As proteínas são separadas segundo o seu peso
molecular por electroforese em gel.
 3. Transferência
• Proteínas movidas do gel para uma membrana:

 Nitrocelulose;

 PVDF.
 4. Bloqueio
• Impede as interacções não específicas entre a
membrana e os anticorpos.

• Coloca-se a membrana numa solução diluída de uma

proteína – BSA ou leite desnatado, com uma pequena
quantidade de detergente – Tween 20 ou carbono
coloidal.
 5. Detecção

• Trata-se a membrana com as proteínas de interesse

• Liga-se uma enzima reveladora

a eles
 5.Detecção

5.1 – Método de dois passos

5.2 – Método de um passo

 5.1 – Método de dois passos

• Dois anticorpos:

 Primário;

 Secundário.
 5.2 – Método de um passo
• Utiliza-se apenas um anticorpo sonda que reconheça a
proteína de interesse e que tenha uma marcação
detectável.
 6. Análise

6.1 – Detecção colorimétrica

6.2 – Quimioluminescência

6.3 – Detecção radioactiva

6.4 – Detecção fluorescente

Protocolo
 D – Visualização num gel de
poliacrilamida, em condições
desnaturantes (SDS-PAGE), das
amostras recolhidas ao longo da
expressão e purificação da
proteína de fusão
D.1. Preparação do gel de poliacrilamida

D.2. Preparação das amostras e electroforese

1. Diluir as amostras com solução desnaturante 2x

2. Aplicar as amostras no gel

3. Corar o gel por agitação

D.3. Aplicação das amostras no gel de poliacrilamida em

condições desnaturantes
 E – Electrotransferência das
proteínas do gel de poliacrilamida
para uma membrana de PVDF e
imunodetecção (Western Blot)
E.1 – Electrotransferência para a membrana de
PVDF

E.2 – Imunodetecção

E.3
a) Método ECF de revelação de imunoblot

b) Revelação do imunoblot usando um

substrato cromogénico
Imunoblot