Dicroísmo Circular

Yraima Cordeiro
Departamentos de Fármacos Faculdade de Farmácia UFRJ

Yraima Cordeiro

DICROÍSMO CIRCULAR DE PROTEÍNAS

Yraima Cordeiro Dicroísmo Circular é a medida da absorbância diferencial entre as duas rotações de luz circularmente polarizada por uma molécula assimétrica.

Dicroísmo Circular de Proteínas

Elliptical polarized light (purple) is composed of unequal contributions of right (blue) and left (red) circular polarized light. Eric Y. Hayden

CD gera luz elipticamente polarizada

Yraima Cordeiro

= eixo menor(b)/eixo maior (a)

ER e EL, magnitudes dos vetores elétricos da luz circularizada para a direita e para a esquerda, respectivamente; Quando ER = EL, θ é 0° luz linearmente polarizada; luz circularmente polarizada. Quando ER ou EL = 0, θ é 45°

O efeito de CD é geralmente pequeno, então a tanθ é pequena e pode ser aproximada de Dessa forma a elipcicidade é diretamente proporcional ao CD. θ em radianos.

Luz linearmente x circularmente polarizada Yraima Cordeiro Circular Linear .

Anal. 2411 ε (280.Yraima Cordeiro Um pouco de espectroscopia aplicada a sistemas biológicos Determinação de Concentração de Proteínas 1) Bradford (1976) Comassie blue 2) Lowry (1951) Cu2+ Ensaios colorimétricos 3) Coeficiente de Extinção Molar @ 6. Protein Science. 4.Pace et al. 1995.c. 1948.l .0 M GdmHCl/H2O . M-1 cm-1) = (#Trp)(5. 1967. Biochem. 1812.490) + (#Cistina)(125) ..500) + (#Tyr)(1. água. 319 . Aλ = ε. Biochemistry 6.Edelhoch. 1989.Gill & von Hippel.

G.D.cm2dmol-1 (εL. moles.. Circular Dichroism and the Confromational Analysis of Biomolecules (1996) Plenum Press. Hecht. .εR) em M-1cm-1 Importante: especificar a notação utilizada! Fasman. New York. Massachusetts. Yraima Cordeiro Ou medir a elipcicidade → pode ser usada como medida pois a luz plano polarizada se torna elipticamente polarizada após passar através de um meio opticamente ativo..Expressão do CD Diferença de absorbância dos dois componentes (lcp e rcp). centímetros C. Optics 3rd Edition (1998) Addison Wesley Longman. Relação entre elipcicidade molar e ∆ε εL – εR = (AL– AR)/(lC) [θ](λ) = 100θ(λ)/(lC) l.L-1 Elipcicidade molar por resíduo Dimensões: [θ] em deg. E.

29578 deg .exp(-Ar/2)]/[exp(-Al/2) + exp(-Ar/2)] Yraima Cordeiro Convertendo para deg.Relação elipcicidade vs CD θ = elipcicidade θ (rad) ≈ tan θ = (|El| –|Er |)/ (|El|+|Er |) = [exp(-Al/2) . θ(deg) = 180 x ln 10 x ∆A/4π = 32.98 ∆A Elipcicidade é diretamente proporcional ao CD 1 rad = 57.

98 mA*0.298*M) mo*M/ (C*l*32980) [θ]/3298 mo/1000 [θ]*C*l/ (100*M) mo [θ]*C*L*10/ (M) mo*M/(10*l*C) [θ] .98 Milli absorbance A*1000 mA ε*C*l*1000/M o/0.98) Degrees A*32.98 [θ]*C*l/ (3.Yraima Cordeiro Unidades Dicroísmo Circular From to → (A) (mA) (ε) (o) (mo) [θ] Absorbance A mA/1000 ε*C*l/M o/32.03298 ε*C*l*32.298/ (l*C) ε*3298 o*M*100/(l*C) mo/32980 [θ]*C*l/ (3298*M) mo/32.03298 Molar Extinction A*M/(C*l) A*M/(C*l*1000) ε o*M/(C*l*32.98 ε*C*l*32980/ M o*1000 Molar ellipticity A*M*3298/ (l*C) mA*M*3.98/ M o Millidegrees A*32980 mA*32.

Instrumentação Yraima Cordeiro .

Geração de luz circularmente polarizada a partir de feixes lineares Geração de luz elipticamente polarizada a partir de feixes circulares .Relação entre luz linearmente x luz circularmente polarizada Yraima Cordeiro Vetor elétrico da luz linearmente polarizada – soma de luz rcp e lcp de = magnitude.

Yraima Cordeiro Equipamentos atuais de CD: modulam a luz entre as 2 rotações e medem a ≠ de absorbância a cada λ.jpg . ∆A = log (IO/IL) .protein.iastate.edu/images/cd_fig1.log(IO/IR) = log(IR/IL) www.

. Monocromador prismático para dispersão da luz em diferentes comprimentos de onda. Detecção – tubo fotomultiplicador. Modulador fotoelástico – gera luz circularmente polarizada.Instrumentação Yraima Cordeiro Jasco J-810 Fonte de luz: lampada de xenônio 150w (180 a 800nm). Permite quantificação da luz rcp e lcp.

. Banho térmico. • Absorção de UV pelo oxigênio.Equipamentos atuais Yraima Cordeiro • Jasco. proteção do usuário. photophysics (Chirascan). do monocromador e da amostra. • Ozônio: degradação da óptica. Stopped flow → cinética rápida. • Nitrogênio: remoção de oxigênio dos compartimentos da lâmpada. .. Acessório Peltier (0 a 100oC).

Calibração • Ácido d-10-canforsulfônico Yraima Cordeiro .

Yraima Cordeiro Concentração da amostra A intensidade do CD é proporcional a concentração da espécie ativa. esta absorbância é alcançada com concentração protéica de 0. ↑ a concentração? ↑ a absorção – redução na quantidade de luz que chega nos detectores.89 Para uma cubeta com 1mm de caminho óptico.↑ do ruído.1 a 0. ↑ Voltagem do PMT . . Absorbância ótima para medidas de CD: Abs = 0.3 mg/mL.

3 ~0.0 → amostra + solvente + cubeta Abs amostra normalmente válida → 0.9 Johnson.Relação sinal/ruído em função da absorção da amostra Yraima Cordeiro Solvente também absorve! Abs máxima a 1. 1985 .

l .00 cm → quantidade de amostra (~ 3mL) 1.0 mm → 200 a 300µL 0.1 mm → ~ 50µL (outro suporte necessário) Yraima Cordeiro A concentração ótima protéica depende do caminho óptico da cubeta utilizada Aλ = ε.Cubetas • Caminho óptico: 1.c.

15M NaNO3 0.15M Phosphate 100mM Tris 100mM Pipes 100mM Mes 100mM GdnHCl 4M Urea 4M 191 196 <185 245 <185 195 215 205 210 210 .15M NaClO4 0.15M NaCl 0.Yraima Cordeiro Importância da escolha do tampão Solvent system Cut off (nm) for 1mm path length Solvent system Cut off (nm) for 1mm path length Water Trifluoroethanol Hexafluoroisopropanol Acetonitrile Methanol Ethanol 2-Propanol Cyclohexane Dioxane < 185 <185 <185 185 195 196 196 <185 232 (NH4)2SO4 0.

Yraima Cordeiro Determinação da estrutura secundária de proteínas por CD .

Estrutura secundária de proteínas Ângulos de torção em proteínas phi φ α β P2 -57º -120º -78º psi ψ -47o +120o +150º Yraima Cordeiro .

perpendicular ao eixo da hélice.de/bednarski_. → Yraima Cordeiro pharm1.210 nm).. π→ π* (~208 . paralela ao eixo da hélice.pharmazie. fraca.Transição Alfa-hélice: π→ π* (~191 – 193 nm). n→ π* (~ 222 nm).uni-greifswald. paralela ao eixo da hélice. . Forte..

n→ π* (~ 210 .gif .200 nm). → Yraima Cordeiro http://www.uoguelph.ca/educmat/phy456/gif/sheet1.chembio.225 nm).Transição folha−β: − π→ π* (~190 .

Yraima Cordeiro .

Yraima Cordeiro .

1985. .E proteínas em random coil? Yraima Cordeiro Poly(Pro)II CD de peptídeos desordenados Johnson.

Proteínas desordenadas Poliprolina (PII) Yraima Cordeiro .

Efeito do solvente sobre estrutura secundária de proteínas e peptídeos Yraima Cordeiro .

Estabilidade térmica de ptns avaliada por CD Yraima Cordeiro Reversibilidade? .

4 0.CD – monitorar transições induzidas por temperatura e agentes desnaturantes.0 Guanidine hydrochloride [M] 20 30 40 50 60 70 80 Temperature (oC) Efeito de agentes químicos e do incremento de temperatura nas construções da rPrP rPrP23-231 rPrPD51-90 rPrPD32-121 .8 0.6 0. 1.4 0.6 0.8 0. Pressão → não é possível.0 B 1.2 Yraima Cordeiro 1.0 B Fraction aggregated (f) f (fraction denatured) 0.2 rPrP23-231 rPrP∆51-90 rPrP∆32-121 0.0 0 2 4 6 8 0.2 0.

Enovelamento protéico Intermediários do enovelamento Yraima Cordeiro .

7.5 (dots). The solid line in panel C is a fit to eq 1 and gives an apparent pKa of 3. and pH 2 (triangle)..Yraima Cordeiro Detecção de intermediários de enovelamento 230 nm pH 7.5. The solid line in panel B is a fit to eq 2 and gives apparent pKas of 6. Panel A: spectra at pH 7.5 pH 2 pH 5 216 nm Far-UV CD spectra of SMA (amyloidogenic light chain variable domain) as a function of pH.3 and 3. pH 5 (square). Khurana et al. Biochem 2001 .

7 µM. respectively. 2006 . Concentration of gp120: 3.. 10. as indicated in the figure. Biol.Monitorar interação proteína-ligante → Muda Estabilidade? Muda Estrutura? Thermodynamics of Binding of a Low-Molecular-Weight CD4 Mimetic to HIV-1 gp120 20 Yraima Cordeiro C Raw Ellipticity (mdeg) 10 Interação ptn:DNA β 0 -10 -20 α 200 210 220 230 240 250 260 CD spectra of gp120 alone and in the presence of NBD556. 2001 Schön et al. 5.. J. and 300 µM for curves 1-5. The concentrations of NBD-556 were 0. 190 Wavelength (nm) Cordeiro et al. Biochem. Chem. 20.

Chem.ligante 15 Yraima Cordeiro Elipticidade Bruta (mgrau) 10 5 0 -5 -10 200 220 240 260 280 300 320 Comprimento de Onda (nm) • PrP23-231 • N2aRNA • [PrP23-231 + N2aRNA] • [PrP23-231] + [N2aRNA] Gomes et al. 2008. . J.Interação proteína . Biol.

interação com ligantes. Intensidade das bandas de CD ~1 ordem de magnitude < far-UV. Maior quantidade de proteína necessária. Avaliação de intermediários da via de enovelamento. pontes de enxofre.Near – UV: 250 → 330 nm Informação sobre aminoácidos aromáticos. Yraima Cordeiro .

. which correspond to formation of IU.Near-UV – análise de estrutura terciária Yraima Cordeiro Resíduos aromáticos pH 2. yielding apparent pKas of 3. Panel A shows plots of molar ellipticity for pH 7. Protein concentration was 0. The lines through the data are fits to eq 1 for peaks at 296 and 287 nm.5.7.2 and 3.7 mg/mL. and pH 2.9 and 3. The data at 268 nm are fitted to eq 2.4. Panel B shows the pH dependence of the molar ellipticity. resulting in two apparent pKa values of pH 4. pH 5. respectively.0 296 nm 268 nm 287 nm Near-UV CD spectra for SMA.

Yraima Cordeiro Estimar conteúdo de estrutura secundária de ptns a partir do espectro de CD: Processo empírico → não há solução única para a deconvolução de um espectro de CD Levar em consideração seguintes fatores: A estrutura 3D obtida por difração de raios-X de proteínas de referência é mantida em solução aquosa. As contribuições dos elementos individuais de estrutura secundária para o espectro total de CD são aditivas e o efeito da estrutura terciária no espectro (Far-UV) é desprezível. Cada elemento estrutural (como α-hélice ou folha-β) pode ser descrito como um espectro de CD único e o efeito de variabilidade geométrica de elementos de estrutura secundária é desprezível. Somente cromóforos peptídicos são responsáveis pelo espectro de Far-UV e contribuições de outros peptídeos podem ser descartadas. .

Yraima Cordeiro Princípios gerais dos métodos disponíveis S(λ) = espectro de CD de uma ptn. número de estruturas secundárias e fk é a fração da estrutura secundária de k Os espectros base Bk(λ) são calculados a partir de espectros de CD λ de um grupo de proteínas de referência com estrutura 3D conhecida. Bk(λ): Onde N. Analisado como combinação linear de k espectros base. .

fβ)]Cptn.C2 + . kλn. fração de estrutura secundária ∆Aλ = Σ[(kαλ.Simplificando ∆Aλ = Σ ∆A1λ + ∆A2λ + ..Cn Yraima Cordeiro ∆Aλ = Σ(k1λ..C1 + k2λ.l . ∆Anλ ∆Anλ = knλ.l..Cn)l f.fα) + (kβλ..

coeficiente de correlação σ. rms deviation xi e yi. frações de estrutura secundária derivadas de análise de raios-x e calculadas a partir do espectro de CD. número de proteínas de referência utilizado.r. n. Yraima Cordeiro .

Procedimento matemático espectro de CD. a natureza e número de proteínas escolhidas e a faixa de comprimento de onda do espectro de CD. ex.Cálculo do conteúdo de estrutura secundária e comparação entre diferentes métodos Dependerá: Escolha do espectro de CD de proteínas de referência. para deconvolução do Yraima Cordeiro . Assinalamento da estrutura secundária de proteínas de referência a partir de estudos de difração de raios-X.

• Assinalamento da estrutura secundária a partir dos dados de difração. Correlação entre estimativas de CD e x-ray para folhas-β e β-turns depende de: • Escolha dos polipeptídeos ou ptns de referência. Predomínio do sinal em α-hélice. . Intensidades menores de folhas-β do que α-hélices em espectros de CD.Estimativas Yraima Cordeiro Boas para α-hélices. • Número de proteínas selecionadas.

. Estruturas resolvidas por ressonância magnética nuclear. Yraima Cordeiro Estrutura cristalina ≠ estrutura em solução.Atualmente Melhor banco de dados.

estabilidade e atividade enzimática. Yraima Cordeiro . Base para desenho de enzimas modificadas com características específicas para desempenhar funções existentes ou para novas aplicações. Mutações sítio – dirigidas: efeitos na estrutura.CD na engenharia de proteínas e peptídeos Desenho de variantes enzimáticos. Estudo de relação estrutura – atividade.

Técnica validada. Yraima Cordeiro . Pequena quantidade de material necessária para efetuar as medidas.Vantagens da técnica Ótima para estudo de estrutura secundária de biopolímeros em solução. Técnica não destrutiva. Medidas rápidas. Aplicada a moléculas em solução.

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