BIOLOGIA

MOLECULAR E
BIOTECNOLOGIA

Fernanda Stapenhorst
Técnicas básicas em
biologia molecular
Objetivos de aprendizagem
Ao final deste texto, você deve apresentar os seguintes aprendizados:

 Identificar as principais técnicas de biologia molecular.

 Estimar a importância das técnicas aplicadas à biologia molecular.
 Analisar a aplicação das técnicas de biologia molecular.

Introdução
Para a realização de pesquisas e diagnósticos em biologia molecular,
algumas técnicas são utilizadas, as quais permitem a avaliação de parâ-
metros moleculares em uma amostra. Essas técnicas são empregadas em
testes de paternidade, na avaliação forense de amostras de DNA de uma
cena de crime, em diagnósticos de patologias, entre outras aplicações. 
Neste capítulo, você vai estudar as principais técnicas de separação
de moléculas, como DNA, RNA e proteínas. Estudará também as técnicas
de detecção dessas moléculas e de amplificação de DNA, bem como
suas aplicações e importância.

Principais técnicas de biologia molecular

Técnicas de separação de moléculas

Muitas vezes, para analisarmos moléculas como DNA, RNA e proteínas,
devemos separá-las previamente. Isso permite a análise de um fragmento
ou de uma proteína específica. Existem técnicas que permitem a separação
dessas moléculas de acordo com seu peso molecular, como a eletroforese em
gel de agarose ou em gel de poliacrilamida. Além de ser um passo inicial de
algumas técnicas de análise molecular, a eletroforese em gel também é muito
utilizada como procedimento único, como veremos a seguir.
2 Técnicas básicas em biologia molecular

Eletroforese

A eletroforese em gel é uma técnica de separação de moléculas por meio

de um gel sobre o qual é aplicada uma diferença de potencial. Ela pode ser
utilizada para a separação de proteínas, DNA e RNA. Vamos inicialmente
falar da aplicação da eletroforese na separação de proteínas. Essa técnica
baseia-se no fato de que a aplicação de um campo elétrico em uma solução
que contém uma molécula proteica faz com que a proteína migre a uma
velocidade que pode variar de acordo com sua carga líquida, seu tama-
nho e sua forma. A carga de uma proteína vai depender dos aminoácidos
que a compõem. A separação de proteínas é geralmente feita em um gel
de poliacrilamida-SDS (dodecilsulfato de sódio), o qual possui ligações
cruzadas como uma matriz, pelas quais as proteínas migram. Essa matriz
é feita pela polimerização de monômeros, de modo que o tamanho do
poro pode ser ajustado de acordo com as proteínas que se deseja estudar.
Inicialmente, as proteínas são dissolvidas em um detergente fortemente
carregado negativamente, o SDS. Isso vai fazer com que a proteína seja
desnaturada em uma cadeia estendida e totalmente solúvel na solução.
Nesse processo, as proteínas adquirem uma carga negativa, de forma que,
ao aplicarmos uma voltagem, migrem para o polo positivo. Assim, são
excluídas as variáveis carga e forma, de maneira que apenas o tamanho
da proteína irá influenciar na velocidade de migração.
Em uma malha de poliacrilamida, as proteínas maiores terão sua ve-
locidade retardada em relação às menores, que passarão pelos poros mais
facilmente. Dessa forma, as proteínas de uma amostra são separadas em
bandas individuais de proteínas, arranjadas de acordo com seu peso mo-
lecular. Para a visualização dessas bandas, o gel é corado com o corante
azul de Coomassie ou com coloração de prata, a qual detecta até mesmo 10
ng de proteína. Algumas vezes, as proteínas são marcadas com um isótopo
radioativo, de maneira que a exposição do gel a um filme resulta numa
autorradiografia em que as bandas de proteínas são visíveis (ALBERTS
et al., 2017) (Figura 1).
 Técnicas básicas em biologia molecular 3

a) Amostra aplicada no b) subunidades,

Proteína com duas
A e B,
gel com uma pipeta unidas por uma Proteína com uma
ligação dissulfeto única unidade
Cátodo A B C
Cuba de plástico S-S

AQUECIDAS COM SDS E MERCAPTOETANOL

_
__ __ _ __
__ __ ___ ___ ___ __
__ __ __ _
___ _ _ _ __ ____ _____ ___ ___ _ _ __ __ _ _ __
_ _ _ ___ _SH_ ___ _
_ _ _ _ _ __ _ _ _ _ __ ___
_ __
__ _ __ ____ __ _ _ _
Tampão _
__
__ ___ _HS _ ______ __
Moléculas
__ _ _ __
_
_ _
_ _ __ __
__ _ ___
_ _ __ _ __ _
__ ___ ___ _ _____ __ _ de SDS
__
__ _ __ _ ___ ___
__ _ _ _ _ carregadas C
Gel + A
_ _ __
B negativamente
Ânodo
ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA

B
Tampão C

A
c) Massa
+

molecular Placa de gel de poliacrilamida

1 2 3 4 5
(dáltons)
100.000

40.000

15.000

Figura 1. Eletroforese em gel. a) Aplicação da amostra no aparelho de eletroforese. b)

Tratamento com SDS e mercaptoetanol, para a proteína adquirir carga negativa, e separação
das cadeias polipeptídicas em diferentes subunidades. c) Exemplo de um gel contendo
bandas de proteínas separadas pelo seu peso molecular.
Fonte: Alberts et al. (2017, p. 453).
4 Técnicas básicas em biologia molecular

Outra técnica que pode ser empregada é a eletroforese em gel de agarose,

muito usada para a separação de moléculas de DNA, RNA e proteínas maiores
do que 200 kDa. Como o DNA e o RNA possuem cargas negativas, não é
preciso solubilizá-los em SDS antes da eletroforese para que migrem para o polo
positivo. De maneira semelhante ao que ocorre na eletroforese de proteínas em
gel de poliacrilamida, os fragmentos de DNA e de RNA serão separados pelo
seu tamanho. Os fragmentos maiores, sendo mais lentos, ficam posicionados
na parte superior do gel (ALBERTS et al., 2017).

Importância e aplicação

Os diferentes métodos de eletroforese em gel permitiram o desenvolvimento

de novas técnicas, como as técnicas de detecção de moléculas que veremos
a seguir. A eletroforese em gel permite que fragmentos de DNA, mRNA e
proteínas específicas sejam analisados separadamente. Essas técnicas são
utilizadas em diversas áreas do conhecimento, como ciências forenses, biologia
molecular, genética, microbiologia e bioquímica. A eletroforese de ácidos
nucleicos pode ser utilizada para:

 estimar o tamanho de moléculas de DNA após o uso de enzimas de

restrição, como em um mapa de restrição de DNA clonado;
 a análise de produtos de PCR, verificando se o gene de interesse foi
amplificado, como em testes diagnósticos ou em testes forenses de
impressão digital de DNA;
 a separação de moléculas como um passo do Southern blot e Northern blot.

A eletroforese de proteínas pode ter as seguintes aplicações:

 determinação do peso molecular de uma proteína;

 diagnóstico para a presença de proteínas anormais em uma amostra;
 separação de proteínas como um passo do Western blot.

Técnicas de detecção de moléculas

A detecção de moléculas específicas, como fragmentos de DNA, mRNA e
proteínas, é muito utilizada tanto na pesquisa como em testes diagnósticos.
Para todas as técnicas de detecção que veremos a seguir, o primeiro passo é
 Técnicas básicas em biologia molecular 5

a eletroforese em gel. O Western blot é a técnica para a detecção de proteínas

específicas, o Southern blot para a detecção de fragmentos de DNA e o Northern
blot para a detecção de mRNA. A primeira dessas técnicas a ser desenvolvida
foi o Southern blot, que recebeu este nome pelo pesquisador que a criou, Edwin
Southern. As demais técnicas foram nomeadas por sua similaridade com o
Southern blot, em um trocadilho com as coordenadas geográficas.

Western blot

Após a realização da eletroforese em gel de proteínas, é possível identificar

uma proteína específica pela exposição de todas as proteínas presentes no gel
a um anticorpo contra esta proteína de interesse, marcado com um isótopo
radioativo ou corante fluorescente. Para isso, inicialmente deve-se transferir
as proteínas do gel para uma membrana de nitrocelulose ou de náilon. O gel é
posicionado em cima da membrana, e uma corrente elétrica é aplicada, fazendo
com que as proteínas do gel migrem em direção à membrana, mantendo a
organização que possuíam no gel. Como a membrana é uma superfície que
se liga facilmente a proteínas e, portanto, a anticorpos, deve-se fazer um
procedimento para impedir a interação entre o anticorpo que será utilizado e
a membrana. O bloqueio de ligações inespecíficas é feito pela exposição da
membrana a uma solução contendo proteínas, que normalmente é uma solução
com 5% de albumina bovina ou até mesmo leite em pó diluído em tampão.
Assim, essas proteínas irão ligar-se à membrana em todos os lugares onde as
proteínas que migraram não se encontram, fazendo com que o anticorpo que
será posteriormente utilizado não consiga se ligar em lugar algum da membrana
que não sejam os sítios de ligação para a proteína de interesse.
Após o bloqueio, a membrana está pronta para ser incubada com o anticorpo
que reconhece a proteína de interesse. Uma solução de tampão e anticorpo é
preparada, e a membrana fica nesta solução overnight. Na maioria das vezes,
são utilizados dois anticorpos para a detecção das proteínas: um anticorpo
primário reconhece a proteína de interesse e, após a incubação, um anticorpo
secundário, contendo uma marcação radioativa ou fluorescente, reconhece
o anticorpo primário. Assim, este sinal pode ser detectado e é possível fazer
a quantificação da proteína de interesse (ALBERTS et al., 2017; B., MAH-
MOOD; YANG, 2012).
6 Técnicas básicas em biologia molecular

Você sabe como ocorre a eletrotransferência?

O gel é posicionado acima da membrana e entre filtros de papel, previamente molhados
com tampão de transferência. Esse “sanduíche” é posicionado no aparelho, onde é
aplicada uma corrente elétrica que faz com que as proteínas do gel migrem para a
membrana.

Southern blot

De modo semelhante ao que ocorre com o Western blot, a técnica de Southern

blot pode ser utilizada para a separação e identificação de fragmentos de fita
dupla de DNA. O método é muito similar ao Western blot: primeiro, é feita a
eletroforese de DNA, na qual o DNA é clivado com endonucleases de restrição
e separado, de acordo com o tamanho, pela eletroforese em gel de agarose. Em
seguida, o gel é exposto a uma solução alcalina para que haja a desnaturação
das moléculas de DNA, separando as fitas. Esse processo é necessário para
a posterior hibridização de sondas. Depois disso, é feita a transferência dos
fragmentos para uma membrana de nitrocelulose ou de náilon. Essa técnica,
diferentemente do Western blot, utiliza sondas de DNA com marcadores radio-
ativos ou químicos para a detecção. O uso de sondas baseia-se no princípio de
hibridização das moléculas de DNA de fita simples e de RNA com uma nova
fita complementar. Assim, é utilizado um pequeno fragmento de DNA de fita
simples, chamado de sonda, marcado radioativamente ou quimicamente, cuja
sequência de nucleotídeos seja complementar à sequência do fragmento de
DNA de interesse. Dessa maneira, a membrana é exposta à sonda de hibridi-
zação. Em seguida, é feita a detecção do sinal da sonda por autorradiografia,
no caso de marcadores radioativos ou fluorescentes (ALBERTS et al., 2017).

Northern blot

Esta técnica é similar ao Southern Blot, mas é utilizada para a separação e identifi-
cação de moléculas de mRNA. Essas moléculas são separadas de acordo com o seu
tamanho na eletroforese em gel de agarose. Em seguida, é realizada a transferência
para uma membrana de nitrocelulose ou de náilon. De forma semelhante ao que
ocorre no Southern Blot, a membrana é incubada com uma solução contendo uma
 Técnicas básicas em biologia molecular 7

sonda de DNA marcada complementar ao mRNA de interesse. Assim, as moléculas

de RNA que hibridizam com a sonda são detectadas pelo sinal da sonda, por meio
de autorradiografia ou por meios químicos (ALBERTS et al., 2017).

Importância e aplicação
As técnicas de detecção de moléculas são amplamente utilizadas na biologia
molecular e na bioquímica. A técnica de Western blot é utilizada para a de-
tecção qualitativa de proteínas específicas e modificações de proteínas. Além
disso, a partir dessa técnica, pode ser feita uma análise semi-quantitativa
da proteína de interesse, analisando-se o tamanho e a intensidade da banda
correspondente na membrana. Assim, é possível analisar se, em determinadas
condições, uma proteína está mais ou menos presente, além do uso para a
verificação da produção de proteína após clonagem. Ademais, essa técnica
é utilizada para diagnósticos médicos de doenças como o HIV, variante da
doença de Creutzfeldt-Jakob e doença de Lyme.
O Southern blot, por sua vez, pode ser utilizado para a identificação de
genes homólogos de diferentes espécies, com base na sequência já conhecida
de uma espécie. A membrana é exposta a uma sonda cuja sequência é com-
plementar à sequência do gene de interesse de outra espécie, de modo que
os fragmentos que hibridizarem com essa sonda possam ser posteriormente
analisados (CLARK; PAZDERNIK, 2012). Além disso, essa técnica também
pode ser utilizada para a impressão digital de DNA, muito presente nas ciências
forenses (NELSON; COX, 2005).
Por fim, o Northern blot é utilizado para a análise dos padrões de expres-
são gênica entre tecidos, órgãos e diferentes condições de uma célula. Essa
técnica já foi utilizada para a avaliação da expressão de oncogenes e de genes
supressores de tumor em células cancerígenas em comparação com células
sadias (STREIT et al., 2009). A técnica também pode ser utilizada para avaliar
mutações (DURAND; ZUKIN, 1993).

Técnicas de amplificação de DNA

Uma das técnicas mais utilizadas na biologia molecular é a PCR (reação em
cadeia da polimerase), que amplifica o DNA e permite sua análise por técnicas
que requerem grandes quantidades de DNA. A partir dessa técnica, outras
variações foram desenvolvidas, como a PCR em tempo real.
8 Técnicas básicas em biologia molecular

PCR convencional

A PCR é uma técnica muito utilizada em biologia molecular. Tem como obje-
tivo amplificar fragmentos de DNA para serem posteriormente utilizados em
outras análises. Para a realização dessa técnica, são necessários os seguintes
elementos:

 DNA isolado do organismo que se deseja estudar;

 primers, que são pequenas sequências de nucleotídeos complementares
às sequências das duas fitas nas extremidades do fragmento que se
deseja ampliar. Esses oligonucleotídeos irão fornecer o ponto de partida
necessário para a síntese da fita complementar pela DNA-polimerase;
 DNA-polimerase de bactérias termofílicas. Como a técnica requer o
aquecimento da solução contendo todos os elementos a altas tempera-
turas, deve ser utilizada uma DNA-polimerase que suporte essas con-
dições. Em geral, é utilizada a enzima da bactéria Thermus aquaticus,
chamada de Taq DNA-polimerase;
 nucleotídeos que servirão como matéria prima para a síntese de novos
ácidos nucleicos, chamados de desoxinucleotídeos trifosfato (dNTP);
 íons de magnésio divalente, que servem como cofator para a
DNA-polimerase;
 tampão de reação, o qual fornece as condições ideais para as reações
ocorrerem;
 equipamento termociclador, onde a técnica é feita. Realiza os ciclos de
temperatura necessários.

A técnica de PCR baseia-se no seguinte princípio: quando aquecidas a aproxi-

madamente 100°C, as moléculas de DNA desnaturam, havendo a separação das
fitas; quando expostas a 65°C por um certo período, as fitas voltam a ligar-se,
ou hibridizar. Assim, inicialmente os elementos acima são aquecidos a uma
temperatura de 90 a 96°C para que haja a desnaturação do DNA. Depois disso,
a temperatura cai para 65°C para que os primers possam se anelar na região
de interesse do DNA molde. Por fim, a temperatura sobe para 70°C para que a
DNA-polimerase realize o alongamento da nova fita de DNA a partir dos primers.
A cada ciclo, são realizados esses três passos, e em geral são necessários de
20 a 30 ciclos para a amplificação do DNA (ALBERTS et al., 2017). Como as
fitas formadas a cada ciclo serão utilizadas como molde para a síntese de novas
fitas no próximo ciclo, há um crescimento exponencial no número de cópias,
de forma que, a cada ciclo, dobram-se o número de cópias de DNA (Figura 2).
 Técnicas básicas em biologia molecular 9

Figura 2. PCR. A cada ciclo, os primers anelam-se na fita molde de DNA para que a DNA-
-polimerase realize o alongamento, sintetizando novas fitas. Cada molécula de DNA formada
em um ciclo é utilizada como molde para o próximo, havendo um aumento exponencial
no número de moléculas de DNA.
Fonte: Khan Academy (c2018).

PCR em tempo real

Novas tecnologias permitem a realização da técnica de PCR com o monitora-

mento da amplificação em tempo real, por meio da emissão de fluorescência
por sondas. A reação ocorre em tubos de vidro, visto que esse material per-
mite a passagem da luz para a ativação do fluoróforo e para a monitoração
da fluorescência emitida. São adicionadas sondas fluorescentes que se ligam
ao DNA, cuja emissão de fluorescência aumenta com essa ligação. Algumas
sondas mais simples não são específicas para uma sequência, de forma que
emitem fluorescência ao ligarem-se em DNA de dupla fita, como a sonda SYBR
Green. Esse tipo de sonda monitora apenas a quantidade de DNA dupla fita.
Para garantir que uma sequência específica está sendo amplificada, é neces-
sário o uso de uma sonda sequência-específica, como a sonda TaqMan. Essa
sonda consiste em dois fluoróforos ligados por uma sequência de DNA que se
hibridiza com o meio da sequência-alvo. Quando estes fluoróforos estão ligados
à sonda, não há a emissão de fluorescência. Quando a sonda se liga ao DNA-
-alvo, a Taq polimerase corta a sonda em nucleotídeos, soltando os fluoróforos
e permitindo a liberação da fluorescência, a qual pode ser detectada (Figura 3).
Assim, a fluorescência está diretamente relacionada à quantidade de sequências
específicas que foram amplificadas. Dessa forma, a técnica é quantitativa, pois
mede a quantidade de produto que está sendo produzido. Por isso, a PCR em
10 Técnicas básicas em biologia molecular

tempo real muitas vezes é chamado de PCR quantitativo (qPCR). Além disso,
como essa técnica mede a amplificação do DNA em tempo real, é possível
acompanhar a amplificação a cada ciclo (CLARK; PAZDERNIK, 2012).

Primer

DNA-alvo

hv
Primer

Rodar
Sonda
PCR
hv

Novo DNA Taq polimerase

Alongamento hv

Flourescência
liberada

Sonda de DNA
degradada pela
Taq

Figura 3. PCR em tempo real. A sonda fluorescente hibridiza

com a sequência-alvo. Ao encontrar a sonda, a Taq polimerase
degrada os DNA da sonda, liberando o fluoróforo, o qual irá
emitir a fluorescência.
Fonte: adaptada de Clark e Pazdernik (2012, p. 184).
 Técnicas básicas em biologia molecular 11

Importância e aplicação
As técnicas de PCR são muito utilizadas na biologia molecular e nas ciências
forenses. Primeiramente, a PCR permite o isolamento de fragmentos de DNA pela
amplificação de regiões específicas. Assim, a PCR tradicional é muito utilizada
como um primeiro passo de diversas técnicas, visto que a partir de uma pequena
quantidade de DNA podem ser obtidas quantidades maiores. Algumas das técnicas
que utilizam a PCR tradicional para a amplificação do material são o sequencia-
mento, a genotipagem e a clonagem (THERMO FISHER SCIENTIFIC, [201-?]).
Além disso, a PCR tradicional pode ser utilizada nas ciências forenses, em testes
de paternidade e na impressão digital de DNA. A PCR em tempo real, por outro
lado, apresenta resultados quantitativos, sendo um método com maior precisão
e sensibilidade. Essa técnica é muito utilizada para a quantificação da expressão
gênica, detecção de patógenos, genotipagem de polimorfismos de nucleotídeo
único (SNPs), análise de variação no número de cópias, análises de microRNA e
quantificação viral (THERMO FISHER SCIENTIFIC, [201-?]).

A impressão digital de DNA pode ser realizada tanto pela

PCR quanto pelo Southern blot. O Southern blot, entre-
tanto, é mais trabalhoso e requer grandes quantidades
de DNA. No vídeo a seguir, você pode ver como funciona
a impressão digital de DNA.

https://goo.gl/L7cE9i

ALBERTS, B. et al. Biologia molecular da célula. 6. ed. Porto Alegre: Artmed, 2017.
CLARK, D. P.; PAZDERNIK, N. J. Molecular biology. 2nd ed. Amsterdam: Elsevier, 2012.
DURAND, G. M.; ZUKIN, R. S. Developmental regulation of mRNAs encoding rat brain
kainate/ampa receptors: a northern analysis study. Journal of Neurochemistry, v. 61,
n. 6, p. 2239–2246, 1993.
12 Técnicas básicas em biologia molecular

KHAN ACADEMY. Polymerase chain reaction (PCR). c2018. Disponível em: <https://
www.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna-sequencing-
-pcr-electrophoresis/a/polymerase-chain-reaction-pcr>. Acesso em: 15 abr. 2018.
MAHMOOD, T.; YANG, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting.
North American Journal of Medical Sciences, v. 4, n. 9, p. 429-434, 2012.
NELSON, D. L.; COX, M. M. Lehninger principles of biochemistry. 4th ed. New York: W.
H. Freeman, 2005.
STREIT, S. et al. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in
pancreatic cancer cells and tissues. Nature Protocols, v. 4, n. 1, p. 37-43, 2009.
THERMO FISHER SCIENTIFIC. Real-time vs. digital PCR vs. traditional PCR. [201-?]. Disponí-
vel em: <https://www.thermofisher.com/br/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/
real-time-pcr-learning-center/real-time-pcr-basics/real-time-vs-digital-vs-traditional-
-pcr.html>. Acesso em: 15 abr. 2018.

Leitura recomendada
EXPLICAÊ. Biologia: biotecnologia: teste de DNA: DNA fingerprint. YouTube, 9 jul.
2017. Disponível em: <https://www.youtube.com/watch?v=TuzeOv4zqX0>. Acesso
em: 15 abr. 2018
 Encerra aqui o trecho do livro disponibilizado para
esta Unidade de Aprendizagem. Na Biblioteca Virtual
da Instituição, você encontra a obra na íntegra.
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